Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

Resumo

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Resumo

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introdução

Modelos murinos têm sido utilizados extensivamente em pesquisas sobre o cérebro ^1. Correlações genótipo-fenótipo foram investigados em ratinhos e ratos cérebros por estudar a expressão do gene no RNA e / ou os níveis de proteína em, por um lado, e os fenótipos morfológicos, funcionais, electrofisiológicos e / ou comportamentais no outro ^2-6. No entanto, para compreender completamente os mecanismos que ligam fenótipo com o genótipo, é imperativo para investigar os eventos moleculares jusante da expressão da proteína, ie. o metabolismo dos substratos bioquímicos sobre o qual as enzimas actuam ^7. Esta exigência levou, ao longo dos últimos 10 a 15 anos, a um renascimento da pesquisa metabólica em muitos ramos da biologia ^8,9. Enquanto estudos metabólicos clássicos têm sido muitas vezes focado em detalhes de caminhos específicos, a nova abordagem metabolômica é voltada para uma investigação abrangente do perfil metabólico global do tecido em questão.Uma conseqüência desse conceito é uma necessidade óbvia de ferramentas analíticas que minimizem viés para as vias e / ou classes de compostos metabólicos específicos. No entanto, um ensaio bioquímico clássica baseia-se numa reacção química específica de um analito específico que precisa de ser especificado antes de o ensaio é realizado. Por outro lado, as técnicas espectroscópicas de ressonância magnética (RMN) nuclear e espectrometria de massa (MS) (i) são determinadas com base em propriedades moleculares (físicas) de compostos bioquímicos, cada um dos quais dá origem a um ou vários sinais distintos num espectro detectado no decurso de uma experiência; e (ii) detectar um grande número de compostos diferentes por experiência.

Assim, cada espectro contém a informação combinada de toda uma gama de metabolitos. Por esta razão, métodos espectroscópicos são ferramentas adequadas para metabolômica, já que nenhuma seleção prévia precisa ser feita em relação à natureza da substância a medir ⁸ . Como consequência, estas técnicas adequam-se naturalmente para estudos exploratórios porque facilitam grandemente a detecção de alterações metabólicas inesperados.

Embora espectroscopia de RMN e MS pode ser utilizada indiferentemente para a análise de vários metabolitos, cada método possui vantagens e desvantagens que foram recentemente revisto ¹⁰ específicas. Resumidamente, a espectroscopia de RMN pode geralmente ser realizada a partir de extractos em bruto e não necessita de separação cromatográfica de compostos de amostra antes da análise. Por outro lado, MS trabalha com gás ou cromatografia líquida (GC ou LC) separação, exceto para os recentes desenvolvimentos específicos, tais como imagens de espectrometria de massa. Em alguns casos especiais, tais como a análise de açúcares, LC separação pode tornar-se uma necessidade para a espectroscopia de RMN, como bem, porque as linhas de ressonância de diferentes açúcares sobrepõem-se significativamente em protão ^(1H) Os espectros de RMN. No entanto, ^uma espectroscopia de RMN sem chrseparação omatographic continua a ser o método de RMN mais popular, quase universalmente aplicada metabolômica. Geralmente, a preparação da amostra é mais demorada e complexa para MS do que para espectroscopia de RMN. Sérios problemas devido a efeitos de matriz são muito menos comuns em espectroscopia de RMN que em MS, onde eles podem levar a sinais consideravelmente atenuados. Metabolito quantificação pode ser conseguida com um ou outro método. No entanto, vários compostos padrão são necessários para a MS, devido às variações nos efeitos de matriz e as eficiências de ionização entre os metabolitos. Pelo contrário, apenas um padrão por exemplo é necessário para uma análise de espectroscopia de RMN, porque sob as condições de medição adequadas, o último método é intrinsecamente graças quantitativos para a resposta RMN estritamente linear pelos núcleos observados. Uma grande desvantagem de RMN é a sua sensibilidade relativamente baixa. MS, em particular, LC-MS, é mais sensível do que a RMN de várias ordens de grandeza; por esta razão, MS é para ser preferido sobre RMN para oanálise de compostos que ocorrem em concentrações muito baixas. Por outro lado, a natureza não destrutiva da experiência de RMN é uma clara vantagem sobre a esclerose múltipla; desta forma, pode ser realizada RMN repetidamente com a mesma amostra, por exemplo, para diferentes núcleos de RMN-activo, tal como ^um H, fósforo-31 ⁽³¹ P), carbono-13 ⁽¹³ C), flúor-19 ⁽¹⁹ M) etc., como nenhum material é consumido por RMN em oposição às medições de MS.

Tanto a RMN e MS pode ser utilizada em modos diferentes, cada um sendo óptima para a detecção de compostos com características químicas específicas. Por exemplo, ³¹ P RMN é muitas vezes mais adequados do que ¹ H RMN para a análise de compostos fosforilados moderadamente concentrado, embora quase todos os metabólitos fosforilados também contêm protões. No entanto, os sinais de ¹ H NMR pode ser obscurecido por sinais de ¹ H RMN de outros compostos, não fosforilada, enquanto o segundoobviamente não causam sinais de fundo em ³¹ P espectros de RMN. Em uma situação análoga, ¹⁹ F NMR análise é para ser preferido para os compostos fluorados, por exemplo, drogas fluorados (não há sinais de fundo de metabolitos endógenos), enquanto que o caso ^especial, de ¹³ C RMN de interesse é, quase exclusivamente, se o destino do ^13C precursores metabólicos marcados exógenos deve ser seguido, devido à extremamente baixa abundância natural dos isótopos de ¹³ C (cerca de 1%). Muitos espectrómetros de massa de funcionar no modo de iões negativos ou modo de ião positivo. Portanto, é importante saber em frente da análise se os iões a serem observados são negativamente ou positivamente carregada. Nós nos focamos em um protocolo para a análise do tecido cerebral metabolome por ¹ H e ³¹ P espectroscopia de RMN, porque este método produz um grande número de concentrações metabólicas importantes, a baixo custo, em termos de (i) tempo necessário para a preparação de amostras dend (ii) esforço necessário para o metabolito quantificação. Todos os ensaios podem ser realizados utilizando o equipamento de laboratório padrão de química húmida e uma maior facilidade de resolução espectroscopia de RMN. Outros requisitos estão descritos na seção de protocolo a seguir.

Protocolo

NOTA: ANIMAL DE ÉTICA DECLARAÇÃO
Os estudos em animais em ratos seguiu as diretrizes válidas na França, e foram aprovados pelo Comitê de Ética local (# 40.04, da Universidade de Aix-Marseille Medical School, Marselha, França).

1. colheita e congelamento de cérebro de rato

1. Prepare os itens necessários: nitrogênio líquido _{(2liq N.)} Em Dewar que é grande o suficiente para manter a braçadeira de congelamento (pelo menos 2-3 L volume); anestésico (por exemplo, o isoflurano, ou cetamina / xilazina); câmara de anestesia; instrumentos de dissecação estéreis: tesoura cirúrgica, bisturi, pinças; lenços de tecido e garrafa com álcool de limpeza (etanol); agulhas (25 g); 1 ml e 10 ml de seringas. Folhas de alumínio etiqueta (cerca de 10 x 10 cm) com fita adesiva. Use folhas para embrulhar cérebros de ratos congelar-fixada individuais.
   NOTA: Use sempre luvas e óculos de proteção para os olhos ou máscara ao manusear nitrogênio líquido!
2. Preencha Dewar com N _2liq. E coloque livreBraçadeira zing num vaso Dewar. Certifique-se a quantidade de N _2liq no Dewar é suficiente para os procedimentos de congelamento-clamp repetidas (vários litros, a quantidade de N _2liq evaporação durante cada congelação-de aperto depende do tamanho do grampo).
3. Anestesiar animal (por exemplo, por isoflurano, ou por injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina / xilazina). Proceder à eutanásia por punção cardíaca para prevenir hemorragia quando couro cabeludo é retirado eo crânio é aberto. Passos 1,4-1,7 abaixo descrevem este procedimento padrão.
   NOTA: Em protocolos especiais que exigem a máxima preservação de glicose e de alta energia metabolitos, sacrifício do rato pelo cérebro do animal anestesiado com N-congelação funil _2liq ¹¹ após a retracção do couro cabeludo. Então, dissecar o cérebro fora do crânio sob _2liq intermitente N para minimizar post-mortem metabolismo ^12.
4. Umedeça cabeça de rato com álcool de limpeza. Use uma tesoura cirúrgica para (i) remove couro cabeludo, e (ii) ao longo do crânio aberto suturas cranianas.
5. Use uma pinça para abrir ainda mais o crânio, e para remover o cérebro inteiro debaixo do crânio aberto, o posicionamento da cabeça de cabeça para baixo. Remover rapidamente quaisquer traços visíveis de sangue usando lenços de tecido. Se hemisférios cerebrais são metabolicamente e morfologicamente simétricos, é conveniente usar um dos hemisférios para análise metabólica após a separa do outro hemisfério por incisão com o bisturi. Se necessário, use o hemisfério restante para outros estudos do cérebro, como histologia.
6. Rapidamente remover congelamento braçadeira de N _2liq -filled Dewar, coloque inteiro ou metade do cérebro do rato sobre uma superfície interna, braçadeira e insira imediatamente o congelamento braçadeira em N _2liq -filled Dewar, mantendo braçadeira firmemente comprimido. Certifique-se de que os passos 1,3-1,6 não demorar mais de 60 segundos.
7. Depois de 1-2 min remove congelamento grampo do Dewar, braçadeira aberta, solte o tecido cerebral congelado da braçadeira, e envoltóriotecidos congelados em folha de alumínio de rotulagem adequada (ver 1.1 acima). Certifique-se de que o rótulo seja legível e permanece firmemente no lugar após a amostra é enrolado. Colocar rapidamente amostra envolto em N _2liq. Executar todo o procedimento, tão rapidamente quanto possível para evitar o descongelamento do tecido cerebral congelado.
8. Guarde amostra congelada em N _2liq ou em um freezer a -80 ° C até a extração de metabólitos.
   NOTA: Sempre que uma amostra biológica é para ser armazenada durante mais de um ano, a temperatura de armazenamento na N _2liq é preferível à temperatura de -80 ° C. Isso vale também para o restante deste protocolo.

2 Preparação de Metabolite procedimento de extracção

1. Prepare homogeneizador de tecidos e tubos de ensaio relacionados (por exemplo, 10 mm de diâmetro interno, dependendo do diâmetro do veio de homogeneizador, normalmente feitos de plástico). Use homogeneizadores elétricos em vez de homogeneizadores acionados manualmente (moedores de tecido). Prépare vortexer e balança de laboratório.
2. Prepare balde cheio de gelo picado. Manter quantitites suficientes de metanol, clorofórmio e água com gelo (4 ml cada por 250-350 mg de tecido cerebral congelado).
3. Prepare pipetas de transferência e frascos.
   1. Prepare frascos de vidro (≥20 de volume ml) com tampas de rosca e colocar no gelo (um frasco por extrato de tecido). Coloque o parafuso tampas com septos Teflon resistente ao clorofórmio.
   2. Prepare 5 ml pipetas de plástico para a distribuição de água e metanol, e pipetas de vidro ou seringas Hamilton para distribuir clorofórmio. Prepare pipetas de plástico adicionais (5 ou 10 ml de volume) para a transferência de misturas de tecido homogeneizado e metanol.
   3. Certifique-se de todos os vidros é cuidadosamente lavados com água destilada e secas cuidadosamente antes de usar para remover os vestígios de impurezas, nomeadamente formato NMR-detectável e acetato.
4. Preencha almofariz de porcelana com N _2liq, lugar de porcelana pilão no almofariz e reabastecer com N _2liq. Nitrogênio irá evaporar até que a temperatura do almofariz e pilão é suficientemente baixa. Mantenha pequena quantidade de N _2liq em argamassa.

3 Extração de metabólitos

1. Remover congelado amostra de tecido cerebral de armazenamento (N tanque _2liq ou freezer -80 ° C). Em seguida, transfira imediatamente amostra de tecido para argamassa parcialmente preenchido com N _2liq.
2. Use o N _2liq pilão -cold para quebrar o tecido cerebral congelado em pedaços menores que facilmente se encaixam os tubos de ensaio utilizados para homogeneização de tecidos. Para evitar que pedaços de tecido congelado de ser projetado para fora da argamassa no processo, romper o tecido enquanto ainda está sendo envolto em folha de alumínio. Não moer o tecido congelado em pó como esta iria fazer a transferência para o tubo de ensaio mais difícil (aumento do risco de condensação da água). IMPORTANTE: Ao longo de todo o procedimento, adicione N _2liq à argamassa como necessário para manter a amostra ultracongelados.
3. Mix sshopping peças de tecido de cérebro congelado cuidadosamente, pesam-se 250-350 mg e transferir para um tubo de ensaio com gelo-metanol frio (4 ml de tecido cerebral de 250-350 mg). Todos os pedaços de tempo de tecido congelado são adicionados, homogeneizar estes imediatamente com o homogeneizador de tecido.
   NOTA: Complete todo este processo rapidamente para evitar (i) condensação significativa de água na amostra o que levaria a uma superestimação do peso da amostra, e (ii) aquecimento e descongelamento da amostra. Pedaços de tecido individuais devem estar em estado de congelação no inicio do processo de homogeneização.
4. Após o último pedaço da amostra de cérebro de rato congelado foi adicionado ao tubo de ensaio e homogeneizada, transferir o homogeneizado para um frasco de vidro ≥20 ml de volume, com tampa de rosca fechar e deixar repousar em gelo durante 15 min. Se o volume do tubo de ensaio não é suficientemente grande para ≥4 ml de metanol, utilizar um volume menor de metanol para homogeneizar uma parte do tecido cerebral congelado, transferir a mistura para ofrasco de vidro e continuar homogeneizar os pedaços de tecido residual com metanol fresco. Certifique-se que o volume total de metanol é de 4 ml por 250-350 mg de tecido cerebral.
5. Adicionar o mesmo volume de gelado de clorofórmio (ou seja, 4 ml por tecido cerebral 250-350 mg) de homogenato, vórtice completamente e deixar em repouso em gelo durante 15 min.
   OBSERVAÇÃO: Sempre utilize capuz química ventilada ao manusear solventes voláteis, nomeadamente clorofórmio!
6. Adicionar o mesmo volume de água (isto é, 4 ml por 250-350 mg de tecido cerebral homogeneizado para), vórtice completamente e deixar em repouso à temperatura de -20 ° C durante a noite.

4 Preparação de separação de fases e evaporação do solvente

1. Prepare centrífuga frio (4 ° C, 13.000 xg, a raio máximo) e os tubos de centrífuga. Certifique-se de que os últimos são ≥20 ml de volume, resistente a clorofórmio, e pode suportar as forças centrífugas de 13.000 x g. Use tubos de centrífuga de vidro dedicados, mas lave (como todos os utensílios de vidro) com água destilada seruso dianteiro (veja 2.3).
2. Prepare pipetas Pasteur de vidro cuidadosamente lavados e uma propipettor apropriado (lâmpada, bomba pipeta manual, automática pipeta ajuda / pipeta, etc.).
3. Preparar dois tubos adicionais exaustivamente enxaguadas (≥15 volumes ml) por amostra de cérebro, um dos quais tem de ser resistente ao clorofórmio (feito de vidro ou Teflon), o outro a metanol (feito de plástico resistente ao metanol, ou vidro).
4. Preparar aparelhos de evaporação do solvente (comercialmente disponível ou homebuilt). Assegure-se que este dispositivo fornece um fluxo finamente controlado de azoto gasoso seco que é dirigido para a superfície de uma solução de extracto contendo solventes voláteis (metanol, clorofórmio).
5. Preparar dois tabuleiros ou baldes cheios de gelo adicionais: uma para o transporte de amostras em gelo, e um outro para manter as amostras frias, durante o processo de evaporação.
6. Prepare liofilizador (liofilizador) e os materiais necessários para a liofilização: (i) um 50ml de tubo de centrífuga de vácuo ou por balão de fundo redondo de extracto, e (ii) N _2liq para congelar a fase aquosa de amostras (≤0.3 L por amostra). Se o tubo de centrifugação usado, também preparar todo o gargalo filtro de vácuo adequado para liofilizador.

5. separação de fases e evaporação do solvente

1. Para a separação de fase completa, transferir o homogenato de tecido de metanol / clorofórmio / água / cérebro (ver 3.6) para um tubo de centrífuga resistente ao clorofórmio (volume ≥20 ml) e centrifuga-se a 13.000 xg e 4 ° C durante 40 min.
   NOTA: Duas fases formarão, separadas por uma camada de proteína precipitada. A fase inferior (mais pesado) consiste de metanol, clorofórmio e lípidos dissolvidos, ao passo que a fase superior (mais claro) é constituído por água, metanol e metabolitos solúveis em água dissolvidos.
2. Usar uma pipeta de Pasteur, para transferir a fase superior para um tubo apropriado ml ≥15 (plástico resistente ao metanol, ou vidro). Mantenha-se na ice.
3. Usar uma pipeta de Pasteur de fresco a transferir a fase mais baixa de um tubo ≥15 ml apropriado (de vidro ou Teflon). Manter em gelo.
4. Armazenar a camada de proteína precipitada a -80 ° C, se é para ser usado para determinação da proteína total; ou então descartar.
5. Manter o tubo com a fase de água / metanol (v 5,2) em gelo e evapora-se o metanol, orientando uma corrente de azoto seco sobre a superfície da solução de extracção. Alternativamente, suavemente bolha de nitrogênio através da solução de extracção. Terminar o processo de evaporação quando borbulhar nitrogênio não causa redução no volume da solução de extracção. Neste momento, continuar com a liofilização (ver 5.7), ou por congelamento e manter amostra a -80 ° C, com o tubo fechado (tampa de rosca ou Parafilm) até estar pronto para a liofilização.
6. Colocar o tubo com a fase de metanol / clorofórmio (v 5,3) em gelo e evapora-se o metanol, orientando uma corrente de azoto seco para o surface do extracto. Quando todo o solvente é evaporado, terminar o processo e manter a amostra a -80 ° C, com o tubo fechado (tampa de rosca ou Parafilm) até estar pronto para a análise de RMN.
7. Prepare a fase aquosa por liofilização
   1. Após o fim do processo de evaporação de metanol (ver 5.5), transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 50 ml bem enxaguadas (se a amostra for congelado, descongelar antes da transferência). Alternativamente, a transferência para um vácuo balão de fundo redondo.
   2. Congelar solução do extracto por tubo de centrifugação rotativo (ou frasco de fundo redondo), parcialmente inserido em N _2liq de tal modo que a superfície interior do tubo ou o frasco é progressivamente coberta pelo líquido congelado. Certifique-se de _2liq não _N. Pode entrar no recipiente.
   3. Quando todo o líquido é congelado, cobrir o tubo com uma tampa perfurada ou tampa de rosca para permitir que o vapor se escape, o tubo e colocar num frasco de filtro de vácuo de grande pescoço.
   4. Comece liofilização após AttaChing o frasco ou garrafa para o liofilizador.
8. Terminar o processo de liofilização, quando a amostra é totalmente seco. Manter a amostra a -80 ° C em um tubo fechado (com uma tampa estanque!) Até ser utilizada para análise de RMN.
   NOTA: Normalmente, não mais do que 24 horas são necessárias para liofilização. Várias amostras pode ser liofilizado simultaneamente, dependendo da concepção do liofilizador, e do facto de os tubos de centrifugação em garrafas de largura-pescoço ou frascos de fundo redondo são utilizados.

6 Preparação de Amostras de RMN

1. Loja secas e extratos liofilizados com temperatura muito baixa (≤-80 ° C). Re-dissolver liofilizados para preparação de amostras de RMN imediatamente antes de o experimento de RMN.
   Nota: Armazenar as amostras em solução e / ou próximo da temperatura ambiente pode resultar na degradação da amostra!
2. Prepara-se uma solução aquosa 200 mM do agente quelante, ácido trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), como se segue:
   1. Adiciona-se água pura (por exemplo, 20 ml) para um tubo de ensaio ou tubo de centrífuga, e adicionar a quantidade de pó de CDTA necessário para gerar uma solução de 200 mM.
      Observação: Uma proporção substancial de CDTA não ser solúvel, porque o pH é muito baixa uma vez que a forma de ácido de CDTA foi usado em vez de um sal de CDTA.
   2. Adicione cuidadosamente, passo a passo, uma quantidade crescente de CsOH pó para a solução CDTA, e vortex bem após cada adição.
      NOTA: A fracção solúvel CDTA irá aumentar com o aumento do teor de CsOH em solução aquosa. Evitar "overtitration", ou seja, adicionar menos do que a quantidade estequiométrica de CsOH à solução CDTA.
   3. Quando quase todo o pó CDTA é dissolvido, começar a medir pH após cada adição CsOH e vórtex completa. Terminar CsOH adição quando o pH final é alcançado (Tabela 1).
      NOTA: Neste momento, tudo o CDTA será dissolvido. A utilização de Cs ^+, como um contra-ião é de CDTA generaliado preferido de Na ⁺ ou K ^+. Cs ⁺ é um ácido de Lewis suave, devido a sua grande raio iónico, em oposição a Na ⁺ e K ⁺ que tem menor raio iónico e são ácidos duros. Consequentemente, Cs ⁺ forma complexos com fosfatos (bases duras) menos prontamente do que Na ⁺ e K ^+. Isso é vantajoso para ³¹ P espectroscopia de RMN de metabólitos fosforilados porque complexação tende a aumentar linewidths RMN, nomeadamente em condições de lento a troca iônica intermediária.
3. Para a análise ^{de 31} P de fosfolípidos (PL) RMN, dissolver lípidos secos (ver 5.6) em 700 ul de uma mistura de solvente consistindo de clorofórmio deuterado _(CDCl3), metanol e a solução CDTA preparado como descrito no ponto 6.2 (5: 4: 1 razão em volume). Transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga. Use-deslocamento direto (ou de deslocamento positivo) micropipeta com clorofórmio-resistedicas de formigas em ambas as etapas.
   NOTA: Tenha em mente que a mudança de qualquer um dos seguintes parâmetros afetarão a aparência (deslocamento químico e larguras de linha) do PL ³¹ P NMR espectros ^13-17:
   (I) proporção em volume _CDCl3: solução CDTA: MeOH
   (Ii) o volume total de solvente utilizada
   (Iii) o pH do componente aquoso do solvente
   (Iv) concentração CDTA do componente aquoso do solvente.
   NOTA: Em geral, o ajuste fino dos parâmetros da amostra (Tabela 1) não é necessária, e deve ser realizada com extremo cuidado, se desejar, em casos especiais. Mudando a relação de volume entre os solventes facilmente resulta na formação de um sistema que consiste de duas fases, em vez de uma fase homogénea! O sistema de um só fase foi encontrada para ser mais prático do que o sistema de duas fases na maior parte das aplicações de ^13,14.
4. Para ^uma análise de 'H RMN de metabolitos solúveis em água, dissolver liofilizado (ver 5.8), em 700 ul de óxido de deutério (D ₂ O) contendo 3 (trimetilsilil) de sal de sódio de ácido propiónico-2,2,3,3-d4 (Tspd ₄₎ na gama milimolar (D ₂ O contendo 0,05% Tspd ₄ está disponível comercialmente) . Transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga.
5. Ajustar o pH da solução do extracto aquoso resultante para 7,3 por adição de pequenas quantidades (cerca de 2 ul) de cloreto de deutério (DCI) e deuteroxide sódio (NaOD) soluções. Em primeiro lugar, começar com 0,02 N soluções DCL ou NaOD. Se 2 ou 3 adições subsequentes não causar alteração do pH suficiente, continue com 0,2 N soluções DCL ou NaOD. Tenha cuidado para não overtitrate.
   NOTA: O montante global da solução DCI ou NaOD necessário depende da quantidade de tecido cerebral extraído; note que este valor para quantificação metabólito preciso. Na maioria dos casos, os volumes combinados das soluções adicionadas a DCL e NaOD deve ser praticamente negligenciável (cerca de 1% do volume da amostra de RMN).

itle "> 7. Desempenho do Experimento ³¹ P NMR para o Cérebro Phospholipid Análise ^13,14

1. Para melhores resultados, use um espectrômetro de RMN de alta resolução multinuclear (≥9.4 Tesla força de campo, o que corresponde a 162 MHz ³¹ P, ou 400 MHz ¹ freqüências de ressonância H). Além da bobina ³¹ P, garantir que o P NMR sonda ³¹ possui uma bobina de ¹ H para separação do protão. Definir a regulação da temperatura da sonda de RMN para o valor alvo desejado (normalmente 25 ° C).
   NOTA: A temperatura da sonda pode precisar de 10-20 min para se estabilizar!
2. Centrífuga solução PL extracto num tubo de microcentrífuga (ver 6.3) a 4 ° C e 11.000 xg durante 30 min para girar os resíduos sólidos da amostra. Transferir 600 uL de sobrenadante para um tubo de RMN de alta qualidade (diâmetro externo 5 mm),.
3. Prepare-tronco inserção coaxial apropriado solução (MDP) preenchido com uma solução aquosa mM metilenodisfosfonato 20 em pH 7,0 para químico-shift referenciamentoe quantificação. Coloque esta inserção no tubo de RMN preenchido com solução extrato PL.
4. Montar o tubo de RMN com o spinner ea transferência adequada ao íman RMN. Agora girar a amostra a 15-20 Hz e esperar até que a amostra foi ajustado para a temperatura ajustada (ca. 10 min).
5. Minimizar cuidadosamente campo magnético não homogeneidade em toda amostra, ajustando no eixo e fora do eixo da bobina correntes calço ^18.
6. Defina os parâmetros de aquisição de espectro de RMN de valores ideais, que podem variar em função da intensidade do campo magnético (para um sistema de 9,4 T, ver Tabela 1 para os valores dos parâmetros recomendados).
7. Defina o número de transientes por experimento (= NS).
   1. Situado a cerca de 80 NS (duração total de aquisição de dados cerca de 20 min), se apenas os PLs mais prevalentes são a ser quantificado com precisão (fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolamina (PtdEtn), etanolamina plasmalogênio).
   2. Definir NS de cerca de 100-200 (duração total de daquisição ata 1-2 h) se PLs menos concentradas são para ser quantificada (alquil-acil-fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatidico).
   3. Situado a cerca de 1.500-2.000 NS (duração total de aquisição de dados 7-10 h; experimento durante a noite), se PLs de muito baixa concentração devem ser quantificada, por exemplo, mono e fosfatidilinositol difosfato (PtdIP e PtdIP _2), cardiolipina, liso-PLs , alquil-acil-fosfatidiletanolamina, e, ocasionalmente, outros.
8. Após o final da aquisição de espectro, o processo de decaimento de indução livre (FID) utilizando parâmetros optimizados. Os valores destes parâmetros variam como uma função da força do campo magnético, a qualidade do calço, e o sinal de PL para ser quantificado.
   1. Para obter os melhores resultados para toda a gama de PLs, repita processamento usando múltiplos (pelo menos) dois diferentes procedimentos de filtragem. Use realce forte resolução para os sinais que se sobrepõem fortemente, por exemplo., Por PtdCho e PtdEtnregiões.
   2. Usar filtro forte (fraco ou nenhum aprimoramento de resolução) para sinais fracos.
   3. Filtrar os sinais muito fracos e sem grandes sobreposição significativa por apodização (por exemplo, LB = 3 Hz), para aumentar a relação sinal-para-ruído, por exemplo, e PtdIP PtdIP _2. Ver Tabela 1 para os parâmetros de processamento característicos.
9. Quantificar a área de cada sinal de PL em relação à área sob o sinal do composto de referência (MDP) no mesmo espectro.
10. Calibra-se o sinal da substância de referência (MDP), numa experiência separada, utilizando um tubo de RMN de 5 milímetros preenchido com (i) um composto de fósforo de concentração conhecida, e (ii) a mesma haste de inserção coaxial utilizado em experiências PL ³¹ P RMN ( ver 7.3 e 7.9).
11. Calcular as concentrações de PL individuais com base nas áreas relativas dos sinais de PL, por um lado (ver 7.9), e no valor de calibração obtida a partir de MDPinserção coaxial do outro (ver 7.10). Levar em conta que o número de núcleos de fósforo que contribuem para um sinal de RMN ^{de 31} P em particular pode variar em função da origem do que o sinal molecular.
    NOTA: O sinal de fosfonato MDP (geralmente referenciado a 19,39 ppm) representa dois núcleos de fósforo, assim como o sinal de fosfato de cardiolipina. Todos os outros sinais de RMN ³¹ P PL detectados em extractos cerebrais representam um núcleo de fósforo cada.
12. Use um software de estatísticas conforme necessário para comparar os níveis de PL cerebrais entre os grupos de animais.

8 Desempenho do Experimento ¹ H RMN para Análise de solúvel em água metabólitos cerebrais

1. Definir a regulação da temperatura da sonda de RMN de ^1H para o valor alvo desejado (normalmente 25 ° C). Veja também observa em 7.1.
2. Centrifuga-se a solução de extracto aquoso em tubo de microcentrifugação (ver 6.5), a 4 ° C e 11.000xg por 30 min para girar resíduos sólidos na amostra. Transferir 600 uL de sobrenadante para um tubo de RMN de alta qualidade (diâmetro externo 5 mm),.
3. Transferência tubo de RMN de RMN ímã, calço e definir os parâmetros de aquisição de espectro de RMN para valores ideais, como explicado em 7,4-7,6. Ver também Tabela 1 para os valores de parâmetros recomendadas.
4. Defina o número de transientes por experimento para cerca de NS = 32 (duração total de aquisição de dados cerca de 13 min). Para obter boas relações sinal-ruído para sinais muito fracos, nomeadamente na região aromática, utilizar NS = 64 (duração total de aquisição de dados de cerca de 26 minutos) ou mais.
5. Após o final da aquisição de espectro, o processo de decaimento de indução livre (FID) utilizando parâmetros optimizados. Os valores destes parâmetros variar ligeiramente em função da força do campo magnético, a qualidade do calço, e o sinal de metabolito para ser quantificado.
   NOTA: Na maioria dos casos, é suficiente para processar cada espectro de uma vez, Empregando um conjunto de parâmetros de tratamento que apresentam um bom compromisso para todos os sinais de metabólitos. Ver Tabela 1 para os parâmetros de processamento característicos.
6. Quantificar a área de cada sinal de metabolito (muitas vezes um multipleto, por vezes, se sobrepõem com outras singletos ou multipletos decorrentes de moléculas diferentes), com respeito à área sob o sinal do composto de referência (TSP-d _4), no mesmo espectro.
7. Calcule as concentrações de metabólitos individuais com base em TSP-d ₄ concentração (ver 6.4). Levar em conta que o número de protões que contribuem para um sinal de RMN de ¹ H em particular pode variar em função da origem do que o sinal molecular. O sinal trimetil TSP-d ₄ (com referência a 0,0 ppm) representa nove prótons.
8. Use um software de estatísticas conforme necessário para comparar os níveis de metabólitos cerebrais entre os grupos de animais.

Resultados

Para obter melhor resolução em espectros de RMN metabólica do cérebro e outros extratos de tecidos, tem sido prática comum para remover ou íons máscara de metal (o mais importante: íons paramagnéticos) presentes em soluções de extractos. Isto foi conseguido através da adição de um agente quelante tal como o EDTA ou o extracto de CDTA ^19, ou fazendo passar o extracto através de uma resina de troca iónica, tais como Chelex-100 ^20. Os resultados apresentados na Figura 1

Discussão

Espectroscopia de RMN é um método eficiente para a medição de concentrações de compostos químicos em solução de um modo muito preciso e reprodutível. No entanto, a obtenção de dados de alta qualidade, é necessário obedecer a certas regras respeitantes à preparação e análise de amostras. Na determinação das concentrações do metabolito por espectroscopia de RMN, nem a geração ou a recepção do sinal de RMN domina o erro de quantificação, a menos que a intensidade de um sinal observado se aproxim...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913