Метаболомики Анализ мозга крысы путем высокого разрешения ядерной магнитно-резонансной спектроскопии тканевых экстрактах

Резюме

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Аннотация

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Введение

Мышиные модели были использованы широко в исследовании мозга ^1. Генотип-фенотипа были исследованы в мышей и крыс мозга при изучении генной экспрессии в РНК и / или уровней белка, с одной стороны, и морфологические, функциональные, электрофизиологические и / или поведенческие фенотипы с другой ^2-6. Однако, чтобы полностью понять механизмы, связывающие фенотип генотипа, необходимо исследовать молекулярные события после экспрессии белка, т.е.. Метаболизм биохимических субстратов, на которых ферменты действуют ^7. Это требование привело, в течение последних 10 до 15 лет, к возрождению метаболического исследования во многих отраслях биологии ^8,9. В то время как классические метаболические исследования часто были сосредоточены на деталях конкретных путей, новый метаболомики подход ориентирован на всеохватывающей исследования глобального метаболического профиля ткани рассматриваемой.Одним из следствий этой концепции является очевидная потребность в аналитических инструментов, которые минимизируют уклон в сторону конкретных метаболических путей и / или классов соединений. Тем не менее, классические биохимические анализ основан на определенной химической реакции конкретного анализируемого вещества, которое должно быть указано до того, как анализ проводят. Напротив, спектроскопические методы, такие как ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (MS) (я) основаны на конкретных молекулярных (физических) свойств биохимических соединений, каждое из которых порождает одного или нескольких различных сигналов в спектре обнаружены в ходе одного эксперимента; и (II) обнаруживает большое количество различных соединений в эксперименте.

Таким образом, каждый спектр содержит комбинированную информацию целого ряда метаболитов. По этой причине, спектроскопические методы адекватные средства для метаболомики, а не до выбора не должно быть сделано в отношении природы аналита, подлежащего измерению ⁸ . Как следствие, эти методы, естественно, поддаются поисковых исследований, потому что они значительно облегчит обнаружение неожиданных метаболических изменений.

Хотя ЯМР-спектроскопии и масс могут быть использованы как взаимозаменяемые для анализа многих метаболитов, каждый метод обладает специфическими преимуществами и недостатками, которые недавно были рассмотрены ^10. Вкратце, ЯМР-спектроскопии, как правило, могут быть выполнены из неочищенных экстрактов и не требует хроматографического разделения образцов соединений перед анализом. Напротив, MS работает с газовой или жидкостной хроматографии (ГХ или ЖХ) разделения, для конкретных недавних событиях, таких как изображения масс-спектрометрии исключением. В нескольких особых случаях, таких как анализ сахара, разделение LC может стать необходимостью для ЯМР-спектроскопии, а также, потому что резонансные линии различных сахаров значительно перекрываются в протон ^(1Н) спектров ЯМР. Тем не менее, ¹ Н ЯМР-спектроскопии без CHRomatographic разделение остается самым популярным, почти повсеместно прикладное метод метаболомики ЯМР. Как правило, подготовка образца является более трудоемким и сложным для MS, чем для ЯМР-спектроскопии. Серьезные проблемы, связанные с матричных эффектов гораздо менее распространены в ЯМР-спектроскопии, чем в MS, где они могут привести к значительно ослабленных сигналов. Метаболит количественный может быть достигнуто при любом способе. Тем не менее, несколько стандартных соединений, необходимых для MS вследствие различий в матричных эффектов и эффективности ионизации между метаболитов. В противоположность этому, только один стандарт на образец необходим для ЯМР спектроскопического анализа, потому что при соответствующих условиях измерения, последний способ является внутренне количественные благодаря строго линейного отклика ЯМР на наблюдаемых ядер. Основным недостатком ЯМР является его относительно низкая чувствительность. MS, в частности LC-MS, является более чувствительным, чем ЯМР на несколько порядков; По этой причине, МС должна быть более предпочтительным, чем ЯМР дляАнализ соединений, возникающих при очень низких концентрациях. С другой стороны, неразрушающего характер эксперимента ЯМР является явным преимуществом по сравнению с МС; таким образом, ЯМР может быть выполнена повторно на том же образце, например, для разных ЯМР-активных ядер, таких как ¹ H, фосфор-31 ⁽³¹ P), углерод-13 ^(13С), фтор-19 ⁽¹⁹ F) и т.д.., а материал не потребляется ЯМР, в отличие от измерений МС.

Оба ЯМР и МС могут быть использованы в различных режимах, каждый из которых является оптимальным для выявления соединений с конкретными химическими характеристиками. Например, ³¹ P ЯМР часто лучше подходит, чем ¹ Н ЯМР для анализа умеренно концентрированных фосфорилированных соединений, хотя почти все фосфорилированные метаболиты также содержат протоны. Тем не менее, их сигналы ^{1Н ЯМР} может маскироваться ¹ сигналов ЯМР H от других, не фосфорилированными соединений, в то время как последнийочевидно, не вызывают фоновые сигналы в ³¹ спектров ЯМР Р. В аналоговой ситуации, ^{19-ЯМР-анализ} F является предпочтительным для фторированных соединений, например, фторированных препаратов (не фоновых сигналов от эндогенных метаболитов), в то время как частный случай ¹³ С ЯМР представляет интерес почти исключительно, если судьба ¹³ С- меченые экзогенные метаболические предшественники должна быть дополнена, в связи с крайне низким естественным изобилием ¹³ С изотопом (около 1%). Многие масс-спектрометры работают в любом отрицательном режиме ионного или режиме положительных ионов. Таким образом, важно знать заранее, анализа ли ионы, которые должны соблюдаться отрицательно или положительно заряженные. Мы сосредоточимся на протокол для анализа мозговой ткани метаболом по ¹ H и ³¹ P ЯМР-спектроскопии, потому что этот метод дает большое количество важных концентрации метаболитов при низкой стоимости в терминах (I) время, необходимое для пробоподготовки ай (II) усилие, необходимое для количественного определения метаболита. Все эксперименты могут быть выполнены с использованием оборудования стандартной влажной химической лаборатории и высокого разрешения ЯМР спектроскопии центр. Дополнительные требования описаны в разделе протокола ниже.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: ANIMAL ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ
Исследования на животных на крысах в соответствии с руководящими действительные во Франции, и они были одобрены местным комитетом по этике (# 40.04, Университет Экс-Марсель медицинской школы, Марсель, Франция) по.

1 Сбор и замораживание мозга крысы

1. Подготовьте компоненты требуются: жидкий азот (N _2liq.) В сосуд Дьюара, что является достаточно большим, чтобы держать зажим замерзания (по крайней мере, 2-3 громкости L); анестетик (например, ИФ, или кетамин / ксилазина); анестезия камера; стерильные инструменты рассечение: хирургические ножницы, скальпель, пинцет; тканевые салфетки и бутылка с чистки спирт (этанол); иглы (25 G); 1 мл и 10 мл шприцев. Этикетка алюминиевые листы (около 10 х 10 см) с клейкой лентой. Используйте листы обернуть отдельные зафиксированные-зажаты крыс мозги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с жидким азотом всегда надевайте защитные перчатки и очки защиты глаз или маску!
2. Заполните Дьюара с N _2liq., И разместить бесплатноЗин зажим в сосуд Дьюара. Убедитесь, что количество N _2liq в сосуде Дьюара достаточно для повторных процедур замораживания-зажим (несколько литров; количество N _2liq испаряющейся в течение каждого сублимационной зажима зависит от размера зажима).
3. Обезболить животного (например, по изофлураном или внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина смеси). Перейдите к эвтаназии путем сердечной пункции для предотвращения кровотечения, когда кожа головы удаляется и череп открыт. Шаги 1.4-1.7 ниже описания этого стандартную процедуру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В особых протоколов, требующих максимально сохранить глюкозы и высоких энергий метаболитов, жертву крысы по воронке-морозильной мозг анестезированной животного с N _2liq ¹¹ после втягивания кожи головы. Тогда, препарировать мозг из черепа с переменной N _2liq минимизировать посмертную метаболизм ^12.
4. Смочите голову крысы с очистки спирта. Используйте хирургические ножницы в (I) бэрОве головы, и (II) с открытым черепа вдоль черепных швов.
5. Используйте пинцет, чтобы открыть череп дальше, и, чтобы удалить весь мозг из под открытым черепа, позиционирования головки с ног на голову. Удалить быстро видимых следов крови, используя ткани салфетки. Если полушарий мозга метаболически и морфологически симметрично, то удобно использовать один из полушарий метаболического анализа после отделения его от другого полушария надреза скальпелем. При необходимости, использовать оставшееся полушарие для других исследований мозга, таких как гистологии.
6. Быстро удалить замораживания зажим с N _2liq наполнением Дьюара, разместить весь или половину мозг крысы на одной внутренней поверхности, зажима и сразу вставить замораживания зажим в N _2liq наполнением Дьюара, удерживая зажим прочно сжаты. Убедитесь, что шаги 1.3-1.6 занимать не более 60 сек.
7. После 1-2 мин удалить морозильной клеммы из Дьюара, открытой зажим, ослабить замороженные ткани мозга от зажима и обертываниезамороженной ткани в соответствующей маркировкой алюминиевого листа (см 1,1 выше). Убедитесь, что этикетка является четким и остается твердо на месте после того, как образец завернут. Быстро разместить завернутый образец в N _2liq. Выполните всю процедуру как можно быстрее, чтобы избежать размораживания замороженных тканях головного мозга.
8. Хранить замороженный образец в N _2liq или в морозильной камере при -80 ° С до экстракции метаболитов.
   Примечание: Всякий раз, когда биологический образец должен быть сохранен в течение более чем одного года, хранение при температуре _2liq N должно быть более предпочтительным, чем -80 ° C. Это также относится к оставшейся части этого протокола.

2 Получение процедуры экстракции метаболитов

1. Подготовка ткани гомогенизатора и сопоставления пробирки (например, 10 мм внутренний диаметр, в зависимости от диаметра вала гомогенизатор; как правило, сделаны из пластмассы). Используйте электрические гомогенизаторы, а не управляемые вручную гомогенизаторы (тканевые шлифовальные). Preсрезать Вортекс и лабораторных весов.
2. Подготовьте ведро с колотым льдом. Держите достаточные quantitites метанола, хлороформа и воды на льду (4 мл каждого за 250-350 мг замороженные ткани мозга).
3. Подготовьте передачи пипетки и флаконов.
   1. Подготовить стеклянные флаконы (≥20 громкости мл) с винтовой крышкой и место на льду (один флакон за экстракт ткани). Fit винт крышки с тефлоновым перегородками, стойкой к хлороформом.
   2. Подготовка 5 мл пластиковых пипеток для дозирования метанол и воду, и стеклянные пипетки или шприцы Hamilton для дозирования хлороформ. Подготовьте дополнительные пластиковые пипетки (5 или 10 мл объема) для передачи смеси гомогената ткани и метанола.
   3. Убедитесь, что все изделия из стекла тщательно промывают дистиллированной водой и тщательно высушивают перед использованием, чтобы удалить следы примесей, в частности ЯМР-обнаруживаемый формиат и ацетат.
4. Заполните фарфоровой ступке с N _2liq, место фарфорового пестика в раствор и залейте N _{2 л}IQ. Азот будет испаряться, пока температура ступки и пестика не станет достаточно низкой. Держите небольшое количество N _2liq в ступке.

3 Добыча метаболитов

1. Удалить замороженный образец мозговую ткань от хранения (N _2liq танка или -80 ° C морозильник). Затем сразу же перенести образец ткани на минометный частично заполнена N _2liq.
2. Используйте русской _2liq Холодная пестик сломать замороженные ткани мозга на более мелкие куски, которые легко вписываются в пробирках, используемых для ткани гомогенизации. Чтобы предотвратить кусочки замороженной ткани с проецируются из раствора в процессе, разбить ткани в то же время заворачивали в алюминиевую листа. Не молоть замороженной ткани в порошок, так как это сделает трансфер в пробирке сложнее (увеличивается риск конденсации воды). ВАЖНО: На протяжении всей процедуры, добавить N _2liq на минометный мере необходимости держать образец глубокой заморозке.
3. Mix сторговый центр куски замороженного мозговой ткани тщательно взвесить 250-350 мг и перенести в пробирку, наполненную ледяной метаноле (4 мл на 250-350 мг ткани головного мозга). Каждый раз, когда кусочки замороженной ткани добавляются, гомогенизации них сразу с гомогенизаторе тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю процедуру быстро, чтобы избежать (I) значительное конденсации воды на образце, которые привели бы к завышению веса образца, и (II) отопления и оттаивания образцов. Отдельные куски ткани должны быть в замороженном состоянии в начале процесса гомогенизации.
4. После того, как последний фрагмент из замороженного образца головного мозга крысы была добавлена ​​в пробирку и гомогенизируют, перевод гомогената к ≥20 мл стеклянный флакон объемом, близко винтовой крышкой и выдержать на льду в течение 15 мин. Если объем в пробирке не является достаточно большим для ≥4 мл метанола, использовать меньший объем метанола для гомогенизации часть замороженных ткани головного мозга, передавать смеси достеклянный пузырек и продолжить гомогенизации части остаточных тканей свежим метанолом. Убедитесь, что общий объем метанола составляет 4 мл на 250-350 мг ткани мозга.
5. Добавить такой же объем охлажденного льдом хлороформе (то есть, 4 мл на 250-350 мг ткани головного мозга) в гомогенате, вихря тщательно и оставьте на льду в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с летучими растворителями, в частности хлороформ Всегда используйте проветриваемом химической капот!
6. Добавить такой же объем воды (то есть, 4 мл на 250-350 мг ткани головного мозга) в гомогенате, вихря тщательно и выдержать при -20 ° С в течение ночи.

4 Получение расслоению, и испарения растворителя

1. Подготовьте холодный центрифуги (4 ° C, 13000 XG на максимальном вылете) и центрифужные пробирки. Убедитесь, что последние являются ≥20 объем мл, устойчивы к хлороформом, и может выдерживать центробежные силы 13000 х г. Используйте специальные стекла с пробирками, но промыть (как и все стеклянной посуде) с дистиллированной водой бытьпередние использование (см 2.3).
2. Подготовить тщательно промыть стекло пипетки Пастера и соответствующий propipettor (лампа, ручной пипетки насос, автоматический пипетки аппарата / пипетки и т.д..).
3. Приготовьте два дополнительных тщательно промыть трубы (≥15 громкости мл) на образец мозга, один из которых должен быть устойчив к хлороформом (из стекла или тефлона), другую к метанола (из пластика, устойчивого к метанол, или стекла).
4. Подготовьте испарения аппарат растворителя (имеющийся в продаже или самодельных). Убедитесь, что это устройство обеспечивает точно контролируемый поток сухого газа азота, который направлен на поверхность раствора экстракта, содержащего летучие растворители (метанол, хлороформ).
5. Приготовьте два дополнительных лотков или ведра, наполненные льдом: один для образца на лед, а другая служит для хранение проб холодные в процессе испарения.
6. Подготовка лиофилизатор (лиофильной сушки) и материалы, необходимые для лиофилизации: (I) один 50мл центрифужную пробирку или вакуум круглодонную колбу в экстракте, и (II) N _2liq заморозить водную фазу выборок (L ≤0.3 на образец). При использовании центрифужную пробирку, также готовят широкий шеи вакуум-фильтра бутылку, подходящий для лиофилизации.

5 Разделение фаз и испарения растворителя

1. Для полного разделения фаз, передавать тканевого гомогената метанол / хлороформ / вода / мозга (смотри 3,6) в хлороформе устойчивостью центрифужную пробирку (объем ≥20 мл) и центрифугируют при 13000 х г и 4 ° С в течение 40 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Две фазы будет формировать, разделенных слоем осажденного белка. Нижний (тяжелее) фаза состоит из метанола, хлороформа и растворенных липидов, в то время как верхняя (зажигалки) фаза состоит из воды, метанола и растворенных водорастворимых метаболитов.
2. С помощью пипетки Пастера перенести верхнюю фазу в соответствующем ≥15 мл пробирку (пластик устойчив к метанол или стекло). Держите на Iсе.
3. С помощью пипетки Пастера свежий передавать нижней фазы в соответствующую пробирку ≥15 мл (стекло или тефлона). Держите на льду.
4. Хранить слой осажденного белка при -80 ° С, если это будет использоваться для определения общего белка; либо отказаться.
5. Хранить трубку с фазой вода / метанол (5,2 см) на льду и выпаривают метанол, направляя потоке сухого азота на поверхность раствора экстракта. С другой стороны, плавно пузырьков азота через предназначенную для раствора экстракта. не Завершить процесс испарения при пропускании азота больше не вызывает уменьшение объема в раствор экстракта. В это время, по-прежнему с лиофилизации (см 5.7), или заморозить и держать образец при -80 ° С с трубка закрыта (винтовой крышкой или Парафильмом) до готовности к лиофилизации.
6. Поместите пробирку с фазой метанол / хлороформ (см 5.3) на льду и испаряются метанол, направляя сухой потока азота на суrface из раствора экстракта. При упаривают весь растворитель, завершить процесс, а не держать образец при -80 ° С с трубка закрыта (винтовой крышкой или Парафильмом) до готовности к ЯМР-анализа.
7. Готовят водную фазу для лиофилизации
   1. После окончания процесса испарения метанола (5,5 см), переноса образца в тщательно промывают 50 мл центрифужную пробирку (если образец замораживают, оттепели до передачи). В качестве альтернативы, передача в вакууме круглодонную колбу.
   2. Замораживание раствора экстракта путем поворота центрифужную пробирку (или круглодонную колбу), частично вставленной в N _2liq таким образом, что внутренняя поверхность трубки или колбе постепенно покрывается замороженной жидкостью. Убедитесь, что нет N _2liq. Может войти в сосуд.
   3. Когда вся жидкость замерзает, покрыть трубу с проколотой крышкой или крышкой, чтобы пар бежать, и поместить трубку в широкоэкранном шеи вакуум-фильтре бутылки.
   4. Начните лиофилизации после аттацзин колбу или бутылку с сублимационной сушилке.
8. Завершение процесса лиофилизации, когда образец является совершенно сухой. Хранить образца при -80 ° С в закрытой трубке (с плотной крышкой!), Пока не использовали для анализа ЯМР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно не более 24 часа в сутки, необходимых для лиофилизации. Несколько образцов может быть лиофилизировали одновременно, в зависимости от конструкции лиофилизатор, и от того, используются в центрифужные пробирки с широким шеи бутылки или круглодонных колб.

6 Получение образцов ЯМР

1. Магазин сушат и лиофилизированные экстракты при очень низкой температуре (≤ -80 ° С). Re-растворить лиофилизатов для подготовки проб ЯМР непосредственно перед экспериментом ЯМР.
   Примечание: Хранение образцов в растворе и / или близкой к комнатной температуре может привести к деградации образца!
2. Готовят водную 200 мМ раствора хелатирующего агента, транс-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic кислоты (CDTA), следующим образом:
   1. Добавить чистую воду (например, 20 мл) в пробирке или центрифужную пробирку, и добавить количество CDTA порошка, необходимого для генерации решение 200 мм.
      Примечание: Значительная часть CDTA не будет растворимым, так как рН очень низка, так как кислота CDTA форма была использована вместо соли CDTA.
   2. Осторожно добавить, шаг за шагом, все большее количество CsOH порошка в раствор CDTA, и вихрь тщательно после каждого добавления.
      Примечание: растворимая фракция CDTA будет возрастать с увеличением содержания CsOH в водном растворе. Избежать "overtitration", т.е. добавить меньше, чем стехиометрическое количество CsOH к решению CDTA.
   3. Когда почти весь порошок CDTA растворяется, начать измерения рН после каждого добавления CsOH и тщательного встряхивания. Завершить CsOH дополнение, когда конечный рН достигается (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В это время, все CDTA будет распущен. Использование Cs ⁺ в качестве противоиона к CDTA является Generсоюзником предпочтительнее Na ⁺ или K ^+. Cs ⁺ является мягкая кислота Льюиса за большим ионным радиусом, в отличие от Na ⁺ и K ^+, которые имеют меньшие ионные радиусы и твердые кислоты. Следовательно, Cs ⁺ образует комплексы с фосфатами (жестких баз) меньше степени, чем Na ⁺ и K ^+. Это выгодно в течение ³¹ P ЯМР-спектроскопии фосфорилированных метаболитов, потому что комплексообразование приводит к увеличению ширины линий ЯМР, в частности, в условиях медленно промежуточного ионного обмена.
3. Для ³¹ P ЯМР-анализ фосфолипидов (ФЛ), растворить липиды сушат (см 5,6) в 700 мкл смеси растворителей, состоящей из дейтерированном хлороформе (CDCl _3), метанола и полученный раствор CDTA полученного, как описано в 6.2 (5: 4: 1 объемное соотношение). Передача образца в микроцентрифужных трубки. Используйте прямой-смещение (или объёмные) микропипетку хлороформом-сопротивлятьсямуравей советы в обеих стадий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что изменение любой из следующих параметров повлияет на внешний вид (химический сдвиг и ширины линий) из PL ³¹ Р ЯМР-спектров ^13-17:
   (I) объемное соотношение CDCl _3: Раствор CDTA: МеОН
   (II) Общий объем растворителя используется
   (III) рН водного компонента растворителя
   (IV) Концентрация CDTA водного компонента растворителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В общем, точная настройка этих параметров пробы (таблица 1) не является необходимым, и должна быть выполнена с особой осторожностью при желании в особых случаях. Изменение объемное соотношение между растворителей легко приводит к образованию системы, состоящей из двух фаз вместо одной гомогенной фазе! Один-фазная система оказалась более практичным, чем двухфазной системе в большинстве приложений ^13,14.
4. Для ЯМР ¹ H анализа водорастворимых метаболитов, растворить лиофилизат (п.5.8) в 700 мкл оксида дейтерия (D ₂ O), содержащий 3- (триметилсилил) пропионовой-2,2,3,3-d4 натриевой соли кислоты (TSPD ₄₎ в диапазоне миллимолярной (D ₂ O, содержащим 0,05% TSPD ₄ является коммерчески доступным) . Передача образца в микроцентрифужных трубки.
5. Доводят рН полученного водного раствора экстракта до 7,3 путем добавления небольших количеств (около 2 мкл) хлорид дейтерия (DCL) и тяжёлой натрия (NaOD) решений. Во-первых, начнем с 0,02 N DCL или NaOD решений. Если 2 или 3 последующие дополнения не вызывают достаточного изменения рН, продолжить 0,2 N DCL или NaOD решений. Будьте осторожны, чтобы не overtitrate.
   Примечание: общее количество ДКЛ или NaOD раствора необходимо зависит от количества мозговой ткани, извлеченной; обратите внимание, это значение для точного метаболита количественного. В большинстве случаев объединенные объемы добавленных DCL и NaOD решений должны быть практически незначительна (около 1% от объема образца ЯМР).

Заголовка "> 7. Выполнение эксперимента ³¹ P ЯМР для мозга фосфолипидов Анализ ^13,14

1. Для получения наилучших результатов используйте многоядерный ЯМР спектрометр высокого разрешения (≥9.4 Tesla напряженность поля, соответствующая 162 МГц ³¹ P, или 400 МГц ¹ Н резонансных частот). Кроме того, ³¹ P катушки, убедитесь, что Р-ЯМР зонд ³¹ обладает ¹ H катушку для протонов развязки. Заданная температура регулирование зонда ЯМР до ​​желаемого целевого значения (обычно 25 ° C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура датчика может потребоваться 10-20 минут для стабилизации!
2. Центрифуга PL раствор экстракта в микроцентрифужных трубки (см 6,3) при 4 ° С и 11000 мкг в течение 30 мин, чтобы вращаться вниз твердых остатков в образце. Передача 600 мкл супернатанта к высококачественным ЯМР трубы (5 мм наружный диаметр).
3. Подготовить соответствующий шток коаксиальный вставки наполненный водным 20 мМ methylenediphosphonate решение (MDP) при рН 7,0 для химического сдвига ссылоки количественный. Поместите эту вставку в ЯМР пробирку, заполненную раствором экстракта PL.
4. Установите трубку ЯМР с соответствующим блесны и передачи к магниту ЯМР. Теперь спина образца при 15-20 Гц и ждать, пока образец не скорректировала до заданной температуры (около 10 мин).
5. Тщательно минимизировать неоднородности магнитного поля через образец, регулируя на оси и вне оси прокладка токов катушки ^18.
6. Установите ЯМР параметры измерения спектра оптимальных значений, которые могут варьироваться в зависимости от силы магнита поля (для системы с 9,4 T, см таблицу 1 для рекомендуемых значений параметров).
7. Установить количество переходных на эксперимент (= NS).
   1. Установка NS до примерно 80 (общей продолжительности сбора данных примерно 20 мин), если только наиболее распространенные ЯП должны быть количественно с точностью (фосфатидилхолин (PtdCho), фосфатидилэтаноламин (PtdEtn), этаноламин plasmalogen).
   2. Установите NS до 100-200 (общей продолжительностью гПриобретение ата 1-2 ч), если менее концентрированные ЯП должны быть количественно (алкил-ацил-фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидна кислота).
   3. Установите NS до 1500-2000 (общей продолжительностью сбора данных 7-10 ч; ночной эксперимент), если очень низкой концентрации PLs должны быть количественно, например фосфатидилинозит моно и дифосфаты (PtdIP и PtdIP _2), кардиолипин, лизо-PLS , алкил-ацил-фосфатидилэтаноламин, а иногда и другие.
8. После окончания приобретения спектра, процесса спада свободной индукции (FID), используя оптимизированные параметры. Значения этих параметров изменяются в зависимости от напряженности магнитного поля, качество прокладки, и сигнала ФЛ быть количественно.
   1. Для получения наилучших результатов для всего спектра ЯП, повторить обработку использования нескольких (не менее двух) различных процедур фильтрации. Используйте сильный повышение разрешения для сильно перекрывающихся сигналов, например., Для PtdCho и PtdEtnрегионы.
   2. Используйте сильный фильтрацию (слабая или нет повышение разрешения) для слабых сигналов.
   3. Фильтр очень слабые и широкие сигналы без существенных перекрытия по аподизации (например, LB = 3 Гц), чтобы увеличить сигнал-шум, например PtdIP и PtdIP _2. В Таблице 1 характерных параметров обработки.
9. Количественная площадь каждого сигнала PL по отношению к площади под сигнала контрольного соединения (MDP) в том же спектра.
10. Калибровка сигнала опорного соединения (MDP) В отдельном эксперименте, с использованием 5 мм трубку, заполненную ЯМР (I), соединения фосфора в известной концентрации, и (II) тем же ствола вставки коаксиального, используемого в экспериментах, PL ³¹ Р-ЯМР ( см 7.3 и 7.9).
11. Расчет концентраций отдельных PL на основе относительных площадей сигналов PL, с одной стороны (см 7.9), так и на калибровочной значением, полученным для MDP откоаксиальный вставка с другой (см 7,10). Следует учитывать, что число ядер фосфора, способствующих конкретного сигнала ЯМР ³¹ P может изменяться в зависимости от молекулярной происхождения этого сигнала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфонат сигнал MDP (обычно ссылаются на 19,39 промилле) представляет собой два ядра фосфора, как и кардиолипин фосфата сигнал. Все другие сигналы ЯМР PL ³¹ P обнаруженные в экстрактах мозга представляют одно ядро фосфора каждый.
12. Используйте статистическая программа по мере необходимости, чтобы сравнить уровни мозга PL между группами животных.

8 Выполнение эксперимента ^{1Н ЯМР} для анализа водорастворимых Brain Метаболиты

1. Заданная температура регулирование зонда ¹ ЯМР к желаемой целевой стоимости (обычно 25 ° C). Смотрите также замечает в 7,1.
2. Центрифуга водного раствора экстракта в микроцентрифужных трубки (см 6,5) при 4 ° С и 11000мкг в течение 30 мин для замедления вращения твердых остатков в образце. Передача 600 мкл супернатанта к высококачественным ЯМР трубы (5 мм наружный диаметр).
3. Передача ЯМР трубка ЯМР магнит, прокладки и установленных параметров сбора ЯМР спектра до оптимальных значений, как было описано в 7.4-7.6. Смотрите также таблицу 1 для рекомендуемых значений параметров.
4. Установите количество переходных на эксперимент, чтобы о NS = 32 (общая продолжительность сбора данных примерно 13 мин). Для получения хороших отношения сигнал-шум очень слабые сигналы, в частности, в ароматической области, использовать NS = 64 (общая продолжительность сбора данных примерно 26 мин) или более.
5. После окончания приобретения спектра, процесса спада свободной индукции (FID), используя оптимизированные параметры. Значения этих параметров слегка изменяться в зависимости от напряженности магнитного поля, качества прокладки, и сигнала метаболита, чтобы быть количественно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев, достаточно для обработки каждого спектр раз, Используя набор параметров обработки, представляющих собой хороший компромисс для всех метаболитов сигналов. В Таблице 1 характерных параметров обработки.
6. Количественная площадь каждого метаболита сигнала (часто мультиплета, иногда перекрывается с другими синглеты или мультиплетов, вытекающих из различных молекул) по отношению к площади под сигнала контрольного соединения (TSP-D ₄₎ в той же спектра.
7. Рассчитать отдельные концентрации метаболитов на основе TSP-д ₄ концентрации (см 6.4). Следует учитывать, что число протонов, способствующих конкретного сигнала ЯМР ¹ H может изменяться в зависимости от молекулярной происхождения этого сигнала. Триметил сигнал TSP-д ₄ (по отношению к 0,0 промилле) представляет девять протоны.
8. Используйте статистическая программа по мере необходимости, чтобы сравнить уровни мозга метаболитов между группами животных.

Результаты

Для получения наилучшего разрешения в метаболической спектров ЯМР головного мозга и других тканевых экстрактов, она уже давно распространенная практика, чтобы удалить или ионы маска металлические (что наиболее важно: парамагнитные ионы), присутствующие в экстракте решений. Это было д...

Обсуждение

ЯМР-спектроскопия является эффективным методом для измерения концентрации химических соединений в растворе в очень воспроизводимым и точным образом. Однако, чтобы получить качественную данные необходимо придерживаться определенных правил, связанных с подготовкой и анализ проб. При...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913