Metabolomische Analyse von Rattenhirn Hohe Auflösung Kernresonanzspektroskopie von Gewebeextrakte

Zusammenfassung

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Zusammenfassung

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Einleitung

Mausmodelle sind weitgehend in der Hirnforschung ¹ verwendet worden. Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in Maus-und Rattenhirne durch das Studium der Genexpression auf RNA-und / oder Protein-Ebene auf der einen Seite auf die andere ^2-6 untersucht und morphologischen, funktionellen, elektrophysiologischen und / oder Verhaltens Phänotypen. Um jedoch die Mechanismen der Verknüpfung von Genotyp-Phänotyp zu vollständig zu verstehen, ist es unerlässlich, die molekularen Ereignisse hinter der Protein-Expression, dh zu untersuchen. der Stoffwechsel der biochemischen Substrate, auf denen Enzyme wirken ^7. Diese Anforderung führte in den vergangenen 10 bis 15 Jahren, zu einer Renaissance der Stoffwechselforschung in vielen Bereichen der Biologie ^8,9. Während klassische Stoffwechselstudien haben oft auf Details der besonderen Fachrichtungen ausgerichtet ist, wird die neue Metabolomics Ansatz einer umfassenden Untersuchung der globalen Stoffwechselprofil des Gewebes unter Berücksichtigung ausgerichtet.Eine Folge dieses Konzepts besteht ein offensichtlicher Bedarf für analytische Werkzeuge, die Ausrichtung auf bestimmte Stoffwechselwege und / oder Klassen von Verbindungen zu minimieren. Jedoch ist eine klassische biochemische Assays auf eine bestimmte chemische Reaktion eines spezifischen Analyten festgelegt werden, bevor der Test durchgeführt wird, die Bedürfnissen. Im Gegensatz dazu werden spektroskopische Techniken, wie kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) (i) zu bestimmten molekularen (physikalischen) Eigenschaften von biochemischen Verbindungen, bezogen von denen jede zu einem oder mehreren verschiedenen Signale in einem Frequenz im Verlauf eines Experiments erfasst; und (ii) erkennen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verbindungen pro Experiment.

So enthält jedes Spektrum die kombinierten Informationen über eine ganze Reihe von Stoffwechselprodukten. Aus diesem Grund, spektroskopische Verfahren sind geeignete Werkzeuge für metabolomics, da keine vorherige Selektion muss gemacht bezüglich der Art des Analyten zu messenden ⁸ . Als Folge sind diese Techniken natürlich eignen sich für Vorstudien, weil sie den Nachweis von unerwarteten Stoffwechseländerungen erheblich erleichtern.

Obwohl NMR und MS austauschbar für die Analyse von vielen Metaboliten verwendet werden, besitzt jedes Verfahren spezifische Vor-und Nachteile, die vor kurzem wurden bewertet ^10. Kurz gesagt, können NMR-Spektroskopie üblicherweise aus Rohextrakten durchgeführt werden und erfordert keine chromatographische Trennung der Probenverbindungen vor der Analyse erfordert. Im Gegensatz dazu arbeitet MS mit Gas oder Flüssigkeits-Chromatographie (GC oder LC) Trennung, mit Ausnahme insbesondere die jüngsten Entwicklungen wie der Massenspektrometrie Bildgebung. In einigen speziellen Fällen, wie die Analyse von Zucker, kann LC-Trennung eine Notwendigkeit für die NMR-Spektroskopie als auch geworden, weil die Resonanzlinien aus verschiedenen Zuckerarten überschneiden sich in den Proton ⁽¹ H)-NMR-Spektren. Dennoch, ¹ H-NMR-Spektroskopie ohne chromatographic Trennung bleibt die beliebteste, fast allgemein angewandte metabolomische NMR-Methode. Im Allgemeinen ist die Probenvorbereitung zeitaufwendig und komplex für MS, als es für NMR-Spektroskopie. Schwerwiegende Probleme auf Matrixeffekte sind viel in der NMR-Spektroskopie weniger verbreitet als in MS, wo sie deutlich gedämpften Signale führen. Metabolit Quantifizierung kann mit beiden Methoden erreicht werden. Jedoch werden mehrere Standardverbindungen für MS aufgrund von Variationen in Matrixeffekte und Ionisation Wirkungsgrade zwischen Metaboliten benötigt. Im Gegensatz dazu wird nur eine Standard pro Probe für ein NMR-spektroskopischen Analyse, weil unter geeigneten Messbedingungen erforderlich ist, ist das letztere Verfahren eigen quantitative dank der streng linearen NMR-Antwort von den Kernen beobachtet. Ein Hauptnachteil der NMR ist seine relativ geringe Empfindlichkeit. MS, insbesondere LC-MS, ist empfindlicher als NMR um mehrere Größenordnungen; Aus diesem Grund ist MS über NMR für das vorzuziehenAnalyse der Verbindungen in sehr geringen Konzentrationen auftreten. Andererseits ist die zerstörungsfreie Art der NMR-Experiment wird ein klarer Vorteil gegenüber MS; auf diese Weise NMR wiederholt an der gleichen Probe, beispielsweise für unterschiedliche NMR-aktiven Kernen, wie ¹ H, 31-Phosphor ⁽³¹ P), ^{Kohlenstoff-13} (13 C), durchgeführt werden kann, Fluor-19 (F ^19), etc., da kein Material durch NMR verbraucht im Gegensatz zu MS-Messungen.

Sowohl NMR-und MS kann in verschiedenen Modi verwendet werden, wobei jeder eine optimal für den Nachweis von Verbindungen mit bestimmten chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ist ³¹ P NMR oft besser als ¹ H-NMR für die Analyse der mäßig konzentrierten phosphorylierten Verbindungen, obwohl fast alle phosphorylierten Metaboliten Protonen enthalten. Jedoch kann ihre ¹ H-NMR-Signale durch ¹ H-NMR-Signale von anderen, nicht-phosphorylierten Verbindungen verdeckt werden, während die letzterenoffensichtlich nicht dazu führen, Hintergrundsignale in ³¹ P-NMR-Spektren. In einer analogen Situation ist ¹⁹ F-NMR-Analyse für fluorierte Verbindungen, beispielsweise fluorierte Medikamente (keine Hintergrundsignale von endogenen Metaboliten) bevorzugt werden, während der Spezialfall von ¹³ C-NMR von Interesse fast ausschließlich wenn das Schicksal von ¹³ C markierten exogenen metabolischen Vorstufen muss beachtet werden, aufgrund der extrem niedrigen natürlichen Häufigkeit des Isotops ¹³ C (ca. 1%). Viele Massenspektrometer arbeiten entweder in Negativ-Ionen-Modus oder positiven Ionenmodus. Daher ist es wichtig, vor der Analyse, ob die Ionen beobachtet werden negativ oder positiv geladen sein kennen. Wir konzentrieren uns hier auf ein Protokoll für die Analyse von Hirngewebe Metabolom durch ¹ H-und ³¹ P-NMR-Spektroskopie, da dieses Verfahren ergibt sich eine große Anzahl von wichtigen Metaboliten-Konzentrationen bei niedrigen Kosten in Form von (i) der Zeit für die Probenvorbereitung eine benötigtend (ii) Aufwand für Metabolit Quantifizierung erforderlich. Alle Experimente können unter Verwendung der Ausrüstung eines Standard-Nasschemielabor und einen hochauflösenden NMR-Spektroskopie-Anlage werden. Weitere Anforderungen sind in dem Protokoll weiter unten beschrieben.

Protokoll

HINWEIS: Tierethik RECHNUNG
Tierexperimentelle Studien an Ratten folgten die Leitlinien in Frankreich gültig ist, und wurden von der lokalen Ethikkommission (# 40.04, Universität Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankreich) genehmigt.

1. Ernte und Einfrieren Rattenhirn

1. Vorbereitung erforderlich: flüssiger Stickstoff (N _2liq.) In Dewar, die groß genug, um ein Einfrieren Klemme (mindestens 2-3 l Volumen) zu halten, ist; Narkose (zB Isofluran oder Ketamin / Xylazin); Anästhesie Kammer; sterilen Sektions Werkzeuge: chirurgische Schere, Skalpell, Pinzette; Erfrischungstüchern und Flasche mit Reinigungsalkohol (Ethanol); Nadeln (25 g); 1 ml und 10 ml Spritzen. Label Aluminiumplatten (ca. 10 x 10 cm) mit Klebeband. Verwenden Sie Blätter, einzelne gefriereingespannten Rattenhirnen zu wickeln.
   HINWEIS: Tragen Sie immer Schutzhandschuhe und Augenschutz Schutzbrille oder Maske beim Umgang mit flüssigem Stickstoff!
2. Füllen Dewar mit N _2liq. Und legen freizing Klemme in einem Dewar. Sicherstellen, dass die Menge an N in dem Dewar _2liq reicht für wiederholte Einfrier-Klemmverfahren (einige Liter, die Menge an N _2liq Verdampfen während jedes Gefrierspann hängt von der Größe der Klammer).
3. Betäuben Tier (zB durch Isofluran oder durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin-Mischung). Gehen Sie zur Sterbehilfe durch Herzpunktion, um Blutungen zu verhindern, wenn die Kopfhaut wird entfernt und Schädel geöffnet wird. Schritte 1,4-1,7 unten beschreiben dieses Standardverfahren.
   Hinweis: in speziellen Protokolle erfordern maximale Erhaltung von Glukose und Hochenergie-Metaboliten, Opfer Ratte von trichter Einfrieren des Gehirns des narkotisierten Tier mit N _2liq ¹¹ nach dem Zurückziehen der Kopfhaut. Dann sezieren Gehirn aus dem Schädel unter intermittierender N _2liq auf Post-mortem-Stoffwechsel ¹² zu minimieren.
4. Befeuchten Leiter der Ratte mit Reinigungsalkohol. Verwenden chirurgische Schere, um (i) remove Kopfhaut, und (ii) offenen Schädel entlang Schädelnähte.
5. Verwenden einer Pinzette, um weitere Schädel zu öffnen und ganze Gehirn von der Unterseite des offenen Schädel zu entfernen, die Positionierung der Kopf auf den Kopf. Schnell zu entfernen, keine sichtbaren Spuren von Blut mit Erfrischungstüchern. Wenn Hemisphären metabolisch und morphologisch symmetrisch, ist es zweckmäßig, eine der Halbkugeln für metabolische Analyse nach der Trennung von der anderen Halbkugel durch Schnitt mit dem Skalpell. Falls erforderlich, verwenden Sie die restlichen Hemisphäre für andere Hirnstudien wie Histologie.
6. Schnell zu entfernen, das Einfrieren von Klemme N _2liq -gefüllten Dewar, legen ganze oder halbe Rattenhirn auf einer Innenfläche, Klemme und sofort einfügen Einfrieren Klemme in N _2liq -gefüllten Dewar während Halteklammer fest zusammengedrückt. Stellen Sie sicher, dass die Schritte 1.3-1.6 nehmen nicht länger als 60 Sekunden.
7. Nach 1-2 min entfernen Einfrieren Klemme aus dem Dewar, offene Klemme lösen gefrorenen Hirngewebe von Klemme, und Wrapgefrorene Gewebe in entsprechend gekennzeichneten Aluminiumblech (siehe 1.1 oben). Stellen Sie sicher, dass das Etikett lesbar ist und bleibt fest an seinem Platz, nachdem die Probe gewickelt. Stellen schnell verpackte Probe in N _2liq. Führen die gesamte Verfahren so schnell wie möglich zu dem Auftauen von gefrorenen Gehirngewebe zu vermeiden.
8. Speichern gefrorene Probe in N _2liq oder in einem Gefrierschrank bei -80 ° C bis Metabolit Extraktion.
   HINWEIS: Wenn eine biologische Probe, die auf mehr als ein Jahr gelagert werden, ist Lagerung bei N _2liq Temperatur auf über 80 ° C bevorzugt werden. Dies gilt auch für den Rest dieses Protokolls.

2. Vorbereitung des Metaboliten Extraktionsverfahren

1. Vorbereitung Gewebehomogenisator und Anpassungsteströhrchen (beispielsweise 10 mm Innendurchmesser, je nach dem Durchmesser der Welle Homogenisator, üblicherweise aus Kunststoff). Verwenden Sie elektrische Homogenisatoren nicht manuell angetrieben Homogenisatoren (Gewebemühlen). Prepare Vortexer und Laborwaage.
2. Bereiten Eimer mit zerstoßenem Eis gefüllt. Halten Sie ausreichend quantitites Methanol, Chloroform und Wasser auf Eis (4 ml pro Tier 250-350 mg gefrorenem Hirngewebe).
3. Bereiten Pipetten und Fläschchen.
   1. Bereiten Glasfläschchen (≥20 ml Volumen) mit Schraubverschluss und auf Eis (eine Flasche pro Gewebeextrakt). Fit Schraubkappen mit einem Teflon-Septen resistent gegen Chloroform.
   2. Bereiten 5 ml Plastikpipetten zur Abgabe von Methanol und Wasser und Glaspipetten oder Hamilton-Spritzen zur Abgabe Chloroform. Bereiten Sie zusätzliche Kunststoffpipetten (5 oder 10 ml Volumen) für die Übertragung von Mischungen von Gewebehomogenat und Methanol.
   3. Stellen Sie sicher, alle Glaswaren gründlich mit destilliertem Wasser gespült und vor dem Gebrauch sorgfältig getrocknet, um Spuren von Verunreinigungen, insbesondere NMR detektierbaren Formiat und Acetat zu entfernen.
4. Füllen Porzellanmörser mit N _2liq, Ort Porzellan Stößel im Mörser und füllen mit N _2liq. Stickstoff verdampft, bis die Temperatur von Mörser und Stößel ausreichend niedrig ist. Halten Sie kleine Menge von N _2liq in Mörtel.

3. Extraktion von Metaboliten

1. Entfernen gefrorenen Gehirngewebeprobe aus dem Speicher (N _2liq Tank oder -80 ° C Tiefkühler). Dann sofort Gewebeprobe zu übertragen, um die teilweise mit N _2liq gefüllte Mörtel.
2. Verwenden Sie die N _2liq -Kalte Stößel, um den gefrorenen Hirngewebe in kleinere Stücke, die leicht in die Teströhrchen für Gewebehomogenisierung verwendet passen zu brechen. Um Stücke von gefrorenem Gewebe aus, die aus der Mörtel in den Prozess projiziert zu verhindern, brechen die Gewebe, während sie noch in Aluminiumfolie umhüllt. Gefrorenen Gewebe mahlen nicht zu Pulver, da dies Übertragung in das Teströhrchen erschweren (erhöhtes Risiko von Kondenswasserbildung) zu machen. WICHTIG: Während der gesamten Prozedur, fügen N _2liq wie notwendig, um die Probe tiefgefroren zu halten, um Mörtel.
3. Mix sMall Stücke von gefrorenem Hirngewebe gründlich, wiegen 250-350 mg und in ein Reagenzglas mit eiskaltem Methanol (4 ml für 250-350 mg Hirngewebe) gefüllt. Jedes Mal, wenn Stücke von gefrorenem Gewebe hinzu, homogenisieren diese sofort mit dem Gewebe-Homogenisator.
   HINWEIS: Füllen Sie dieses gesamte Verfahren schnell auf die Probe, die zu einer Überschätzung der Probengewicht führen würde, und (ii) Heizung und Auftauen der Probe zu vermeiden (i) erhebliche Kondensation von Wasser. Einzelnen Gewebestücke sollten in gefrorenem Zustand bei Beginn der Homogenisierung werden.
4. Nachdem das letzte Stück des gefrorenen Rattenhirn Probe in das Teströhrchen und homogenisiert wurde hinzugefügt, übertragen Sie die Homogenat zu einem ≥20 ml Volumen Glasfläschchen, in der Nähe Schraubverschluss und lassen Sie stehen auf Eis für 15 min. Wenn das Volumen des Teströhrchens ist nicht ausreichend groß für ≥4 ml Methanol, mit einem kleineren Volumen Methanol, um einen Teil des gefrorenen Gehirngewebe homogenisiert, die Masse in derGlasfläschchen und weiter Homogenisieren der Restgewebestücke mit frischem Methanol. Stellen Sie sicher, dass der Gesamt Methanol Volumen 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe.
5. Das gleiche Volumen eiskaltem Chloroform (dh 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe), um Homogenat, Vortex gründlich und lassen Sie stehen auf Eis für 15 min.
   HINWEIS: Verwenden Sie stets belüftet chemischen Abzugshaube beim Umgang mit flüchtigen Lösungsmitteln, insbesondere Chloroform!
6. Das gleiche Volumen an Wasser (dh 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe), um Homogenat, Vortex gründlich und stehen lassen bei -20 ° C über Nacht.

4. Vorbereitung der Phasentrennung und Lösungsmittelverdampfung

1. Bereiten kalten Zentrifuge (4 ° C, 13.000 g bei maximaler Radius) und Zentrifugenröhrchen. Sicherzustellen, dass die letzteren ≥20 ml Volumen, beständig gegen Chloroform und Fliehkräfte von 13.000 x g zu widerstehen. Verwenden Sie spezielle Glaszentrifugenröhrchen, sondern spülen (wie alle Glaswaren) mit destilliertem WasserVordergrund Verwendung (siehe 2.3).
2. Bereiten Sie gründlich gespült Glas Pasteur Pipetten und eine entsprechende propipettor (Birne, manuellen Pipette Pumpe, automatischen Pipette Hilfe / Pipette, etc.).
3. Vorbereitung weiterer zwei gründlich gespült Rohre (≥15 ml Volumen) pro Hirnprobe, die man braucht, beständig gegen Chloroform (aus Glas oder Teflon) sein, die andere zu Methanol (aus Kunststoff resistent gegen Methanol oder Glas).
4. Bereiten Lösungsmittelverdampfung Gerät (im Handel erhältlich oder Eigenbau). Damit diese Vorrichtung eine fein gesteuert Strom aus trockenem Stickstoffgas, das auf der Oberfläche einer Extraktlösung, die flüchtige Lösungsmittel (Methanol, Chloroform) gerichtet ist.
5. Bereiten Sie zwei zusätzliche Fächer oder Eimer mit Eis gefüllt: eine für den Probentransport auf Eis, und ein weiteres zur Aufbewahrung von Proben Kälte während des Verdampfungsprozesses.
6. Vorbereitung Lyophilisator (Gefriertrockner) und Materialien für die Lyophilisation notwendig: (i) eine 50ml-Zentrifugenröhrchen oder Vakuum-Rundkolben pro Extrakt, und (ii) N _2liq um die wässrige Phase der Proben (≤0.3 L pro Probe) einzufrieren. Wenn Zentrifugenröhrchen verwendet wird, auch Weithalsflasche Vakuumfilter geeignet für Gefriertrocknungsanlage vorzubereiten.

5. Phasentrennung und Lösungsmittelverdampfung

1. Für eine vollständige Phasentrennung, übertragen Sie die Methanol / Chloroform / Wasser / Hirn Gewebehomogenat (siehe 3.6) zu einer Chloroform-resistente Zentrifugenröhrchen (≥20 ml Volumen) und Zentrifuge bei 13.000 xg und 4 ° C für 40 min.
   HINWEIS: Zwei Phasen zu bilden, von einer Schicht ausgefällte Protein abgetrennt. Die untere (schwerere) Phase aus Methanol, Chloroform und gelösten Lipide, während die obere (leichtere) Phase aus Wasser, Methanol und gelöste wasserlöslichen Metaboliten.
2. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die obere Phase mit einem geeigneten ≥15-ml-Tube (Kunststoff resistent gegen Methanol, oder Glas) zu übertragen. Keep on ice.
3. Verwenden Sie eine frische Pasteur-Pipette, um die untere Phase zu einer entsprechenden ≥15-ml-Tube (Glas oder Teflon) zu übertragen. Halten Sie auf dem Eis.
4. Speichern der Schicht des ausgefällten Proteins bei -80 ° C, wenn es für die Bestimmung des Gesamtproteins zu verwenden ist; oder aber verwerfen.
5. Halten des Rohres mit der Wasser / Methanol-Phase (siehe 5.2) auf Eis und Methanol zu verdampfen, indem man einen trockenen Stickstoffstrom auf die Oberfläche der Extraktionslösung. Alternativ sanft Blase Stickstoff durch die Extraktlösung. Beenden Sie den Verdampfungsprozess, wenn Einleiten von Stickstoff führt nicht mehr Volumenreduktion in der Extraktionslösung. Zu dieser Zeit, fahren Sie mit der Gefriertrocknung (siehe 5.7), oder einfrieren und halten Probe bei -80 ° C mit der Röhre geschlossen (Schraubverschluss oder Parafilm), bis sie zur Gefriertrocknung.
6. Das Röhrchen mit dem Methanol / Chloroform-Phase (siehe 5.3) auf Eis und verdampfen Methanol durch Lenken eines trockenen Stickstoffstrom auf die sun-Schnittstelle der Extraktlösung. Wenn alle Lösungsmittel verdampft, den Prozess zu beenden und halten Sie die Probe bei -80 ° C mit der Röhre geschlossen (Schraubverschluss oder Parafilm), bis sie für die NMR-Analyse.
7. Bereiten wässrigen Phase für Gefriertrocknung
   1. Nach dem Ende der Methanolverdampfungsprozess (siehe 5.5), übertragen Sie die Probe auf eine gründlich gespült 50 ml Zentrifugenröhrchen (wenn die Probe eingefroren ist, Tauwetter vor der Übertragung). Alternativ Transfer zu einem Vakuum-Rundkolben.
   2. Gefriertextraktlösung durch Drehen Zentrifugenröhrchen (oder Rundkolben) teilweise in N _2liq eingesetzt, daß die innere Oberfläche des Rohrs oder der Kolben wird nach und nach durch gefrorene Flüssigkeit bedeckt. Sicherzustellen, dass keine N _2liq. Kann die Aufnahme geben.
   3. Wenn die gesamte Flüssigkeit gefroren ist, decken Sie die Röhre mit einem Deckel oder punktiert Schraubverschluss, damit der Dampf entweichen, und legen Sie den Schlauch in einer Weithalsflasche Vakuumfilter.
   4. Starten Sie nach der Gefriertrocknung attaching der Kolben oder einer Flasche auf den Gefriertrockner.
8. Beenden Sie den Gefriertrocknungsprozess, wenn die Probe vollständig trocken ist. Halten der Probe bei -80 ° C in einem geschlossenen Rohr (mit einem dichten Deckel!), Bis für die NMR-Analyse verwendet.
   HINWEIS: In der Regel nicht mehr als 24 Stunden sind für die Gefriertrocknung benötigt. Mehrere Proben können gleichzeitig lyophilisiert werden, abhängig von der Konstruktion der Lyophilisator und ob Zentrifugenröhrchen in Weithalsflaschen oder Rundkolben verwendet.

6. Herstellung von NMR-Proben

1. Speicher getrocknet und lyophilisiert Extrakte bei sehr niedriger Temperatur (≤ -80 ° C). Wieder aufzulösen Lyophilisate für die Vorbereitung der NMR-Proben unmittelbar vor NMR-Experiment.
   HINWEIS: Lagerung von Proben in Lösung und / oder nahe der Raumtemperatur kann im Probenabbau führen!
2. Vorbereitung einer wässrigen 200 mM Lösung des Chelatbildners, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), wie folgt:
   1. Fügen Sie reines Wasser (zB 20 ml) in ein Reagenzglas oder Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie die Menge an Pulver CDTA notwendig, eine 200 mM Lösung zu generieren.
      HINWEIS: Ein wesentlicher Teil der CDTA nicht löslich sein, da der pH-Wert ist sehr gering, da die Säureform CDTA wurde anstelle eines CDTA Salz verwendet.
   2. Vorsichtig, Schritt für Schritt, immer größere Mengen von CsOH Pulver auf die CDTA Lösung und Wirbel nach jeder Zugabe gründlich.
      HINWEIS: Die lösliche Fraktion CDTA mit zunehmender CsOH Gehalt in der wässrigen Lösung zu erhöhen. Vermeiden Sie "Übertitration", dh weniger hinzuzufügen als die stöchiometrische Menge CsOH auf die CDTA Lösung.
   3. Wenn nahezu alle CDTA Pulver aufgelöst ist, beginnen die Messung von pH nach jeder CsOH hinaus und gründliche Verwirbelung. Beenden CsOH hinaus, wenn der endgültige pH-Wert erreicht wird (Tabelle 1).
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden alle CDTA gelöst werden. Die Verwendung von Cs ⁺ als Gegenion CDTA ist generüber Na ⁺ oder K ⁺ Verbündeten bevorzugt. Cs ⁺ ist eine weiche Lewis-Säure aufgrund ihrer großen Ionenradius, im Gegensatz zu Na ⁺ und K ^+, die kleineren Ionenradien aufweisen und starke Säuren. Folglich Cs ⁺ Komplexe mit Phosphaten (harte Basen) weniger leicht als dies Na ⁺ und K ^+. Dies ist für die ³¹ P-NMR-Spektroskopie von phosphorylierten Metaboliten von Vorteil, weil Komplex neigt dazu, NMR-Linienbreiten insbesondere unter den Bedingungen der langsame Zwischenionenaustausch zu erhöhen.
3. ³¹ P-NMR-Analyse von Phospholipiden (PL), lösen getrockneten Lipide (siehe 5.6) in 700 ul eines Lösungsmittelgemisches aus deuteriertem Chloroform (CDCl _3), Methanol und CDTA-Lösung, hergestellt wie in 6.2 beschrieben (5: 4: 1 Volumenverhältnis). Die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Direkt Verschiebung (oder Verdrängungs) Mikropipette mit Chloroform-widerant-Tipps in beiden Schritten.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Änderung einer der folgenden Parameter wird das Aussehen (chemische Verschiebung und Linienbreiten) von PL ³¹ P-NMR-Spektren ^13-17 auswirken:
   (I) Volumenverhältnis _CDCI3: MeOH: CDTA Lösung
   (Ii) Gesamtlösungsmittelvolumen verwendet
   (Iii) pH-Wert der wässrigen Komponente des Lösungs
   (Iv) CDTA Konzentration der wässrigen Komponente des Lösungsmittels.
   HINWEIS: In der Regel die Feinabstimmung dieser Sample-Parameter (Tabelle 1) ist nicht notwendig und sollte mit äußerster Vorsicht, wenn in besonderen Fällen gewünscht durchgeführt werden. Ändern des Volumenverhältnis zwischen Lösemittel leicht zu der Bildung eines Systems, bestehend aus zwei Phasen statt einer homogenen Phase! Die Ein-Phasen-System wurde gefunden, daß praktischer als die Zwei-Phasen-System in den meisten Anwendungen ^13,14.
4. Für ¹ H-NMR-Analyse von wasserlöslichen Metaboliten, auflösen Lyophilisat (siehe 5.8) in 700 ul Deuteriumoxid (D ₂ O), enthaltend 3-(Trimethylsilyl) propionsäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz (TSPD ₄₎ im millimolaren Bereich (D ₂ O, das 0,05% TSPD ₄ ist im Handel erhältlich) . Die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Der pH-Wert der resultierenden wässrigen Extraktlösung auf 7,3 durch Zugabe von kleinen Mengen (ca. 2 ul) der Deuteriumchlorid (DCl) und Natrium deuteroxide (NaOD) Lösungen. Starten Sie zunächst mit 0,02 N DCl oder NaOD Lösungen. Wenn 2 oder 3 nachträglichen Erweiterungen nicht genügend pH-Änderung verursachen, mit 0,2 N DCl oder NaOD Lösungen fortzusetzen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu overtitrate.
   HINWEIS: Die Gesamtmenge der DCl oder NaOD-Lösung benötigt wird, hängt von der Menge an Hirngewebe extrahiert wurde; beachten Sie diesen Wert für die präzise Quantifizierung Metabolit. In den meisten Fällen sollten die kombinierten Mengen der zugesetzten DCL und NaOD Lösungen praktisch vernachlässigbar ist (in der Nähe von 1% des NMR-Probenvolumen).

itel "> 7. Performance der ³¹ P-NMR-Experiment für Hirn Phospholipid-Analyse ^13,14

1. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie ein hochauflösendes Multikern-NMR-Spektrometer (≥9.4 Tesla Feldstärke, entsprechend 162 MHz ³¹ P, 400 MHz oder ¹ H-Resonanzfrequenzen). Neben der Spule ³¹ P, sicherzustellen, dass die ³¹ P-NMR-Sonde besitzt eine Spule ¹ H-Protonenentkopplung. Set Temperaturregelung der NMR-Sonde zum gewünschten Zielwert (in der Regel 25 ° C).
   HINWEIS: Sondentemperatur muss 10-20 min zu stabilisieren!
2. Zentrifuge PL Extraktlösung in Mikrozentrifugenröhrchen (siehe 6.3) bei 4 ° C und 11.000 g für 30 min auf festen Rückstände in der Probe Spin-Down. Übertragen 600 ul des Überstands auf eine hochwertige NMR-Rohr (5 mm Außendurchmesser).
3. Vorbereitung entsprechenden koaxialen Einsatzschaft mit einer wässrigen 20 mM Methylendiphosphonat (MDP)-Lösung bei pH 7,0 für die chemische Verschiebung Referenzierung gefülltenund Quantifizierung. Dieses Insert in der NMR-Röhrchen mit PL-Extrakt-Lösung gefüllt.
4. Passen die NMR-Röhrchen mit dem entsprechenden Spinner und Transfer zum NMR-Magneten. Jetzt drehen die Probe bei 15-20 Hz und warten, bis die Probe auf die eingestellte Temperatur (ca. 10 min) eingestellt.
5. Vorsichtig minimiert magnetische Feldinhomogenität in Probe durch Einstellen auf der Achse und außerhalb der Achse Shim Spulenströme ^18.
6. Set-NMR-Spektrum Erfassungsparameter auf optimale Werte, die als Funktion der Magnetfeldstärke (für einen 9,4 T System, siehe Tabelle 1 für empfohlene Parameterwerte) variieren kann.
7. Legen Sie die Anzahl der Transienten pro Versuch (= NS).
   1. Set NS auf etwa 80 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 20 min), wenn nur die am weitesten verbreiteten PL sind mit Präzision quantifiziert werden (Phosphatidylcholin (PtdCho), Phosphatidylethanolamin (PtdEtn), Ethanolplasmalogen).
   2. Set NS etwa 100-200 (Gesamtlaufzeit von data Erwerb 1-2 h), wenn weniger konzentriert PLs werden quantifiziert werden (Alkyl-Acyl-Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure).
   3. Gesetzt, über NS 1500-2000 (Gesamtdauer der Datenerfassung 7-10 h; Nacht-Experiment), wenn sehr niedriger Konzentration PLs sind quantifiziert werden, zB Phosphatidylinositol Mono und Diphosphate (PtdIP und PtdIP _2), Cardiolipin, Lyso-PL , Alkyl-Acyl-Phosphatidylethanolamin und gelegentlich andere.
8. Nach dem Ende des Spektrums Erfassung, Prozess Free Induction Decay (FID) mit optimierten Parametern. Die Werte dieser Parameter als Funktion der magnetischen Feldstärke, Shim Qualität und der PL-Signal zu quantifizieren.
   1. Um die besten Ergebnisse für den gesamten Bereich der PL erhalten, wiederholen Sie die Verarbeitung mit mehreren (mindestens zwei) verschiedene Filterverfahren. Verwenden Sie starke Auflösungssteigerung bei stark überlappenden Signalen, zB., Für PtdCho und PtdEtnRegionen.
   2. Verwenden Sie starke Filterung (schwache oder gar keine Erhöhung der Auflösung) für schwache Signale.
   3. Filter sehr schwach und breite Signale ohne erhebliche Überschneidungen von Apodization (zB LB = 3 Hz), um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, zB PtdIP und PtdIP ₂ zu erhöhen. Siehe Tabelle 1 für charakteristische Verarbeitungsparameter.
9. Quantifizierung der Fläche jeder PL-Signal in Bezug auf die Fläche unter dem Signal der Referenz-Verbindung (MDP) im gleichen Spektrum.
10. Kalibrieren des Signals der Referenzverbindung (MDP) in einem separaten Experiment unter Verwendung eines 5 mm NMR-Röhrchens mit (i) einer Phosphorverbindung der bekannten Konzentration und (ii) die gleiche koaxiale Einsatzschaft in PL ³¹ P-NMR-Experimente eingesetzt gefüllt ( siehe 7.3 und 7.9).
11. Berechnen einzelnen PL Konzentrationen basierend auf relativen Flächen PL Signale einerseits (siehe 7.9), und auf Kalibrierungswert für MDP erhalten ausKoaxial-Einsatz auf der anderen (siehe 7.10). Berücksichtigt, die die Anzahl der Phosphorkerne Beitrag zu einem bestimmten ³¹ P-NMR-Signal kann als eine Funktion der molekularen Ursprungs des Signals variieren.
    HINWEIS: Der MDP Phosphonat Signal (üblicherweise 19,39 ppm referenziert) stellt zwei Phosphorkerne, wie die Phosphat-Cardiolipin-Signal. Alle anderen PL ³¹ P-NMR-Signale in Hirnextrakten nachgewiesen repräsentieren jeweils eine Phosphorkerns.
12. Statistik-Software verwenden, wie nötig, um Gehirn PL Ebenen zwischen Gruppen von Tieren zu vergleichen.

8. Leistung des ¹ H-NMR-Experiment zur Analyse von wasserlöslichen Metaboliten Gehirn

1. Set Temperaturregelung des ¹ H NMR-Sonde zum gewünschten Zielwert (in der Regel 25 ° C). Bemerkungen siehe auch unter 7.1.
2. Zentrifugieren Sie die Lösung in wässriger Extrakt Mikrozentrifugenröhrchen (siehe 6.5) bei 4 ° C und 11.000g für 30 min auf festen Rückstände in der Probe Spin-Down. Übertragen 600 ul des Überstands auf eine hochwertige NMR-Rohr (5 mm Außendurchmesser).
3. Transfer-NMR-Röhrchen zu NMR-Magneten, Shim und setzen NMR-Spektrum Aufnahmeparameter auf die optimalen Werte wie in 7,4-7,6 erläutert. Siehe auch Tabelle 1 empfohlen für Parameterwerte.
4. Die Anzahl der Transienten pro Experiment etwa NS = 32 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 13 min). Um einen guten Signal-Rausch-Verhältnisse für sehr schwache Signale, insbesondere im aromatischen Bereich zu erhalten, verwenden NS = 64 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 26 min) oder mehr.
5. Nach dem Ende des Spektrums Erfassung, Prozess Free Induction Decay (FID) mit optimierten Parametern. Die Werte dieser Parameter variieren leicht, als eine Funktion der magnetischen Feldstärke, Shim Qualität und des Metaboliten Signal zu quantifizieren.
   HINWEIS: In den meisten Fällen reicht es aus, jedes Spektrums einmal verarbeitenUnd beschäftigt eine Reihe von Verarbeitungsparametern präsentiert einen guten Kompromiss für alle Stoffwechselsignale. Siehe Tabelle 1 für charakteristische Verarbeitungsparameter.
6. Quantifizierung der Fläche der einzelnen Metaboliten Signal (oft ein Multiplett, manchmal Überschneidungen mit anderen Slips oder Multipletts aus verschiedenen Molekülen stammen) in Bezug auf die Fläche unter dem Signal der Referenzverbindung _(TSP-D-4) in der gleichen Spektrums.
7. Berechnen einzelnen Metabolitenkonzentrationen basierend auf TSP-d _{4-Konzentration} (siehe 6.4). Berücksichtigt, die die Anzahl der Protonen Beitrag zu einer insbesondere ¹ H-NMR-Signal kann als eine Funktion des Molekular Ursprung dieses Signals variieren. Die TSP-d ₄ Trimethyl Signal (bis 0,0 ppm referenziert) stellt neun Protonen.
8. Statistik-Software verwenden, wie nötig, um Hirnstoffwechselniveaus zwischen Gruppen von Tieren zu vergleichen.

Ergebnisse

Um beste Auflösung bei Stoffwechsel NMR-Spektren von Gehirn und anderen Gewebeextrakten zu erhalten, ist es schon lange üblich, zu entfernen oder Maske Metallionen (vor allem: paramagnetischen Ionen) in Extraktlösungen vorhanden. Dies wurde entweder durch Zugabe eines Chelatbildners wie EDTA oder CDTA dem Extrakt ^19, oder indem der Extrakt durch ein Ionenaustauschharz, wie Chelex-100 ²⁰ erreicht. Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser Schritt nicht für ...

Diskussion

NMR-Spektroskopie ist eine effiziente Methode zur Messung der Konzentration von chemischen Verbindungen in Lösung in einem sehr reproduzierbare und genaue Weise. Allerdings ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten es notwendig, bestimmte Vorschriften für die Probenvorbereitung und Analyse halten. Bei der Bestimmung der Metaboliten-Konzentrationen durch NMR-Spektroskopie, weder die Erzeugung noch der Empfang des NMR-Signals dominiert die Quantifizierungsfehler, sofern die Intensität des beobachteten Signals n?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913