Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Riepilogo

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduzione

Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello ^1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l'espressione genica a RNA e / o livelli di proteine ​​da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall'altro ^2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi ^7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ultimi 10 o 15 anni, a una rinascita della ricerca metabolica in molti rami della biologia ^8,9. Mentre studi metabolici classici si sono spesso concentrati su dettagli di specifici percorsi, il nuovo approccio metabolomica è orientata verso un'indagine onnicomprensiva del profilo metabolico globale del tessuto in esame.Una conseguenza di questo concetto è un evidente bisogno di strumenti analitici che riducono al minimo pregiudizio verso specifici percorsi e / o classi di composti metabolici. Tuttavia, un saggio biochimico classica è basata su una particolare reazione chimica di un analita che deve essere specificato prima di eseguire il test. Per contro, tecniche spettroscopiche come la risonanza magnetica (NMR) nucleare e la spettrometria di massa (MS) (i) sono basati su particolari (fisici) proprietà molecolari di composti biochimici, ciascuna delle quali dà luogo ad uno o più segnali distinti in uno spettro rilevato nel corso di un esperimento; e (ii) rilevare un gran numero di diversi composti per esperimento.

Così, ogni spettro contiene le informazioni combinate di tutta una serie di metaboliti. Per questo motivo, i metodi spettroscopici sono strumenti adeguati per la metabolomica, in quanto nessuna selezione preventiva deve essere fatta per quanto riguarda la natura dell'analita da misurare ⁸ . Di conseguenza, queste tecniche naturalmente si prestano a studi esplorativi perché notevolmente facilitano l'individuazione di cambiamenti metabolici inaspettati.

Anche se la spettroscopia NMR e MS possono essere usati in modo intercambiabile per l'analisi di molti metaboliti, ogni metodo possiede vantaggi e gli svantaggi che sono stati recentemente recensito ¹⁰ specifici. In breve, la spettroscopia NMR di solito può essere eseguita da estratti grezzi e non richiede la separazione cromatografica di composti del campione prima dell'analisi. Al contrario, MS funziona con gas o cromatografia liquida (GC o LC) separazione, ad eccezione di particolari sviluppi recenti come l'imaging spettrometria di massa. In alcuni casi particolari, come l'analisi degli zuccheri, separazione LC può diventare una necessità per la spettroscopia NMR così, perché le linee di risonanza di zuccheri diversi si sovrappongono in modo significativo nel protone ⁽¹ H) spettri NMR. Tuttavia, spettroscopia ¹ H NMR senza chrseparazione omatographic rimane il più popolare quasi universalmente applicata metodo NMR metabolomica,. In generale, la preparazione del campione è più lungo e complesso per MS di quanto lo sia per la spettroscopia NMR. Gravi problemi dovuti agli effetti della matrice sono molto meno comuni in spettroscopia NMR che in Stati membri in cui essi possono condurre a segnali notevolmente attenuati. Metabolita quantificazione può essere ottenuto con entrambi i metodi. Tuttavia, sono necessari più composti standard per la SM a causa di variazioni di effetti matrice e l'efficienza di ionizzazione tra metaboliti. Al contrario, è necessario un solo standard per ogni campione per l'analisi spettroscopica NMR perché in condizioni di misura adeguate, il secondo metodo è intrinsecamente quantitative grazie alla risposta NMR strettamente lineare dai nuclei osservati. Un grave inconveniente di NMR è la sua relativamente bassa sensibilità. MS, in particolare, LC-MS, è più sensibile NMR di diversi ordini di grandezza; per questo motivo, MS è da preferire NMR per laanalisi dei composti presenti a concentrazioni molto basse. D'altra parte, la natura non distruttiva dell'esperimento NMR è un chiaro vantaggio rispetto MS; in questo modo, NMR può essere eseguita più volte sullo stesso campione, ad esempio, per i diversi nuclei NMR attivo come ¹ H, fosforo-31 ⁽³¹ P), carbonio-13 ⁽¹³ C), fluoro-19 ⁽¹⁹ F) etc., in quanto nessun materiale viene consumato da NMR rispetto alle misurazioni MS.

Sia NMR e MS possono essere impiegati in modi differenti, ognuno dei quali è ottimale per la rivelazione di composti con particolari caratteristiche chimiche. Per esempio, ³¹ P NMR è spesso più adatto di ¹ H NMR per l'analisi di composti fosforilati moderatamente concentrati, sebbene metaboliti fosforilati quasi tutti contengono anche protoni. Tuttavia, i loro segnali ¹ H NMR possono essere oscurate da ¹ H NMR i segnali provenienti da altri composti, non fosforilata, mentre il secondoovviamente non causano segnali di fondo in ³¹ P NMR. In una situazione analogico, analisi ¹⁹ F NMR è da preferire per i composti fluorurati, ad esempio, farmaci fluorurati (nessun segnale di fondo di metaboliti endogeni), mentre il caso speciale di ¹³ C NMR è di interesse quasi esclusivamente se il destino di ¹³ C deve essere seguita, a causa della estremamente bassa abbondanza naturale dell'isotopo ¹³ C (circa 1%) etichettati precursori metabolici esogeni. Molti spettrometri di massa operano in modalità ioni negativi o in modalità ioni positivi. Pertanto, è importante conoscere in anticipo l'analisi se gli ioni da osservare sono caricati negativamente o positivamente. Ci concentriamo qui su un protocollo per l'analisi del metabolome tessuto cerebrale da ¹ H e ³¹ spettroscopia NMR P perché questo metodo produce un gran numero di importanti concentrazioni di metaboliti a basso costo, in termini di (i) il tempo necessario per la preparazione del campione unnd (ii) lo sforzo richiesto per metabolita quantificazione. Tutti gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando l'attrezzatura di un laboratorio standard di wet-chimica e una struttura di spettroscopia NMR ad alta risoluzione. Ulteriori requisiti sono descritti nella sezione Protocollo di seguito.

Protocollo

NOTA: ANIMAL DICHIARAZIONE ETICA
Gli studi sugli animali sui ratti hanno seguito le linee guida vigenti in Francia, e sono stati approvati dal Comitato Etico locale (# 40.04, Università di Aix-Marseille Medical School, Marsiglia, Francia).

1 raccolta e congelamento Rat Brain

1. Preparare articoli richiesti: azoto liquido (N _2liq.) In Dewar che è grande abbastanza per mantenere un morsetto di congelamento (almeno 2-3 L di volume); anestetico (ad esempio, isoflurano, o ketamina / xilazina); camera di anestesia; strumenti di dissezione sterili: forbici chirurgiche, bisturi, pinze; salviette di tessuto e bottiglia con la pulizia alcol (etanolo); aghi (25 G); 1 ml e 10 ml siringhe. Fogli di alluminio Label (ca. 10 x 10 cm) con nastro adesivo. Usare i fogli per avvolgere i singoli cervelli di ratto freeze-bloccato.
   NOTA: Indossare sempre guanti protettivi e occhiali di protezione degli occhi o maschera quando si maneggia l'azoto liquido!
2. Riempire Dewar con N _2liq. Ed inserire gratismorsetto zing in un Dewar. Assicurarsi che la quantità di N _2liq nel Dewar è sufficiente per ripetute procedure di congelamento-clamp (diversi litri, la quantità di N _2liq evaporazione durante ogni freeze-bloccaggio dipende dalle dimensioni della pinza).
3. Anestetizzare animale (ad esempio, da isoflurano, oppure mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina). Procedere a eutanasia mediante puntura cardiaca per prevenire le emorragie durante cuoio capelluto viene rimosso e il cranio è aperto. Passi 1,4-1,7 sotto descrivono la procedura standard.
   NOTA: Nei protocolli speciali che richiedono la massima conservazione del glucosio e ad alta energia metaboliti, il sacrificio ratto-imbuto congelamento del cervello dell'animale anestetizzato con N _2liq ^11, dopo un ritorno del cuoio capelluto. Poi, sezionare il cervello dal cranio sotto intermittente N _2liq per minimizzare post mortem metabolismo ^12.
4. Inumidire testa di ratto con alcol per pulizia. Usare le forbici chirurgiche a (i) remove cuoio capelluto, e (ii) il cranio aperto lungo suture craniche.
5. Usare pinze per aprire ulteriormente il cranio, e di togliere tutto il cervello da sotto il cranio aperto, posizionando la testa a testa in giù. Rimuovere subito eventuali tracce visibili di sangue utilizzando salviette di tessuto. Se emisferi cerebrali sono metabolicamente e morfologicamente simmetrica, è conveniente utilizzare uno degli emisferi per l'analisi metabolica dopo la separazione dalla emisfero mediante incisione con il bisturi. Se necessario, utilizzare l'emisfero rimanente per altri studi del cervello come istologia.
6. Rapidamente rimuovere congelamento morsetto da N _2liq -filled Dewar, posizionare intero o metà cervello di ratto su una superficie interna, morsetto e inserire subito il congelamento morsetto in N _2liq -filled Dewar tenendo morsetto saldamente compressa. Assicurarsi che i punti 1.3-1.6 non durare più di 60 sec.
7. Dopo 1-2 minuti togliere il congelamento morsetto dal Dewar, pinza aperta, allentare il tessuto cerebrale congelato dalla pinza, e avvolgeretessuti congelati in lamiera di alluminio opportunamente etichettati (vedi 1.1 sopra). Assicurarsi che l'etichetta sia leggibile e rimane saldamente in posizione dopo che il campione è avvolto. Introdurre rapidamente campione avvolto in N _2liq. Eseguire l'intera procedura il più rapidamente possibile per evitare lo scongelamento del tessuto cerebrale congelato.
8. Conservare campione congelato in N _2liq o in un congelatore a -80 ° C fino al momento dell'estrazione metabolita.
   NOTA: Ogni volta che un campione biologico deve essere conservato per più di un anno, la conservazione a temperatura _2liq N è da preferire -80 ° C. Ciò vale anche per il resto di questo protocollo.

2 Preparazione del metabolita Estrazione procedura

1. Preparare omogeneizzatore tessuto e provette corrispondenti (ad esempio, 10 mm di diametro interno, a seconda del diametro dell'albero omogeneizzatore, di solito in plastica). Utilizzare omogeneizzatori elettrici piuttosto che omogeneizzatori guidati manualmente (smerigliatrici tessuto). Prepare vortex e bilancia da laboratorio.
2. Preparare secchio pieno di ghiaccio tritato. Tenere quantitites sufficiente di metanolo, cloroformio e acqua sul ghiaccio (4 ml ciascuno a 250-350 mg di tessuto cerebrale congelato).
3. Preparare pipette di trasferimento e fiale.
   1. Preparare flaconcini di vetro (≥20 di volume ml) con tappo a vite e posto sul ghiaccio (una fiala ogni estratto di tessuto). Fit Tappi a vite con un resistente al cloroformio setti Teflon.
   2. Preparare 5 ml pipette di plastica per l'erogazione di metanolo e acqua, e pipette in vetro o siringhe Hamilton per l'erogazione cloroformio. Preparare pipette di plastica supplementari (5 o 10 ml di volume) per trasferire le miscele di tessuto omogenato e metanolo.
   3. Assicurarsi che tutta la vetreria è accuratamente risciacquato con acqua distillata e asciugato accuratamente prima dell'uso per rimuovere le tracce di impurità, in particolare formiato NMR-rilevabile e acetato.
4. Riempire mortaio di porcellana con N _2liq, posto porcellana pestello nel mortaio e riempire con N _2liq. Azoto evapora fino a temperatura di mortaio e pestello è sufficientemente bassa. Tenere piccola quantità di N _2liq in mortaio.

3 Estrazione di metaboliti

1. Rimuovere campione di tessuto cerebrale congelato dalla memoria (N serbatoio _2liq o -80 ° C freezer). Poi, trasferire immediatamente campione di tessuto per malta parzialmente riempiti con N _2liq.
2. Utilizzare il N _2liq pestello -cold a rompere il tessuto cerebrale congelato in pezzi più piccoli che si adattano facilmente nelle provette utilizzate per la omogeneizzazione dei tessuti. Per evitare che pezzi di tessuto congelato venga proiettata fuori della malta nel processo, rompere il tessuto pur essendo avvolto in foglio di alluminio. Non macinare tessuti congelati in polvere in quanto ciò renderebbe il trasferimento al provetta più difficile (aumento del rischio di formazione di condensa). IMPORTANTE: Durante l'intera procedura, aggiungere N _2liq alla malta come necessario per mantenere il campione surgelati.
3. Mix spezzi centro commerciale di tessuto cerebrale congelato a fondo, pesare 250-350 mg e trasferire in una provetta riempito di ghiaccio-freddo metanolo (4 ml per il tessuto cerebrale 250-350 mg). Ogni volta che pezzi di tessuto congelato si aggiungono, omogeneizzare questi immediatamente con l'omogeneizzatore tessuto.
   NOTA: Completare questa intera procedura rapidamente per evitare (i) significativa formazione di condensa sul campione che porterebbe ad una sovrastima del peso del campione, e (ii) il riscaldamento e scongelamento del campione. Pezzi di tessuto individuali devono essere in uno stato congelato all'inizio del processo di omogeneizzazione.
4. Dopo l'ultimo pezzo del campione di cervello di ratto congelato è stato aggiunto alla provetta ed omogeneizzato, trasferire l'omogeneizzato in un flacone di vetro di volume ≥20 ml, vicino tappo a vite e lasciare riposare in ghiaccio per 15 min. Se il volume della provetta non è sufficientemente grande per ≥4 ml di metanolo, utilizzare un volume più piccolo metanolo per omogeneizzare una parte del tessuto cerebrale congelato, trasferire la miscela alfiala di vetro e continuare omogeneizzando i pezzi di tessuto residuo con metanolo fresco. Assicurarsi che il volume totale metanolo è di 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale.
5. Aggiungere lo stesso volume di ghiaccio-freddo cloroformio (cioè, 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale) di omogenato, vortice accuratamente e lasciare riposare in ghiaccio per 15 min.
   NOTA: utilizzare sempre cappa chimica ventilato durante la manipolazione solventi volatili, in particolare il cloroformio!
6. Aggiungere lo stesso volume di acqua (ad esempio, 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale) a omogenato, vortice accuratamente e lasciare riposare a -20 ° C per una notte.

4 Preparazione di separazione delle fasi ed evaporazione del solvente

1. Preparare centrifuga a freddo (4 ° C, 13.000 xg al massimo raggio) e provette da centrifuga. Assicurarsi che questi ultimi sono ≥20 volume di ml, resistente al cloroformio, e in grado di sopportare forze centrifughe di 13.000 x g. Utilizzare provette di vetro dedicati ma risciacquare (come tutti articoli di vetro) con acqua distillata essereuso anteriore (vedi 2.3).
2. Preparare accuratamente sciacquati pipette Pasteur in vetro e un propipettor appropriata (bulbo, pompa manuale pipetta, pipetta automatica aiuto / pipetta, ecc.).
3. Preparare due ulteriori provette accuratamente sciacquati (≥15 di volume ml) per campione cervello, di cui uno ha bisogno di essere resistente al cloroformio (in vetro o teflon), l'altro a metanolo (fatta di resistente al metanolo, o vetro plastica).
4. Preparare apparato evaporazione del solvente (disponibile in commercio o autocostruito). Assicurarsi che il dispositivo fornisce un flusso finemente controllata di gas di azoto secco che viene convogliata sulla superficie di una soluzione di estratto contenente solventi volatili (metanolo, cloroformio).
5. Preparare due vassoi o secchi aggiuntivi pieni di ghiaccio: uno per il trasporto del campione sul ghiaccio, e un altro per mantenere i campioni a freddo durante il processo di evaporazione.
6. Preparare liofilizzatore (freeze-asciugatrice) e materiali necessari per liofilizzazione: (i) una 50ml provetta da centrifuga o vuoto pallone basso per estratto, e (ii) N _2liq di congelare la fase acquosa di campioni (≤0.3 L per campione). Se si utilizza il tubo da centrifuga, preparare anche a livello di collo di bottiglia filtro vuoto adatto per liofilizzatore.

5. fase di separazione e di evaporazione del solvente

1. Per la separazione di fase completa, trasferire il tessuto omogenato metanolo / cloroformio / acqua / cervello (vedi 3.6) in una provetta da centrifuga cloroformio-resistente (volume ≥20 ml) e centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 40 min.
   NOTA: Due fasi formeranno, separati da uno strato di proteina precipitata. La fase inferiore (più pesante) è costituito da metanolo, cloroformio e lipidi disciolti, mentre la fase superiore (accenditore) è costituito da acqua, metanolo e metaboliti idrosolubili disciolti.
2. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire la fase superiore ad un appropriato tubo ml ≥15 (resistente al metanolo plastica o vetro). Tenere su ice.
3. Utilizzare una pipetta Pasteur fresco per trasferire la fase inferiore ad un appropriato tubo ≥15 ml (vetro o Teflon). Tenere su ghiaccio.
4. Conservare il livello di proteina precipitata a -80 ° C se deve essere utilizzato per la determinazione delle proteine ​​totali; oppure scartare.
5. Mantenere il tubo con la fase acqua / metanolo (vedi 5.2) su ghiaccio e si evapora il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sulla superficie della soluzione di estratto. In alternativa, delicatamente bolla azoto attraverso la soluzione di estratto. Terminare il processo di evaporazione quando gorgogliare azoto non causa più la riduzione del volume della soluzione di estratto. In questo momento, continuare con liofilizzazione (vedere 5.7), o congelare e mantenere campione a -80 ° C con il tubo chiuso (tappo a vite o Parafilm) fino al momento liofilizzazione.
6. Posizionare il tubo con la fase di metanolo / cloroformio (vedi 5.3) sul ghiaccio e far evaporare il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sul surfaccia della soluzione d'estrazione. Quando tutto il solvente viene evaporato, terminare il processo e mantenere il campione a -80 ° C con il tubo chiuso (tappo a vite o Parafilm) fino al momento analisi NMR.
7. Preparare fase acquosa per Liofilizzazione
   1. Dopo la fine del processo di evaporazione del metanolo (vedi 5.5), trasferire il campione ad un risciacquato tubo da centrifuga da 50 ml (se il campione è congelato, scongelare prima del trasferimento). In alternativa, trasferire in un pallone a fondo tondo vuoto.
   2. Congelare soluzione di estratto ruotando tubo da centrifuga (o pallone a fondo tondo) parzialmente inserito nel N _2liq tale che la superficie interna del tubo o pallone viene progressivamente coperto da liquido congelato. Assicurarsi che nessun N _2liq. Può entrare nel recipiente.
   3. Quando tutto il liquido è congelato, coprire il tubo con un coperchio forato o tappo a vite per permettere al vapore di fuoriuscire, e porre il tubo in una bottiglia filtro a depressione a livello del collo.
   4. Inizia liofilizzazione dopo Attaching il pallone o flacone per il liofilizzatore.
8. Terminare il processo di liofilizzazione quando il campione è completamente asciutto. Mantenere il campione a -80 ° C in un tubo chiuso (con un tappo a tenuta!) Finché utilizzata per l'analisi NMR.
   NOTA: Di solito non più di 24 ore sono necessarie per liofilizzazione. Diversi campioni possono essere liofilizzate contemporaneamente, a seconda del design del liofilizzatore, e se vengono utilizzate provette da centrifuga in bottiglie a collo largo o palloni a fondo tondo.

6 Preparazione di campioni NMR

1. Conservare secchi e gli estratti liofilizzati a temperatura molto bassa (≤-80 ° C). Ridisciogliere liofilizzati per la preparazione dei campioni NMR immediatamente prima dell'esperimento NMR.
   NOTA: Memorizzazione di campioni in soluzione e / o temperatura ambiente può causare la degradazione del campione!
2. Preparare una soluzione acquosa 200 mM dell'agente chelante, l'acido trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), come segue:
   1. Aggiungere acqua pura (ad esempio, 20 ml) in una provetta provetta o centrifuga, e aggiungere la quantità di CDTA polvere necessaria per generare una soluzione 200 mM.
      NOTA: Una parte sostanziale di CDTA non sarà solubile, perché il pH è molto basso in quanto la forma acida della CDTA è stato utilizzato, piuttosto che un sale CDTA.
   2. Aggiungere con cautela, passo dopo passo, aumentando quantità di polvere CsOH alla soluzione CDTA, e vortex accuratamente dopo ogni aggiunta.
      NOTA: La frazione solubile CDTA aumenterà con l'aumento del contenuto CsOH nella soluzione acquosa. Evitare "overtitration", vale a dire a meno di aggiungere la quantità stechiometrica di CsOH alla soluzione CDTA.
   3. Quando quasi tutta la polvere CDTA viene sciolta, iniziare a misurare il pH dopo ogni aggiunta CsOH e vortex approfondita. Terminare CsOH Inoltre quando il pH finale viene raggiunta (Tabella 1).
      NOTA: In questo momento, tutto il CDTA sarà sciolto. L'uso di Cs ⁺ come controione di CDTA è generalleato preferito su Na ⁺ o K ^+. Cs ⁺ è un acido di Lewis morbido grazie alla sua grande raggio ionico, al contrario di Na ⁺ e K ^+, che hanno minore raggi ionici e sono acidi forti. Di conseguenza, Cs ⁺ forma complessi con fosfati (basi dure) meno facilmente di quanto non facciano Na ⁺ e K ^+. Questo è vantaggioso per ³¹ P spettroscopia NMR di metaboliti fosforilati perché complessazione tende ad aumentare larghezze di riga NMR, in particolare in condizioni di lenti a scambio ionico intermedio.
3. Per ³¹ P NMR analisi dei fosfolipidi (PL), dissolvono lipidi essiccati (vedi 5.6) in 700 ml di una miscela solvente costituita da cloroformio deuterato (CDCl _3), metanolo e la soluzione CDTA preparato come descritto al punto 6.2 (5: 4: 1 rapporto in volume). Trasferire il campione in una provetta. Usa-spostamento diretto (o volumetrica) micropipetta con cloroformio-resisteresuggerimenti formica in entrambe le fasi.
   NOTA: Tenere presente che la modifica dei seguenti parametri influenzerà l'aspetto (chemical shift e la larghezza delle linee) di PL ³¹ P NMR ^13-17:
   (I) rapporto volume CDCl _3: soluzione CDTA: MeOH
   (Ii) il volume di solvente totale utilizzata
   (Iii) il pH della componente acquosa del solvente
   (Iv) concentrazione CDTA della componente acquosa del solvente.
   NOTA: In generale, la messa a punto di questi parametri del campione (Tabella 1) non è necessaria, e deve essere effettuata con estrema cura, se desiderato, in casi particolari. Modifica del volume tra solventi facilmente provoca la formazione di un sistema costituito da due fasi invece di una fase omogenea! Il sistema monofase è risultato essere più pratico rispetto al sistema a due fasi nella maggior parte delle applicazioni ^13,14.
4. Per analisi ¹ H NMR di metaboliti idrosolubili, sciogliere liofilizzato (vedi 5.8) in 700 microlitri ossido di deuterio (D ₂ O) contenente 3 (trimetilsilil)-propionico 2,2,3,3-d4 sale sodico (TSPD ₄₎ nell'intervallo millimolare (D ₂ O contenente 0,05% TSPD ₄ è disponibile in commercio) . Trasferire il campione in una provetta.
5. Regolare il pH della soluzione risultante estratto acquoso di 7.3 con l'aggiunta di piccole quantità (circa 2 ml) di cloruro di deuterio (DCL) e soluzioni deuterossido sodio (INCD). In primo luogo, iniziare con 0,02 N soluzioni DCL o INCD. Se 2 o 3 integrazioni successive non provocano sufficiente il cambiamento di pH, continuare con 0,2 N soluzioni DCL o INCD. Fare attenzione a non overtitrate.
   NOTA: L'importo complessivo di soluzione di DCL o INCD necessaria dipende dalla quantità di tessuto cerebrale estratto; notare che questo valore per una precisa quantificazione metabolita. Nella maggior parte dei casi i volumi combinati delle aggiunte soluzioni DCL e INCD dovrebbero essere praticamente trascurabile (quasi l'1% del volume del campione NMR).

TITOLO "> 7. svolgimento dell'esperimento ³¹ P NMR per Brain Phospholipid Analysis ^13,14

1. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un spettrometro NMR multinucleare ad alta risoluzione (≥9.4 Tesla di campo, corrispondente a 162 MHz ³¹ P, o 400 MHz ¹ frequenze di risonanza H). Oltre la bobina ³¹ P, assicurarsi che la sonda ³¹ P NMR possiede una bobina ¹ H per protone disaccoppiamento. Impostare la regolazione della temperatura della sonda NMR di valore nominale desiderato (di solito 25 ° C).
   NOTA: la temperatura della sonda potrebbe essere necessario 10-20 minuti per stabilizzare!
2. Soluzione Centrifuga PL estratto in provetta (vedi 6.3) a 4 ° C e 11.000 xg per 30 min a girare giù residui solidi nel campione. Trasferire 600 ml di surnatante in un tubo NMR di alta qualità (diametro esterno 5 mm).
3. Preparare appropriato gambo inserto coassiale riempito con un methylenediphosphonate acquosa 20 mM di soluzione (MDP) a pH 7.0 per chimico-shift riferimentoe quantificazione. Mettere questo inserto nel tubo NMR riempito con soluzione di estratto di PL.
4. Montare il tubo NMR con l'ogiva e il trasferimento opportuno magnete NMR. Ora ruotare il campione a 15-20 Hz e attendere fino a quando il campione si è adattato alla temperatura impostata (ca. 10 min).
5. Minimizzare cura disomogeneità di campo magnetico attraverso campione regolando in asse e fuori asse correnti bobina spessore ^18.
6. Impostare NMR parametri di acquisizione dello spettro di valori ottimali, che possono variare in funzione di intensità di campo magnetico (per un sistema 9.4 T, si veda la Tabella 1 per i valori dei parametri raccomandati).
7. Impostare il numero di transitori per esperimento (= NS).
   1. Impostare NS a circa 80 (durata totale dell'acquisizione dati circa 20 minuti) se solo i PL più diffuse devono essere quantificato con precisione (fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolamina (PtdEtn), etanolammina plasmalogen).
   2. Impostare NS a circa 100-200 (durata totale dacquisizione ata 1-2 ore) se PLs meno concentrati sono da quantificato (alchil-acil-fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina, acido fosfatidico).
   3. Impostare NS a circa 1.500-2.000 (durata totale dell'acquisizione dati 7-10 h; esperimento durante la notte) se PLs molto-basso-concentrazione devono essere quantificato, ad esempio mono fosfatidilinositolo e difosfati (PtdIP e PtdIP _2), cardiolipina, liso-PL , alchil-acil-fosfatidiletanolamina, e occasionalmente altri.
8. Dopo la fine della acquisizione dello spettro, processo di decadimento di induzione libera (FID) con parametri ottimizzati. I valori di questi parametri variano in funzione della forza di campo magnetico, qualità spessore, e il segnale PL da quantificare.
   1. Per ottenere i migliori risultati per l'intera gamma di PL, ripetere l'elaborazione utilizzando multipla (almeno due) diverse procedure di filtraggio. Utilizzare forte miglioramento della risoluzione per i segnali fortemente sovrapposti, ad es., Per PtdCho e PtdEtnregioni.
   2. Utilizzare forte filtraggio (debole o nessun miglioramento della risoluzione) per i segnali deboli.
   3. Filtro segnali molto deboli e larghe, senza significative sovrapposizioni da apodizzazione (ad esempio, LB = 3 Hz) per aumentare segnale-rumore, ad esempio PtdIP e PtdIP _2. Vedere la Tabella 1 per i parametri di elaborazione caratteristici.
9. Quantificare l'area di ogni segnale PL rispetto alla zona sotto il segnale del composto di riferimento (MDP) nello stesso spettro.
10. Calibrare il segnale del composto di riferimento (MDP) in un esperimento separato, utilizzando un tubo NMR 5 millimetri riempito con (i) un composto di fosforo di concentrazione nota, e (ii) l'inserto stesso stelo coassiale utilizzato in esperimenti PL ³¹ P NMR ( vedi 7.3 e 7.9).
11. Calcola concentrazione singola PL basato sulle aree relative dei segnali PL da un lato (vedi 7.9), e il valore di calibrazione ottenute per MDP daInserto coassiale dall'altro (vedi 7.10). Si tenga conto che il numero di nuclei di fosforo contribuiscono ad un particolare segnale NMR ³¹ P può variare in funzione dell'origine molecolare di tale segnale.
    NOTA: Il segnale phosphonate MDP (di solito riferito a 19.39 ppm) rappresenta due nuclei di fosforo, così come il segnale cardiolipina fosfato. Tutti gli altri segnali NMR PL ³¹ P rilevati in estratti cerebrali rappresentano un nucleo fosforo ciascuno.
12. Utilizzare un software di statistiche come necessario per confrontare i livelli di PL cerebrali tra i gruppi di animali.

8 svolgimento dell'esperimento ¹ H NMR per l'analisi di acqua-solubile metaboliti cerebrali

1. Impostare la regolazione della temperatura della sonda ¹ H NMR al valore nominale desiderato (di solito 25 ° C). Osservazioni Vedere anche 7.1.
2. Centrifugare la soluzione di estratto acquoso in provetta (vedi 6.5) a 4 ° C e 11.000xg per 30 min a spin down residui solidi nel campione. Trasferire 600 ml di surnatante in un tubo NMR di alta qualità (diametro esterno 5 mm).
3. Trasferimento tubo NMR a magnete NMR, spessore e impostare spettro NMR parametri di acquisizione a valori ottimali come spiegato in 7,4-7,6. Per i valori dei parametri raccomandati Vedi anche Tabella 1.
4. Impostare il numero di transitori per esperimento a circa NS = 32 (durata totale dell'acquisizione dati ca. 13 min). Per ottenere buoni rapporti segnale-rumore per segnali molto deboli, in particolare nella regione aromatica, utilizzare NS = 64 (durata totale dell'acquisizione dati ca. 26 min) o più.
5. Dopo la fine della acquisizione dello spettro, processo di decadimento di induzione libera (FID) con parametri ottimizzati. I valori di questi parametri variano leggermente in funzione di forza del campo magnetico, la qualità spessore, e il segnale metabolita da quantificare.
   NOTA: Nella maggior parte dei casi, è sufficiente per trattare ogni spettro una volta, Impiegando un insieme di parametri di lavorazione che presentano un buon compromesso per tutti i segnali di metaboliti. Vedere la Tabella 1 per i parametri di elaborazione caratteristici.
6. Quantificare l'area di ogni segnale metabolita (spesso un multipletto, talvolta sovrapposizioni con altre singlets o multipletti derivanti da differenti molecole) rispetto alla zona sotto il segnale del composto di riferimento (TSP-d ₄₎ nello stesso spettro.
7. Calcolare le concentrazioni del metabolita individuali basate su TSP-d ₄ concentrazione (vedi 6.4). Si tenga conto che il numero di protoni che contribuiscono ad un particolare segnale NMR ¹ H, possono variare in funzione della provenienza molecolare di tale segnale. Il segnale TSP-d ₄ trimetil (riferiti a 0,0 ppm) rappresenta nove protoni.
8. Utilizzare un software di statistiche come necessario per confrontare i livelli di metaboliti cerebrali tra i gruppi di animali.

Risultati

Per ottenere la migliore risoluzione in metabolica spettri NMR di cervello e di altri estratti tissutali, è stato a lungo una pratica comune per rimuovere o ioni metallici (maschera più importante: ioni paramagnetici) presenti nelle soluzioni di estratto. Ciò è stato ottenuto mediante aggiunta di un agente chelante come EDTA o CDTA all'estratto ^19, o facendo passare l'estratto attraverso una resina a scambio ionico, come Chelex-100 ^20. I risultati presentati in Figura 1,

Discussione

Spettroscopia NMR è un metodo efficiente per la misurazione delle concentrazioni di composti chimici in soluzione in modo molto accurato e riproducibile. Tuttavia, per ottenere dati di alta qualità, è necessario rispettare alcune norme in materia di preparazione e analisi del campione. Nella determinazione di concentrazioni di metaboliti mediante spettroscopia NMR, né la generazione né la ricezione del segnale NMR domina l'errore di quantificazione, a meno che l'intensità di un segnale osservato avvicina a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913