Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Özet

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Özet

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Giriş

Murin modeller beyin araştırması ¹ yaygın olarak kullanılmıştır. Genotip-fenotip, diğer korelasyon ^2-6 üzerinde, bir yandan, RNA ve / veya protein seviyelerde gen ifadesinin inceleyerek fare ve sıçan beyinleri incelenmiş ve morfolojik fonksiyonel elektrofizyolojik ve / veya davranış fenotipleri edilmiştir. Ancak, tamamen genotipi ile fenotipi bağlayan mekanizmalarını anlamak için, o aşağı protein ifadesi, yani moleküler olayları araştırmak için zorunludur. enzimler ⁷ hareket bunun üzerine biyokimyasal substratların metabolizması. Bu gereklilik biyoloji ^8,9 birçok dalında metabolik araştırma rönesans için, son 10 ila 15 yıl içinde, yol açtı. Klasik metabolik çalışmalar genellikle belirli yolların ayrıntıları odaklanmış olsa da, yeni metabolomic yaklaşım göz altında dokusunun küresel metabolik profilinin her şeyi kapsayan bir soruşturma yönelikse.Bu kavram bir sonucu özel metabolik yolları ve / veya bileşiklerin sınıflarına karşı verevi en aza indirmek analitik araçlar için açık bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, klasik biyokimyasal analizi deneyi gerçekleştirilir önce belirtilmesi gereken belirli bir analit bir kimyasal reaksiyona dayanır. Bunun aksine, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ve kütle spektrometrisi (MS) (i) spektroskopik teknikler biyokimyasal bileşiklerin, özellikle molekül (fiziksel) özelliklerine dayanır her biri bir spektrum içinde bir ya da birden fazla farklı sinyal yol açar bir deney sırasında tespit edilmiştir; ve (ii), deney başına farklı bileşiklerin çok sayıda tespit eder.

Böylece, her bir spektrum metabolitlerin bir dizi kombine bilgileri içerir. Önceden seçme analitin doğası ile ilgili ⁸ ölçülecek yapılması gereken Bu nedenle, spektroskopik yöntemler, metabolitler için uygun araçlardır . Bunlar büyük ölçüde beklenmedik metabolik değişimlerin saptanmasını kolaylaştırmak için bir sonucu olarak, bu teknikler, doğal keşif çalışmaları kendilerini katmaktadır.

NMR ve MS spektroskopi birçok metabolitlerin analizi için birbirlerinin yerine kullanılabilir, ancak her iki yöntemle de avantaj ve yakın zamanda gözden geçirilmiştir ¹⁰ dezavantajları da vardır. Kısaca, NMR spektroskopi, genellikle kaba özütündeki gerçekleştirilebilir ve analizden önce örnek bileşiklerin kromatografik ayırmaya gerek yoktur. Buna göre, MS gibi kütle spektrometresi görüntüleme gibi belirli son gelişmelerin dışında, gaz veya sıvı kromatografisi (GC veya LC) ayrılması ile çalışır. Farklı şekerlerin rezonans hatları ^(1H) NMR spektrası, proton aktif rol oynamaktadır, çünkü bu tür şekerlerin analizi bir kaç özel durumda, LC ayırma, hem de NMR spektroskopi için bir zorunluluk olabilir. CHR olmadan Bununla birlikte, ^1H-NMR spektroskopisiomatographic ayırma en popüler, neredeyse evrensel uygulamalı metabolomic NMR yöntemi kalır. Genel olarak, bu numune hazırlama NMR spektroskopisi için olduğu gibi, MS daha zaman alıcı ve karmaşıktır. Matriks etkileri nedeniyle ciddi sorunlar çok onlar oldukça zayıflatılmış sinyallerine neden olabilir nerede MS daha NMR spektroskopisi az yaygındır. Metabolit niceleme Her iki yöntem ile elde edilebilir. Bununla birlikte, çoklu standart bileşiklerin, metabolitleri arasında matriks etkileri ve iyonizasyon verimliliği varyasyonlara MS için gereklidir. Buna karşılık, numune başına sadece bir standart için uygun ölçüm koşulları altında, bir NMR spektroskopisi ile analiz için gerekli olan, ikinci yöntem ise esas olarak gözlenen çekirdekleri tarafından kesinlikle lineer tepki NMR nicel sayesinde. NMR önemli bir dezavantajı nispeten düşük hassasiyettir. MS, özellikle LC-MS, büyüklük birkaç emir tarafından NMR daha duyarlıdır; Bu nedenle, MS için NMR fazla tercih edilmelidirçok düşük konsantrasyonlarda meydana gelen bileşiklerin analizi. Öte yandan, bir NMR deneyinde bozulmayan doğası MS üzerinde açık bir avantaj olan; Bu şekilde, örneğin ¹ H-NMR, fosfor-31 ⁽³¹ p), karbon-13 ⁽¹³ ° C), farklı NMR aktif çekirdekleri için, örneğin, aynı numune üzerinde tekrar tekrar yapılabilir flor-19 ⁽¹⁹ C) vb., MS ölçümleri karşı önemli bir NMR ile tüketilir gibi.

NMR ve MS hem farklı modlarda kullanılabilir, her biri özel bir kimyasal özelliklere sahip bileşiklerin tespit edilmesi için uygun olan. Hemen hemen tüm fosforlu metabolitleri de protonlar ihtiva eden, ancak, örneğin, ^31P NMR, genellikle orta konsantre fosforlu bileşiklerin analizi için ^1H NMR göre daha uygundur. Ancak, ^1H NMR sinyalleri ise ikinci, diğer fosforilatlanmamış bileşiklerinden ^1H NMR sinyallerinin tarafından gizlenmiş edilebilirAçıkçası ^31P NMR spektrumlarda arka plan sinyallerini neden olmaz. ^13C NMR özel durum neredeyse sadece ilgi ise analog durumda, ¹⁹ NMR analizi, florlanmış bileşikler, örneğin, florinlenmiş ilaçlar (endojen metabolit herhangi bir arka plan sinyalleri) için tercih edilecek ise ^{13 C} kaderi Eksojen etiketli metabolik ön yüzünden ¹³ C izotopu (yaklaşık% 1), son derece düşük bir doğal bolluğu, takip edilmelidir. Birçok kütle spektrometreleri da negatif iyon modunda ya pozitif iyon modunda ya da çalışır. Bu nedenle önümüzdeki iyonlar negatif veya pozitif yüklü hale gelen dikkat edilmesi olup analiz bilmek önemlidir. Bu yöntem örnek hazırlama a için gerekli (I) 'in zaman açısından düşük maliyetle önemli metabolit konsantrasyonları çok sayıda verir çünkü ^{1H ve31P} NMR spektroskopi ile beyin dokusu metabolome analizi için bir protokol burada odaknd, (ii) bir çaba metabolit miktarının belirlenmesi için gerekli. Bütün deneyler, standart bir ıslak-kimya laboratuvar ekipman ve yüksek resolüsyon NMR spektroskopisi odası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bundan başka değişiklikler aşağıdaki protokol kısmında açıklanmaktadır.

Protokol

NOT: HAYVAN ETİK BEYANI
Sıçanlarda Hayvan çalışmaları Fransa'da geçerli yönergeleri takip ve Yerel Etik Kurulu (# 40.04, Aix-Marseille Üniversitesi Tıp Fakültesi, Marsilya, Fransa) tarafından onaylanmıştır.

1. Hasat ve Rat Beyin Donma

1. Gerekli öğeleri hazırlayın: Sıvı azot (N _2liq.) Dewar bir dondurma kelepçe (en azından 2-3 L hacim) tutmak için yeterince büyük olduğunu; anestetik (örneğin, izofluran, ya da, ketamin / ksilazin); anestezi bölmesi; Steril diseksiyon araçları: cerrahi makas, neşter, forseps; doku mendil ve alkol (etanol) temizliği ile şişe; iğneler (25 g); 1 ve 10 ml şırıngalar. Yapışkan bant ile etiket alüminyum levhalar (yaklaşık 10 x 10 cm). Bireysel donuk-kenetli sıçan beyinleri sarmak için yapraklarını kullanın.
   NOT: Sıvı azot tutarken her zaman koruyucu eldiven ve göz koruyucu gözlük takılmalıdır!
2. N _2liq ile Dewar _doldurun. Ve ücretsiz yerBir Dewar vınlama kelepçe. Dewar N _2liq miktarı, tekrarlanan donma-kelepçe işlem için yeterli olduğundan emin olun (birkaç litre, her dondurarak toplanma esnasında buharlaşan K _2liq miktarı kelepçenin boyutuna bağlıdır).
3. (Izofloran ile, örneğin, ya bir ketamin / ksilazin karışımın peritoneal içi enjeksiyon ile) hayvan anestezisi. Kafa derisi kaldırılır ve kafatası açıldığında kanamayı önlemek için kalp ponksiyonu ile ötanazi geçin. Adımlar 1.4-1.7 aşağıdaki Bu standart prosedürü açıklar.
   NOT: huni-dondurma N ile anestezi hayvanın beyin glikoz ve yüksek enerjili metabolitler, kurban sıçan maksimum korunmasını gerektiren özel protokollerde kafa derisi geri çekilmeden sonra, ¹¹ _2liq. Sonra, otopsi metabolizmasını ¹² aza indirmek için aralıklı N _2liq altında kafatası dışarı beynini incelemek.
4. Alkol temizliği ile sıçan başını nemlendirin. (I) rem cerrahi makas kullanınove kafa derisi, kafatası ve dikişler boyunca (ii) açık kafatası.
5. Daha kafatasını açmak için forseps kullanın ve baş aşağı kafa konumlandırma, açık kafatası altından tüm beyin kaldırmak için. Hızlı doku mendil kullanarak herhangi bir kan izlerini çıkarın. Beyin hemisfer metabolik ve morfolojik simetrik iseniz, neşter ile kesi ile diğer yarımkürede ayıran sonra metabolik analiz için yarıkürelerinin birini kullanmak daha uygun olur. Gerekirse, bu histoloji gibi diğer beyin çalışmalar için kalan yarımkürede kullanın.
6. Çabuk kaldırmak Dewar N _2liq gelen kelepçe -filled dondurma, bir iç yüzeyi, kelepçe üzerine tüm veya yarım sıçan beyin yerleştirin ve hemen N _2liq içine kelepçe dondurma yerleştirin sıkıca sıkıştırılmış kelepçe tutarken Dewar -filled. O 1.3-1.6 60 saniye daha uzun sürer adımları emin olun.
7. Dewar, açık kelepçe 1-2 dk kaldır dondurma kelepçe sonra, dondurulmuş beyin kelepçe doku ve şal gevşetinşekilde etiketlenmiş alüminyum levha dondurulmuş doku (yukarıda 1.1). Etiket okunaklı ve numune sarılır sonra sıkıca kalır emin olun. Hızla N _2liq sarılı örnek yerleştirin. Dondurulmuş beyin dokusu çözülme önlemek için mümkün olduğunca çabuk tüm prosedürü uygulayın.
8. K _2liq bölgesi veya metabolit ekstre kadar -80 ° C'de bir dondurucuda donmuş numune saklayın.
   Not: bir biyolojik numune birden fazla yıl boyunca saklanabilir olduğunda, K _2liq sıcaklıkta depolama -80 ° C den daha çok tercih edilir. Bu da bu protokolün kalanı için de geçerlidir.

Metabolizma Ekstraksiyon Usulü 2. Hazırlık

1. Doku homojenleştirici ve uygun test tüpleri (, genelde plastikten yapılan bir homojenleştirici şaftının çapına bağlı olarak, örneğin, 10 mm iç çap) hazırlayın. Elektrik homojenizatörlerinin ziyade elle tahrik homojenizatörlerinin (doku öğütücüler) kullanın. Önvortexer ve laboratuvar dengesini pare.
2. Ezilmiş buz dolu kova hazırlayın. Buz (4 mi 250-350 mg dondurulmuş beyin doku başına her biri) ile, metanol, kloroform ve su arasında yeterli quantitites tutun.
3. Transferi pipetler ve şişeleri hazırlayın.
   1. Cam buz üzerinde vidalı kapakları ve yer ile şişeleri (≥20 ml hacim) (doku özü başına bir flakon) hazırlayın. Fit vida kloroform dayanıklı Teflon septumlarla bereler.
   2. Kloroform, metanol ve dağıtmak için su ve cam pipetler ya da şırıngalar Hamilton dağıtmak için 5 mi plastik pipet hazırlayın. Doku homojenatı ve metanol karışımları aktarılması için ilave bir plastik pipet (5 veya 10 ml hacim) hazırlayın.
   3. Tüm emin cam damıtılmış su ile iyice durulanmış ve dikkatli bir şekilde küçük miktarda yabancı maddeler, özellikle NMR tespit format ve asetat giderilmiş, kullanılmadan önce kurutuldu olduğundan emin olun.
4. Harç N _2liq, yer porselen havan tokmağı ile porselen havan doldurun ve N _2l ile dolduruniq. Havan ve tokmak sıcaklığı yeterince düşük olana kadar azot buharlaşır. Harç N _2liq az miktarda tutunuz.

METABOLİTLERİN 3. Ekstraksiyon

1. Depolama (N _2liq tank veya -80 ° C derin dondurucuda) dondurulmuş beyin doku örneği kaldırmak. Daha sonra, hemen N _2liq kısmen doldurulmuş bir harç doku örneği aktarın.
2. Kolayca doku homojenizasyon için kullanılan test tüpleri içine sığacak küçük parçalar halinde dondurulmuş beyin dokusu kırmak için N _2liq Soğuk havan tokmağı kullanarak. , Süreç içinde harcın dışarı yansıtılan dondurulmuş doku parçalarını engellemek hala alüminyum levha sarılı olurken doku kırmak için. Bu test tüpü daha zor (Su yoğunlaşması riski) transfer yapmak gibi toz dondurulmuş doku eziyet etmeyin. ÖNEMLİ: bütün prosedür boyunca, derin dondurulmuş örneği tutmak için gerekli harç N _2liq ekleyin.
3. Mix sİyice dondurulmuş beyin dokusu merkezi parçalar, 250-350 mg tartılır ve buz soğukluğunda metanol (250-350 mg beyin dokusu boyunca 4 mi) ile dolu bir deney tüpüne aktarılır. Dondurulmuş doku parçaları her zaman doku homojenleştirici ile homojenize, sözkonusu ilave edilir.
   NOT: numune ağırlığının hesaplanmasına yol açar ve numunenin (ii) ısıtma ve çözme olurdu numune üzerinde önemli su yoğunlaşmasını (i) kaçınmak için hızlı tüm bu yordamı tamamlayın. Bağımsız doku parçaları homojen hale getirme işleminin başlangıcında donmuş bir halde olması gerekir.
4. Donmuş sıçan beyin numunesinden son parçası test tüpüne homojenize eklenmiş sonra, ≥20 ml hacimli bir cam şişe, mevcut vidalı kapağa Homojenat transferi ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Test tüpünün hacmi ≥4 ml metanol için yeterince büyük değilse, için karışımın transfer dondurulmuş beyin dokusu homojenize bir parçası için daha küçük bir metanol hacmi kullanınCam şişe ve taze metanol ile kalan doku parçaları homojenize devam etmektedir. Toplam metanol hacmi 250-350 mg beyin dokusu başına 4 mi olduğundan emin olun.
5. İyice homojenat, girdaba buzla soğutulmuş kloroform (örneğin, 250-350 mg beyin dokusu başına 4 mi) aynı hacimde eklenir ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.
   NOT: özellikle kloroform, uçucu solventler tutarken her zaman havalandırılmış kimyasal kaputu kullanın!
6. Su aynı hacimde ekleme (örneğin, 250-350 mg beyin doku başına 4 mi) homojenat, girdaba iyice ve -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca bekletildi.

Faz Ayırma ve Solvent Buharlaşma 4. hazırlanması

1. Soğuk santrifüj (4 ° C, maksimum yarıçap 13.000 xg) ve santrifüj tüplerini hazırlayın. Kloroformda dirençli ≥20 ml hacim vardır ve 13,000 x g santrifüj kuvvetlerine dayanabilmesini sağlamak. Olmak damıtılmış su ile özel cam santrifüj tüplerini kullanın ama (bütün cam eşya gibi) durulamaön kullanım (2.3).
2. Iyice durulanır cam Pasteur pipetler ve uygun bir propipettor hazırlayın (ampul, manuel pipet pompası, otomatik pipet yardımı / pipeti, vb.).
3. (Cam veya teflon), kloroform dayanıklı olması gerekir ki, bir beyin ve numune başına iki ek tüp iyice çalkalandı (≥15 ml hacim), metanol (ya da cam dayanıklı plastikten yapılmış), metanol diğer bir hazırlayın.
4. (Ticari olarak temin edilebilir ya da homebuilt) çözücü buharlaştırma aparatı hazırlayın. Bu cihaz, uçucu çözücüler (metanol, kloroform) ihtiva eden bir ekstre çözeltisinin yüzeyine doğru yönlendirilir, kuru bir nitrojen gazı son derece kontrollü akışını sağlar emin olun.
5. Buz dolu iki ek tepsileri veya kova hazırlayın: bir örnek buz üzerinde taşıma, ve buharlaşma esnasında soğuk örnekleri tutmak için başka biri için.
6. , Liyofilizasyon için gerekli dondurarak kurutucunun (dondurarak-kurutucu) ve malzemelerin hazırlanması: (i) bir 50ml santrifüj tüpüne ya da vakum yuvarlak tabanlı bir şişe başına özü, ve (ii) K _2liq numune sulu fazın (numune başına ≤0.3 L), dondurulur. Santrifüj tüpü kullanıldığı takdirde, aynı zamanda liyofilizatör için müsait geniş boyunlu bir vakum filtre şişesi hazırlayın.

5. Faz Ayırma ve Solvent Buharlaşma

1. Tam faz ayrılması için 13,000 x g'da bir kloroform-dirençli bir santrifüj tüpüne (≥20 ml hacim) ve santrifüj (3.6) metanol / kloroform / su / beyin dokusu Homojenat transferi ve 40 dakika boyunca 4 ° C'de.
   Not: iki faz çöken protein, bir katman ile ayrılmış oluşturacaktır. Üst (açık) faz, su, metanol ve çözünmüş suda çözünür metabolitlerin yapı göstermiştir düşük (ağır) faz, metanol, kloroform ve eritilmiş lipid içerir.
2. Uygun bir ≥15 ml tüp (metanol dirençli plastik veya cam) için üst faz transfer etmek için bir Pasteur pipeti kullanılır. I devamce.
3. Uygun bir ≥15 ml tüp (cam ya da Teflon) için alt faz transfer etmek için yeni bir Pasteur pipeti kullanarak. Buz üzerinde tutun.
4. Toplam proteinin belirlenmesi için kullanılacak ise, -80 ° C de çökelmiş protein tabakası saklayın; ya da başka atın.
5. Buz üzerinde su / metanol fazı (5.2) ile birlikte tüpü tutmak ve ekstrakt çözeltisinin yüzeyi üzerine, kuru bir azot akımının yönlendirilmesi ile metanol buharlaştırılır. Seçenek olarak, özüt çözeltisi içinden kabarcık yavaşça azot. Nitrojen kabarması, artık ekstrakt çözeltisi hacmi düşüşe neden olduğu buharlaştırma işlemini iptal eder. Şu anda, liyofilizasyon ile devam eder (5.7), ya da dondurarak ve tüp kapatılmış liyofilizasyon için kadar (vidalı kapak veya Parafilm ™), -80 ° C'de örnek hazır tutar.
6. Buz üzerinde metanol / kloroform faz (5.3) ile tüp yerleştirin ve su'nun üzerine bir kuru azot akışı yönlendirerek metanol buharlaşmasıEkstre çözeltisi rface. Tüm çözücü buharlaştırılmış, işlemi sona erdirmek ve tüp kapatılmış NMR analizi için hazır oluncaya kadar (vidalı kapak veya Parafilm ™), -80 ° C'de örnek tutun.
7. Liyofilizasyon için sulu faz hazırlanır
   1. Metanol buharlaştırma işleminin sonunda (5.5) sonra, iyice durulandı, 50 ml bir santrifüj tüpüne örnek aktarmak (örnek donmuş ise, çözülme aktarım işlemi). Alternatif olarak, manyetik olarak karıştırılan bir vakuma aktarılır.
   2. Kısmen tüp veya şişenin iç yüzeyi kademeli dondurulmuş, sıvı tarafından örtülecek kadar K _2liq eklenir santrifüj tüpü (ya da yuvarlak bir şişeye) çevirerek özüt çözeltisi dondurun. Emin hayır N _{2liq olun.} Yuvasını girebilirsiniz.
   3. Bütün sıvı donduğunda buhar çıkışına imkan vermek için bir kapak veya delinmiş vidalı kapaklı tüp kapak ve geniş boyunlu bir şişede vakum filtre tüpü yerleştirin.
   4. Atta liyofilizasyondan sonra Başlangıçching dondurarak kurutma için şişe veya şişe.
8. Numune tamamen kuruduktan sonra liyofilizasyon işlemi iptal eder. Kapalı bir tüp içinde -80 ° C'de örnek tutun (sıkı bir kapaklı!) NMR analizi için kullanılana kadar.
   NOT: Genellikle en fazla 24 saat iyofilleşme ihtiyaç vardır. Çeşitli örnekler liyofilizatör tasarımına bağlı olarak, aynı zamanda liyofilize, geniş boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe veya şişeler içinde santrifüj tüpleri kullanılmaktadır konusunda edilebilir.

NMR örnekleri 6. hazırlanması

1. Mağaza kurutuldu ve çok düşük bir sıcaklıkta liyofilize ekstreleri (≤-80 ° C). NMR hemen önce deney NMR numunelerin hazırlanması için liyofilizatlar yeniden çözülür.
   Not: çözeltisi ve / veya oda sıcaklığı civarında numune numune saklama düşmesine neden olabilir!
2. Aşağıdaki gibi, kenetleme maddesi, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic asit (CDTA) sulu 200 mM'lik çözelti hazırlayın:
   1. Bir test tüpü veya bir santrifüj tüpüne saf su (örneğin, 20 mi) ilave edilir ve 200 mM'lik bir çözelti oluşturmak için gerekli olan CDTA toz miktarını ekleyin.
      Not: CDTA asit formu CDTA tuz yerine kullanılmıştır çünkü pH değeri çok düşük olması nedeniyle CDTA önemli bir kısmı, çözünür olmayacaktır.
   2. Dikkatlice ilave CDTA çözeltisine CsOH tozu artan miktarlarda, adım adım ve iyice vorteks her ilaveden sonra.
      Not: Çözünür CDTA fraksiyon, sulu çözelti içinde CsOH içeriği arttıkça artacaktır. Yani CDTA çözeltisine CsOH bir stoykiometrik miktarından daha az ekle "overtitration" kaçının.
   3. Neredeyse bütün CDTA toz eritilir, her ek CsOH ve tam bir vorteks sonra pH derecesi ölçülerek başlar. Nihai pH (Tablo 1) ulaşıldığında CsOH ilave sona erdirebilir.
      NOT: Bu anda, tüm CDTA eritilecektir. CDTA için bir karşı iyon olarak Cs ⁺ `nin kullanımı olup Jeneratörortağı, Na ⁺ veya K ⁺ fazla tercih edilir. Daha küçük iyonik yarıçapına sahiptir ve sert asitlerdir, Na ⁺ ve K ^{+ 'ya} karşı Cs ^+, geniş iyonlu yarıçapı nedeniyle yumuşak bir Lewis asididir. Sonuç olarak, Cs ⁺ form fosfatlar (sert bazlar) ile kompleksler daha az kolaylıkla Na ⁺ ve K ^+, yok. Kompleks, özellikle ara ürün iyon değişimi için yavaş koşulları altında, NMR Çizgi genişlikleri artırma eğilimi olduğundan, bu metabolitlerin fosforlu ^31P NMR spektroskopisi için avantajlıdır.
3. ^31P NMR fosfolipid analizi (PL) için, lipitler, kurutuldu _(CDCI3) deuteratlanmış kloroform içeren bir çözelti maddesi karışımının 700 ul (5.6) çözülür, metanol ve tarif edildiği gibi hazırlanan CDTA çözelti, 6.2 (5: 4: 1 hacim oranında). Bir mikrosantrifüj tüp örnek aktarın. Direkt deplasman (veya pozitif-deplasman) mikropipet kullanın kloroform-karşıHer iki aşamada da karınca ipuçları.
   NOT: Aşağıdaki parametrelerden herhangi değişen PL ³¹ P NMR spektrumları ^13-17 görünümünü (kimyasal kayma ve çizgi genişlikleri) etkileyeceğini unutmayın:
   (I) hacim oranı _CDCI3: MeOH çözeltisi CDTA
   (Ii) toplam çözücü hacmi kullanılan
   Çözücünün sulu bileşen (iii) pH,
   Çözücünün sulu bileşen (iv) CDTA konsantrasyonu.
   NOT: Bu örnek parametrelerinin genel, ince ayar (Tablo 1) gerekli değildir, ve özel durumlarda istenirse çok dikkatli yapılmalıdır yılında. Çözücü arasındaki hacim oranının değiştirilmesi kolaylıkla iki aşamada yerine homojen bir faz içeren bir sistemin oluşumuyla sonuçlanan! Tek fazlı sistem pek çok uygulamada ^13,14 iki fazlı bir sisteme göre daha kullanışlı olduğu bulunmuştur.
4. Suda çözünür metabolitlerin ¹ * H NMR analizi için, içinde liyofilizatı (5.8) çözülür 700 ul döteryum oksit 3-(trimetilsilil) ihtiva eden (D ₂ O)-propionik asit 2,2,3,3-d4-sodyum tuzu milimolar aralığında (TSPd _4), (D _2% 0.05 TSPd ₄ ihtiva eden ticari olarak temin edilebilir Ç) . Bir mikrosantrifüj tüp örnek aktarın.
5. Döteryum klorür (DCI) ve sodyum deuteroxide (NaOD) çözeltilerinin az miktarda (yaklaşık 2 | il) ilave edilerek 7.3 edilen sulu ekstre çözeltisinin pH ayarlayın. Öncelikle, 0.02 N DCI veya NaOD çözümleri ile başlar. 2 veya 3 sonraki eklemeler yeterli pH değişimine neden yoksa, 0.2 N DCI veya NaOD çözümleri ile devam ediyor. Overtitrate için dikkatli olun.
   NOT: Gerekli DCI veya NaOD çözeltinin toplam miktarı, ekstre edilmiş beyin dokusunun miktarına bağlıdır; hassas metaboliti kantitasyonunu bu değeri not alın. Çoğu durumda ilave DCI ve NaOD çözeltilerinin bir arada hacimleri (NMR numune hacmi yakın şekilde% 1), hemen hemen yok denecek kadar azdır.

Beyin fosfolipid Analizi ^13,14 için ³¹ P NMR Deneyi itle "> 7. Performans

1. En iyi sonuçları elde etmek için, (162 MHz ³¹ P veya 400 MHz ^1H rezonans frekanslarının tekabül eden ≥9.4 Tesla alan gücü), bir çok çekirdekli yüksek çözünürlüklü NMR spektrometre kullanılır. ^31P bobin yanı sıra, ^31P NMR sistemi proton ayırmayla bir ^1H bobin sahip olması. İstenen hedef değere (genellikle 25 ° C) NMR sonda ayarlayın sıcaklık ayarı.
   NOT: Sonda sıcaklığı dengelemek için 10-20 dakika gerekebilir!
2. Santrifüj PL ekstre, 4 ° C de bir mikrosantrfuj tübünde çözeltisi (6.3) ve 30 dakika boyunca 11,000 x g, numunedeki katı artıkları aşağı doğru dönmeye. Yüksek kaliteli bir NMR tüpü (5 mm dış çap) 600 ul süpernatan aktarın.
3. (MDP) çözümü kimyasal kayma referans için pH 7.0 sulu 20 mM metilendifosfonat dolu uygun koaksiyel uç kök hazırlayınve kantitasyon. PL ekstrakt çözeltisi ile doldurulmuş NMR tüpü içinde bu ekleme yerleştirin.
4. NMR mıknatısa uygun döndürücü ve transferi ile NMR tüpü takın. Şimdi 15-20 Hz örnek dönmeye ve örnek ayarlanan sıcaklık (yaklaşık 10 dakika) ayarlanabilir kadar bekleyin.
5. Dikkatle şim bobin akımları ¹⁸ ekseni ve off-eksen ayarlayarak numûnesindeki manyetik alan homojen olmayan minimize.
6. Bir manyetik alan gücü (9.4 tesla için, tavsiye edilen parametre değerleri için Tablo 1 'e bakınız) bir fonksiyonu olarak değişebilir optimum değerlere NMR spektrum elde etme parametrelerini ayarlar.
7. Deneyin (= NS) başına geçici Set sayısı.
   1. Ancak en yaygın PL hassas ile hesaplanır edilmesi durumunda yaklaşık 80 (verilerin elde edilmesi yaklaşık 20 dakika toplam süresi) NS ayarlayın (fosfatidilkolin (PtdCho), fosfatidiletanolamin (PtdEtn), etanolamin, plazmalojen).
   2. D yaklaşık 100-200 (toplam süresi NS Setata alıcı 1-2 saat) (alkil-asil-fosfatidilkolin, fosfatidilinositol, fosfatidilserin, fosfatidik asit) kantifiye edilmesi, daha az konsantre PL ise.
   3. Yaklaşık 1,500-2,000 kadar ayarlayın NS (veri toplama, 7-10 saat arasında toplam süresi gece boyunca deneyi) çok düşük konsantrasyon PL kantifiye edilmesi durumunda, örneğin, mono ve fosfatidilinositol difosfat (PtdIP ve PtdIP _2), kardiyolipin, lizo-PL , alkil-asil-fosfatidiletanolamin ve bazen diğerleri.
8. Spektrum elde edilmesi, iyileştirilmiş işlem parametreleri kullanılarak serbest indüksiyon bozulması (FID) 'nin sona ermesinden sonra. Manyetik alan kuvveti, ayar kalitesi ve PL sinyalinin bir fonksiyonu olarak ölçülebilir, bu parametrelerin değerleri değişir.
   1. Işleme birden kullanarak (en az iki) farklı filtreleme işlemlerini tekrarlayın, PL tüm aralığı için en iyi sonuçları elde etmek için. , Şiddetle örtüşen sinyaller için güçlü kararlılık geliştirmesini kullanın, örneğin., PtdCho ve PtdEtn içinbölgeleri.
   2. Zayıf sinyaller güçlü filtreleme (zayıf ya da hiç çözünürlük artışı) kullanın.
   3. Sinyal-gürültü oranını, örneğin, PtdIP ve PtdIP ₂ geliştirmek için önemli miktarda apodization üst üste (ör: LB = 3Hz) olmadan çok zayıf, geniş sinyaller Filtre. Karakteristik işleme parametreleri için Tablo 1'e bakınız.
9. Aynı spektrumda referans bileşiği (MDP) 'de sinyal altında alana göre her PL sinyalin alanını ölçmek.
10. ((I) bilinen bir konsantrasyonda bir fosfor bileşiği ve PL ^31P NMR deneylerinde kullanılan (ii) aynı eksenli uç sapı ile doldurulmuş bir 5 mm'lik NMR tüpü kullanılarak bir deneyde referans bileşik (MDP) 'sinyalini kalibre görmek 7.3 ve 7.9).
11. Bir yandan (7.9) üzerine PL sinyallerin göreli alanlarına göre bireysel PL konsantrasyonları hesaplayın, ve gelen MDP için elde kalibrasyon değeridiğer koaksiyel insert (7.10). Belirli bir ^31P NMR sinyalinin katkıda fosfor çekirdeklerin sayısı, bu sinyalin moleküler kökenli bir fonksiyonu olarak değişebilir dikkate alın.
    NOT: kardiyopilin fosfat sinyalini yaptığı gibi MDP fosfonat sinyali (genellikle 19.39 ppm başvurulan), iki fosfor çekirdekleri temsil eder. Beyin ekstreleri içinde tespit edilen tüm diğer PL ^31P NMR sinyalleri bir fosfor çekirdeği, her temsil eder.
12. Hayvan grupları arasındaki beyin PL düzeylerini karşılaştırmak için gerektiği gibi istatistik yazılımı kullanın.

Beyin Metabolitler Suda çözünür Analizi için ^1H NMR Deneyi 8. Performans

1. İstenen hedef değere (genellikle 25 ° C) ^1H NMR sonda ayarlayın sıcaklık ayarı. Ayrıca bkz 7.1 belirtiyor.
2. 4 ° C ve 11000 de mikrosantrifüj tüpüne (6.5), sulu ekstre çözeltisi santrifüj30 dakika boyunca x g, numunedeki katı artıkları aşağı doğru dönmeye. Yüksek kaliteli bir NMR tüpü (5 mm dış çap) 600 ul süpernatan aktarın.
3. NMR mıknatıs, pabucun ve 7,4-7,6 açıklandığı gibi uygun değerlere ayarlanır NMR spektrum satın alma parametreleri Transfer NMR tüpü. Önerilen parametre değerleri için ayrıca Tablo 1'e bakınız.
4. NS 32 (veri toplama yaklaşık 13 dk toplam süresini) = yaklaşık deney başına Transientlerin sayısını ayarlayın. Özellikle aromatik bölgede, çok zayıf sinyaller için iyi sinyal-gürültü oranları elde etmek için, NS veya daha fazla 64 (veri toplama yaklaşık 26 dk toplam süresini) = kullanın.
5. Spektrum elde edilmesi, iyileştirilmiş işlem parametreleri kullanılarak serbest indüksiyon bozulması (FID) 'nin sona ermesinden sonra. Manyetik alan kuvveti, ayar kalitesi ve metabolit sinyalinin bir fonksiyonu olarak ölçülebilir, bu parametrelerin değerleri biraz değişebilir.
   NOT: Bir çok durumda, bir kez, her bir spektrum işlemek için yeterlidir, Tüm sinyaller için metabolit iyi bir denge gösteren işlem parametreleri kullanılarak bir dizi. Karakteristik işleme parametreleri için Tablo 1'e bakınız.
6. Aynı spektrumda referans bileşiği _(TSP-d4) sinyaline altındaki alana göre (bazen farklı moleküllerden sonucu diğer tekli ya da çoklu ile üst üste, genellikle çoklu), her bir metabolit sinyalin alanını ölçmek.
7. TSP-d ₄ konsantrasyonuna dayanan bireysel metaboliti konsantrasyonları (6.4) hesaplayın. Belirli ^1H NMR sinyalinin katkıda proton sayısı, bu sinyalin moleküler kökenli bir fonksiyonu olarak değişebilir dikkate alın. (0.0 ppm başvurulan) TSP-d ₄ trimetil sinyal dokuz protonları temsil eder.
8. Hayvan grupları arasındaki beyin metabolit düzeylerini karşılaştırmak için gerektiği gibi istatistik yazılımı kullanın.

Sonuçlar

Özü çözümler mevcut: beyin ve diğer doku özleri metabolik NMR spektrumları iyi çözünürlük elde etmek için, uzun kaldırmak veya (paramanyetik iyonlar en önemlisi) maske metal iyonları yaygın bir uygulama olmuştur. Bu, ya da Chelex-100 ²⁰ gibi bir iyon alışveriş reçinesi ile özü geçirilerek, ekstre ^19, EDTA veya CDTA gibi bir kenetleme maddesinin ilave edilmesi yoluyla elde edilmiştir. Şekil 1'de sunulan sonuçlar, beyin ekstreleri dikkatli bir şekild...

Tartışmalar

NMR spektroskopisi, bir çok yeniden üretilebilir ve doğru bir şekilde çözelti içinde kimyasal bileşiklerin konsantrasyonlarının ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Ancak, yüksek kalitede veri elde etmek için bu örnek hazırlama ve analizleri konusunda belirli kurallara uymak gereklidir. Gözlemlenen bir sinyalin yoğunluğu algılama eşiğini (özellikle zayıf sinyal) yaklaşımları edilmiştir, NMR spektroskopi ile metabolit konsantrasyonlarının belirlenmesinde, üretim ya NMR sinyalinin alım d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913