Análisis de Metabolómica de cerebro de rata por Alta Resolución Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética de Extractos de Tejidos

Resumen

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Resumen

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introducción

Los modelos murinos han sido utilizados ampliamente en la investigación del cerebro ^1. Correlaciones genotipo-fenotipo han sido investigados en cerebros de ratón y de rata mediante el estudio de la expresión génica en el ARN y / o los niveles de proteína, por una parte, y fenotipos morfológicos, funcionales, electrofisiológicas y / o de comportamiento en el otro ^2-6. Sin embargo, para entender completamente los mecanismos que vinculan fenotipo a genotipo, es imperativo investigar los eventos moleculares aguas abajo de la expresión de proteínas, es decir. el metabolismo de los sustratos bioquímicos sobre la que actúan las enzimas ^7. Este requisito llevó, en los últimos 10 a 15 años, a un renacimiento de la investigación metabólica en muchas ramas de la biología ^8,9. Mientras que los estudios metabólicos clásicos a menudo se han centrado en los detalles de las vías específicas, el nuevo enfoque de metabolómica está orientada a una investigación que todo lo abarca del perfil metabólico global del tejido en estudio.Una consecuencia de este concepto es evidente la necesidad de herramientas de análisis que minimizan el sesgo hacia las vías y / o clases de compuestos metabólicos específicos. Sin embargo, un ensayo bioquímico clásico se basa en una reacción química particular de un analito específico que necesita ser especificado antes de que se realiza el ensayo. Por el contrario, técnicas espectroscópicas tales como resonancia magnética (NMR) nuclear y espectrometría de masas (MS) (i) se basan en propiedades moleculares particulares (físicas) de compuestos bioquímicos, cada uno de los cuales da lugar a una o varias señales distintas en un espectro detectado en el transcurso de un experimento; y (ii) detectar un gran número de diferentes compuestos por experimento.

Por lo tanto, cada espectro contiene la información combinada de toda una gama de metabolitos. Por esta razón, métodos espectroscópicos son herramientas adecuadas para la metabolómica, como ninguna selección previa necesita ser hecha en cuanto a la naturaleza del analito a medir ⁸ . Como consecuencia, estas técnicas se prestan naturalmente a los estudios exploratorios porque facilitan en gran medida la detección de cambios metabólicos inesperados.

Aunque la espectroscopia de RMN y MS se pueden utilizar indistintamente para el análisis de muchos metabolitos, cada método tiene ventajas y desventajas de que recientemente se han revisado ¹⁰ específicos. Brevemente, la espectroscopía de RMN se puede realizar generalmente a partir de extractos crudos y no requiere separación cromatográfica de los compuestos de la muestra antes del análisis. Por el contrario, MS funciona con gas o cromatografía líquida (GC o LC) de separación, a excepción de determinados acontecimientos recientes, como la imagen de espectrometría de masas. En unos pocos casos especiales, tales como el análisis de azúcares, separación de LC puede llegar a ser una necesidad para la espectroscopia de RMN, así, porque las líneas de resonancia de diferentes azúcares se solapan significativamente en protones ⁽¹ H) Los espectros de RMN. Sin embargo, ¹ H RMN espectroscopía sin chrseparación omatographic sigue siendo el método de RMN metabolómico más popular, casi universalmente aplicada. En general, la preparación de muestras es más largo y complejo para la EM que para la espectroscopía de RMN. Los problemas graves debido a los efectos de matriz son mucho menos comunes en la espectroscopia de RMN que en MS en los que pueden dar lugar a señales considerablemente atenuadas. La cuantificación de metabolitos puede lograrse con cualquiera de los métodos. Sin embargo, se necesitan múltiples compuestos estándar para la EM, debido a las variaciones en los efectos de matriz y la eficiencia de ionización entre metabolitos. Por el contrario, sólo se necesita un estándar por muestra para un análisis espectroscópico de RMN porque bajo condiciones de medición adecuadas, el último método es intrínsecamente gracias cuantitativos a la respuesta RMN estrictamente lineal por los núcleos observados. Un inconveniente importante de RMN es su sensibilidad relativamente baja. MS, en particular, LC-MS, es más sensible que la RMN en varios órdenes de magnitud; por esta razón, MS es preferible más de RMN para elanálisis de compuestos que se producen a concentraciones muy bajas. Por otro lado, la naturaleza no destructiva del experimento de RMN es una clara ventaja sobre MS; de esta manera, RMN se puede realizar varias veces sobre la misma muestra, por ejemplo, para diferentes núcleos-RMN activo tal como ¹ H, fósforo-31 ⁽³¹ P), carbono-13 (C ^13), flúor-19 ⁽¹⁹ F) etc., ya que ningún material se consume por NMR en comparación con las mediciones de EM.

Tanto RMN y MS se pueden emplear en diferentes modos, cada uno de ellos sea óptima para la detección de compuestos con características químicas particulares. Por ejemplo, ³¹ P RMN es a menudo más adecuado que ¹ H RMN para el análisis de compuestos fosforilados moderadamente concentradas, aunque casi todos los metabolitos fosforilados también contienen protones. Sin embargo, sus señales de ¹ H RMN pueden ser oscurecidos por ¹ H NMR señales de otros compuestos, no fosforilados, mientras que el segundoobviamente no causan señales de fondo en ³¹ P espectros de RMN. En una situación analógica, ¹⁹ F análisis de RMN es preferible para los compuestos fluorados, por ejemplo, medicamentos fluorados (no hay señales de fondo de metabolitos endógenos), mientras que el caso especial de ¹³ C RMN es de interés casi exclusivamente si el destino de ¹³ C precursores metabólicos exógenos marcados necesita ser seguido, debido a la extremadamente baja abundancia natural del isótopo ¹³ C (ca. 1%). Muchos espectrómetros de masas funcionan tanto en modo de ion negativo o modo de ion positivo. Por lo tanto, es importante saber de antemano el análisis de si los iones que se deben observar están cargados negativamente o positivamente. Nos centramos aquí en un protocolo para el análisis del metaboloma tejido cerebral por ¹ H y ³¹ P espectroscopía de RMN ya que este método se obtiene un gran número de concentraciones de metabolitos importantes a bajo costo en términos de (i) el tiempo necesario para la preparación de muestras de unnd (ii) el esfuerzo requerido para la cuantificación de metabolitos. Todos los experimentos se pueden realizar utilizando el equipo de un laboratorio húmedo química estándar y una instalación de espectroscopia de RMN de alta resolución. Otros requisitos se describen en la sección Protocolo de abajo.

Protocolo

NOTA: ANIMAL ÉTICA DECLARACIÓN
Los estudios en animales con ratas siguieron las directrices vigentes en Francia, y fueron aprobados por el Comité de Ética local (# 40.04, Universidad de la Escuela de Medicina Aix-Marseille, Marsella, Francia).

1. recolección y congelación de cerebro de rata

1. Preparar elementos necesarios: el nitrógeno líquido (N _2liq.) En Dewar que es lo suficientemente grande como para mantener una abrazadera de congelación (al menos 2-3 L de volumen); anestésico (por ejemplo, isoflurano, o ketamina / xilazina); cámara de la anestesia; herramientas de disección estériles: tijeras quirúrgicas, bisturí, fórceps; toallitas de tejido y botella con alcohol de limpieza (etanol); agujas (25 g); 1 ml y 10 ml jeringas. Hojas de etiquetas de aluminio (aproximadamente 10 x 10 cm) con cinta adhesiva. Utilice hojas para envolver los cerebros de ratas de congelación fijada individuales.
   NOTA: Siempre utilice guantes protectores y gafas de protección ocular o máscara al manipular el nitrógeno líquido!
2. Rellene Dewar con N _2liq. Y coloque libreabrazadera zing en un Dewar. Asegúrese de que la cantidad de N _2liq en el Dewar es suficiente para los procedimientos de congelación-clamp repetidas (varios litros; la cantidad de N _2liq evaporación durante cada congelación de sujeción depende del tamaño de la pinza).
3. Anestesie animal (por ejemplo, por isoflurano, o por inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina mezcla). Proceder a la eutanasia por punción cardiaca para prevenir el sangrado cuando se quita el cuero cabelludo y se abre el cráneo. Pasos 1.4-1.7 continuación describen este procedimiento estándar.
   NOTA: En los protocolos especiales que requieren la máxima preservación de la glucosa y los metabolitos de alta energía, rata sacrificio mediante un embudo de congelación el cerebro del animal anestesiado con N _2liq ¹¹ después de la retracción del cuero cabelludo. Entonces, diseccionar el cerebro fuera del cráneo bajo _2liq N intermitente para reducir al mínimo el metabolismo post-mortem ^12.
4. Humedezca la cabeza de rata con alcohol de limpieza. Con unas tijeras quirúrgicas a (i) remove cuero cabelludo, y (ii) el cráneo abierto a lo largo de las suturas craneales.
5. Utilice unas pinzas para abrir aún más el cráneo, y de quitar toda cerebro por debajo del cráneo abierto, colocando la cabeza hacia abajo. Quite rápidamente los rastros visibles de sangre utilizando toallitas de tejido. Si hemisferios cerebrales son metabólicamente y morfológicamente simétrica, es conveniente utilizar uno de los hemisferios para el análisis metabólico después de que lo separa del otro hemisferio por incisión con el bisturí. Si es necesario, utilice el hemisferio restante para otros estudios del cerebro tales como la histología.
6. Rápidamente eliminar congelación pinza de N _2liq, repleto Dewar, coloque todo o la mitad de cerebro de rata en una superficie interna, abrazadera e inserte inmediatamente congelación abrazadera en N _2liq, repleto Dewar mientras sostiene la abrazadera firmemente comprimido. Asegúrese de que los pasos 1.3-1.6 no puede durar más de 60 segundos.
7. Después de 1-2 min remove pinza congelación del Dewar, pinza abierta, aflojar el tejido cerebral congelado de pinza, y envolturatejido congelado en chapa de aluminio debidamente etiquetados (ver 1.1). Asegúrese de que la etiqueta sea legible y se mantiene firmemente en su lugar después de que se envuelve la muestra. Colocar rápidamente la muestra envuelta en N _2liq. Realice todo el procedimiento lo más rápidamente posible para evitar la descongelación del tejido cerebral congelado.
8. Guarde muestra congelada en N _2liq o en un congelador a -80 ° C hasta la extracción de metabolitos.
   NOTA: Siempre que una muestra biológica se va a almacenar durante más de un año, el almacenamiento a temperatura N _2liq es preferible a -80 ° C. Esto también se aplica al resto de este protocolo.

2 Preparación del procedimiento de extracción de metabolitos

1. Preparar homogeneizador de tejidos y los tubos de ensayo con las características determinadas (por ejemplo, 10 mm de diámetro interior, dependiendo del diámetro del eje de homogeneizador, por lo general de plástico). Utilice homogeneizadores eléctricos en lugar de los homogeneizadores impulsados ​​manualmente (molinillos de tejido). Prepare vórtice y balanza de laboratorio.
2. Preparar cubo lleno de hielo picado. Mantenga quantitites suficiente de metanol, cloroformo y agua en hielo (4 ml cada uno por 250-350 mg de tejido cerebral congelado).
3. Preparar pipetas de transferencia y viales.
   1. Preparar viales de vidrio (volumen ≥20 ml) con tapones de rosca y el lugar en el hielo (un vial al extracto de tejido). Coloque el tornillo tapas con un septum de teflón resistente a cloroformo.
   2. Preparar 5 ml pipetas de plástico para la distribución de metanol y agua, y pipetas de vidrio o jeringuillas Hamilton para la dispensación de cloroformo. Preparar pipetas de plástico adicionales (5 o 10 ml de volumen) para transferir las mezclas de homogeneizado de tejido y metanol.
   3. Asegúrese de que todos los objetos de vidrio se enjuaga a fondo con agua destilada y se seca cuidadosamente antes de su uso para eliminar trazas de impurezas, en particular formiato de RMN-detectable y acetato.
4. Rellene mortero de porcelana con N _2liq, lugar porcelana maja en el mortero y vuelva a llenar con N _2liq. El nitrógeno se evapore hasta que la temperatura del mortero y la maja es suficientemente baja. Mantenga pequeña cantidad de N _2liq en el mortero.

3. Extracción de metabolitos

1. Retire muestra de tejido cerebral congelado de almacenamiento (N tanque _2liq o -80 ° C congelador). Luego, transferir inmediatamente muestra de tejido al mortero parcialmente lleno con N _2liq.
2. Utilice la N _2liq maja -Frío para romper el tejido cerebral congelado en trozos más pequeños que caben fácilmente en los tubos de ensayo utilizados para la homogeneización de los tejidos. Para evitar que las piezas de tejido congelado de ser proyectada fuera del mortero en el proceso, romper el tejido sin dejar de ser envuelto en lámina de aluminio. No muela tejido congelado a polvo ya que esto haría que la transferencia al tubo de ensayo más difíciles (aumento del riesgo de condensación de agua). IMPORTANTE: A lo largo de todo el procedimiento, agregue N _2liq al mortero, según sea necesario para mantener la muestra ultracongelado.
3. Mix spiezas de centros comerciales de tejido cerebral congelado a fondo, pesan 250-350 mg y transfieren a un tubo de ensayo lleno de helado de metanol (4 ml para el tejido cerebral 250-350 mg). Se agregan cada vez que piezas de tejido congelado, homogeneizar estos de inmediato con el homogeneizador de tejidos.
   NOTA: completar todo este procedimiento rápidamente para evitar (i) la condensación significativa de agua en la muestra que daría lugar a una sobreestimación de la peso de la muestra, y (ii) calefacción y descongelación de la muestra. Individuales piezas de tejido deben estar en un estado congelado en el comienzo del proceso de homogeneización.
4. Después de la última pieza de la muestra de cerebro de rata congelado se ha añadido al tubo de ensayo y se homogeneizaron, transferir el homogeneizado a un vial de vidrio de volumen ≥20 ml, cerca de tapón de rosca y dejar reposar en hielo durante 15 min. Si el volumen del tubo de ensayo no es suficientemente grande para ≥4 ml de metanol, utilizar un volumen más pequeño de metanol para homogeneizar una parte del tejido cerebral congelado, transferir la mezcla a lavial de vidrio y continuar homogeneizando las piezas de tejido residuales con metanol fresco. Asegúrese de que el volumen total de metanol es de 4 ml por 250-350 mg de tejido cerebral.
5. Añadir el mismo volumen de cloroformo enfriado con hielo (es decir, 4 ml por 250-350 mg de tejido cerebral) al homogenado, mezclar bien y dejar reposar en hielo durante 15 min.
   NOTA: Utilice siempre la campana química ventilada al manipular disolventes volátiles, especialmente cloroformo!
6. Añadir el mismo volumen de agua (es decir, 4 ml por 250-350 mg de tejido cerebral homogeneizado a), mezclar bien y dejar reposar a -20 ° C durante la noche.

4 Preparación de separación de fases y evaporación del disolvente

1. Preparar centrífuga frío (4 ° C, 13.000 xga radio máximo) y tubos de centrífuga. Asegúrese de que estos últimos son ≥20 ml de volumen, resistente al cloroformo, y puede soportar fuerzas centrífugas de 13.000 x g. Utilice tubos de centrífuga de vidrio dedicados pero enjuague (como toda la vajilla de vidrio) con agua destilada seruso tanto (ver 2.3).
2. Preparar bien enjuagados pipetas Pasteur de vidrio y un propipettor apropiada (bombilla, bomba manual de pipeta, pipetas ayuda / pipeta automática, etc.).
3. Preparar dos tubos adicionales se aclararon a fondo (volumen ≥15 ml) por muestra de cerebro, uno de los cuales tiene que ser resistente a cloroformo (de vidrio o teflón), el otro a metanol (hecha de resistente a metanol, o de vidrio de plástico).
4. Preparar aparato de evaporación del disolvente (disponible comercialmente o de construcción casera). Asegúrese de que este dispositivo proporciona una corriente finamente controlada de gas nitrógeno seco que se dirige sobre la superficie de una solución de extracto que contiene disolventes volátiles (metanol, cloroformo).
5. Preparar dos bandejas adicionales o cubos llenos de hielo: una para el transporte de muestras en hielo, y otro para mantener las muestras frías durante el proceso de evaporación.
6. Preparar liofilizador (liofilizador) y los materiales necesarios para la liofilización: (i) un 50tubo de centrífuga ml o vacío matraz de fondo redondo por extracto, y (ii) _2liq N para congelar la fase acuosa de muestras (≤0.3 L por muestra). Si se utiliza tubo de centrífuga, también preparar en todo el cuello de la botella filtro de vacío adecuado para liofilizador.

5. separación de fases y evaporación del disolvente

1. Para la separación de fases completa, transferir el homogeneizado de tejido metanol / cloroformo / agua / cerebro (ver 3.6) a un tubo de centrífuga de cloroformo-resistente (volumen ≥20 ml) y se centrifuga a 13.000 xg y 4 ° C durante 40 min.
   NOTA: Dos fases se formarán, separadas por una capa de proteína precipitada. La fase inferior (más pesado) consta de metanol, cloroformo y lípidos disueltos, mientras que la fase superior (más ligero) consiste en agua, metanol y metabolitos solubles en agua disueltos.
2. Utilizar una pipeta Pasteur para transferir la fase superior a un tubo apropiado ≥15 ml (resistente a metanol plástico, o vidrio). Mantener en ice.
3. Utilizar una pipeta Pasteur fresco para transferir la fase inferior a un tubo ≥15 ml adecuado (vidrio o teflón). Mantener en hielo.
4. Almacenar la capa de proteína precipitada a -80 ° C si se va a utilizar para la determinación de proteína total; o de lo contrario desechar.
5. Mantenga el tubo con la fase agua / metanol (véase 5.2) en hielo y se evapora el metanol dirigiendo una corriente de nitrógeno seco sobre la superficie de la solución del extracto. Alternativamente, suavemente burbujear nitrógeno a través de la solución de extracto. Terminar el proceso de evaporación cuando burbujeo de nitrógeno ya no provoca la reducción del volumen de la solución del extracto. En este momento, continuar con la liofilización (véase 5.7), o congelar y mantener la muestra a -80 ° C con el tubo cerrado (tapón de rosca o Parafilm) hasta que esté listo para liofilización.
6. Colocar el tubo con la fase de metanol / cloroformo (ver 5.3) en hielo y se evapora el metanol dirigiendo una corriente de nitrógeno seco sobre la SUrface de la solución del extracto. Cuando se evaporó todo el disolvente, terminar el proceso y mantener la muestra a -80 ° C con el tubo cerrado (tapón de rosca o Parafilm) hasta que esté listo para el análisis de RMN.
7. Preparar fase acuosa para liofilización
   1. Después del final del proceso de evaporación de metanol (ver 5.5), transferir la muestra a un tubo de centrífuga de 50 ml completamente enjuagados (si la muestra se congela, descongelar antes de la transferencia). Alternativamente, transferir a un matraz de fondo redondo de vacío.
   2. Congelar solución de extracto girando tubo de centrífuga (o matraz de fondo redondo) parcialmente insertado en N _2liq de tal manera que la superficie interna del tubo o matraz se cubrió progresivamente por líquido congelado. Asegúrese de no _{2liq N.} Puede entrar en el receptáculo.
   3. Cuando se congela todo el líquido, cubrir el tubo con una tapa perforada o tapón de rosca para permitir que el vapor se escape, y colocar el tubo en un filtro de vacío botella de cuello ancho.
   4. Iniciar liofilización después attaChing el matraz o botella a la liofilizador.
8. Terminar el proceso de liofilización cuando la muestra es totalmente seco. Mantener la muestra a -80 ° C en un tubo cerrado (con una tapa apretada!) Hasta que se usaron para el análisis de RMN.
   NOTA: Por lo general no más de 24 horas se necesitan para la liofilización. Varias muestras se pueden liofilizar simultáneamente, dependiendo del diseño del liofilizador, y de si se usan tubos de centrífuga en botellas de cuello ancho o matraces de fondo redondo.

6. Preparación de las muestras de RMN

1. Tienda extractos se secaron y se liofilizó a temperatura muy baja (≤-80 ° C). Re-disolver liofilizados para la preparación de muestras de RMN inmediatamente antes de RMN experimento.
   NOTA: El almacenamiento de muestras en solución y / o cerca de la temperatura ambiente puede resultar en la degradación de la muestra!
2. Preparar una solución acuosa 200 mM del agente quelante, el ácido trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), como sigue:
   1. Añadir el agua pura (por ejemplo, 20 ml) a un tubo o tubo de ensayo de centrífuga, y añadir la cantidad de polvo CDTA necesario para generar una solución 200 mM.
      NOTA: Una proporción sustancial de CDTA no será soluble, debido a que el pH es muy bajo desde que se utiliza una forma ácida de CDTA en lugar de una sal de CDTA.
   2. Añadir con cuidado, paso a paso, el aumento de cantidades de polvo CsOH a la solución CDTA, y mezclar bien después de cada adición.
      NOTA: La fracción soluble CDTA aumentará con el aumento del contenido de CsOH en la solución acuosa. Evitar "overtitration", es decir, añadir menos de la cantidad estequiométrica de CsOH a la solución CDTA.
   3. Cuando se disuelve casi todo el polvo de CDTA, comenzar a medir el pH después de cada adición CsOH y agitación en vórtex a fondo. Terminar Además CsOH cuando el pH final se alcanza (Tabla 1).
      NOTA: En este momento, todo el CDTA se disolverá. El uso de Cs ⁺ como un contraión para CDTA es Generaliado preferido sobre Na ⁺ o K ^+. Cs ⁺ es un ácido de Lewis suave debido a su gran radio iónico, a diferencia de Na ⁺ y K ⁺ que tienen radios iónicos pequeños y son ácidos duros. En consecuencia, Cs ⁺ forma complejos con fosfatos (bases duros) con menos facilidad que hacer Na ⁺ y K ^+. Esto es ventajoso para ³¹ P espectroscopía de RMN de metabolitos fosforilados porque tiende a aumentar la formación de complejos anchos de línea de RMN, especialmente en condiciones de lento a intercambio iónico intermedio.
3. Para ³¹ P RMN análisis de fosfolípidos (PL), se disuelven lípidos secos (ver 5.6) en 700 l de una mezcla de disolventes que consiste en cloroformo deuterado _(CDCl3), metanol y la solución CDTA preparado como se describe en 6.2 (5: 4: 1 relación de volumen). Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga. Utilice-desplazamiento directo (o de desplazamiento positivo) micropipeta con cloroformo-resistirconsejos de hormigas en ambos pasos.
   NOTA: Tenga en cuenta que la modificación de cualquiera de los siguientes parámetros afectará a la apariencia (desplazamiento químico y anchos de línea) de PL ³¹ P espectros de RMN de ^{13 a 17:}
   (I) relación de volumen _CDCl3: solución CDTA: MeOH
   (Ii) el volumen total de disolvente utilizado
   (Iii) el pH del componente acuoso del disolvente
   (Iv) la concentración CDTA del componente acuoso del disolvente.
   NOTA: En general, ajuste fino de estos parámetros de la muestra (Tabla 1) no es necesario, y se debe realizar con sumo cuidado si se desea en casos especiales. Cambio de la relación de volumen entre los disolventes fácilmente da como resultado la formación de un sistema que consta de dos fases en lugar de una fase homogénea! El sistema de una sola fase se encontró que era más práctico que el sistema de dos fases en la mayoría de las aplicaciones de ^13,14.
4. Para análisis ^{de 1H} RMN de los metabolitos solubles en agua, disolver liofilizado (ver 5.8) en 700 l de óxido de deuterio _(D2O) que contiene de 3 (trimetilsilil) sal sódica del ácido propiónico-2,2,3,3-d4 (TSPD ₄₎ en el intervalo milimolar (D ₂ O que contiene 0,05% TSPD ₄ está disponible en el comercio) . Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga.
5. Ajustar el pH de la solución de extracto acuoso resultante a 7,3 mediante la adición de pequeñas cantidades (aproximadamente 2 l) de cloruro de deuterio (DCI) y soluciones de deuteroxide de sodio (NaOD). En primer lugar, comenzar con 0,02 N soluciones DCL o NaOD. Si 2 o 3 adiciones posteriores no causan cambio de pH suficiente, continúe con 0.2 N soluciones DCL o NaOD. Tenga cuidado de no overtitrate.
   NOTA: La cantidad total de solución DCl o NaOD necesario depende de la cantidad de tejido cerebral extraído; nota de este valor para la cuantificación de metabolitos precisa. En la mayoría de los casos los volúmenes combinados de las soluciones DCL y NaOD agregados deben ser prácticamente insignificante (cerca del 1% del volumen de la muestra de RMN).

itle "> 7. Rendimiento del Experimento ³¹ P RMN de cerebro Fosfolípido Análisis ^13,14

1. Para obtener los mejores resultados, utilice un espectrómetro de RMN de alta resolución multinuclear (≥9.4 Tesla intensidad de campo, lo que corresponde a 162 MHz ³¹ P, o 400 MHz ¹ H frecuencias de resonancia). Además de la bobina ³¹ P, asegúrese de que la sonda ^31P RMN posee una bobina de ^1H para el desacoplamiento de protones. Establecer regulación de la temperatura de la sonda de RMN de valor objetivo deseado (normalmente 25 ° C).
   NOTA: la temperatura de la sonda puede necesitar 10-20 min para estabilizar!
2. Centrifugar la solución PL extracto en tubo de microcentrífuga (ver 6.3) a 4 ° C y 11.000 xg durante 30 min a girar hacia abajo residuos sólidos en la muestra. Transferir 600 l del sobrenadante a un tubo de RMN de alta calidad (5 mm de diámetro exterior).
3. Preparar apropiado vástago de inserción coaxial lleno de un metilendifosfonato acuosa 20 mM de solución (MDP) a pH 7,0 para la referencia de desplazamiento químicoy cuantificación. Coloque esta inserto en el tubo de RMN lleno de solución de extracto de PL.
4. Montar el tubo de RMN con la ruleta y una transferencia apropiada al imán RMN. Ahora girar la muestra a 15-20 Hz y esperar hasta que la muestra se ha ajustado a la temperatura establecida (aproximadamente 10 min).
5. Cuidadosamente minimizar la falta de homogeneidad del campo magnético a través de la muestra mediante el ajuste en el eje y fuera del eje corrientes de bobina cuña ^18.
6. Establezca los parámetros de adquisición de espectro de RMN de valores óptimos, que pueden variar en función de la intensidad de campo magnético (para un sistema 9.4 T, consulte la Tabla 1 para los valores de los parámetros recomendados).
7. Establecer el número de transitorios por experimento (= NS).
   1. Establecer NS a unos 80 (duración total de la adquisición de datos ca. 20 min) si sólo los PLs más frecuentes deben ser cuantificado con precisión (fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolamina (PtdEtn), plasmalógeno etanolamina).
   2. Establecer NS a unos 100-200 (duración total de dadquisición ata 1-2 hr) si PLs menos concentradas están a cuantificarse (alquil-acil-fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico).
   3. Conjunto NS a aproximadamente 1,500-2,000 (duración total de adquisición de datos 7-10 hr; experimento durante la noche) si PLs de muy baja concentración son para ser cuantificado, por ejemplo, mono y difosfatos fosfatidilinositol (PtdIP y PtdIP _2), cardiolipina, liso-PLs , alquil-acil-fosfatidiletanolamina, y ocasionalmente otros.
8. Tras el final de la adquisición de espectro, proceso de decaimiento de inducción libre (FID) utilizando parámetros optimizados. Los valores de estos parámetros varían como una función de la fuerza del campo magnético, la calidad de cuña, y la señal de PL a ser cuantificada.
   1. Para obtener los mejores resultados para toda la gama de PLs, repetir de procesamiento utilizando múltiples (al menos dos) diferentes procedimientos de filtrado. Utilice mejora de resolución fuerte para señales fuertemente superpuestos, por ejemplo., Por PtdCho y PtdEtnregiones.
   2. Utilizar el filtro fuerte (débil o ninguna mejora de la resolución) para señales débiles.
   3. Filtra señales muy débiles y amplios sin solapamiento significativo por apodización (por ejemplo, LB = 3 Hz) para aumentar la relación señal a ruido, por ejemplo PtdIP y PtdIP _2. Ver Tabla 1 para los parámetros de procesamiento característicos.
9. Cuantificar el área de cada señal de PL con respecto al área bajo la señal del compuesto de referencia (MDP) en el mismo espectro.
10. Calibrar la señal del compuesto de referencia (MDP) en un experimento separado, utilizando un tubo de RMN de 5 mm lleno de (i) un compuesto de fósforo de concentración conocida, y (ii) el mismo tallo inserto coaxial utilizado en PL ³¹ experimentos de RMN P ( ver 7.3 y 7.9).
11. Calcular las concentraciones individuales PL basado en las áreas relativas de las señales de PL por un lado (véase 7.9), y en el valor de calibración obtenida para MDP desdeinserción coaxial en el otro (véase 7.10). Tener en cuenta que el número de núcleos de fósforo que contribuyen a una señal de RMN ³¹ P particular puede variar en función del origen molecular de esa señal.
    NOTA: La señal de fosfonato MDP (generalmente referenciado a 19,39 ppm) representa dos núcleos de fósforo, al igual que la señal de fosfato de cardiolipina. Todas las demás señales de RMN PL ³¹ P detectadas en extractos cerebrales representan un núcleo de fósforo cada uno.
12. Utilice software de estadísticas, según sea necesario para comparar los niveles cerebrales PL entre grupos de animales.

8. Realización del experimento ¹ H RMN para el análisis de agua-soluble metabolitos cerebrales

1. Establecer regulación de la temperatura de la sonda de ¹ H RMN de valor objetivo deseado (normalmente 25 ° C). Ver también las observaciones en 7.1.
2. Centrifugar la solución de extracto acuoso en tubo de microcentrífuga (ver 6.5) a 4 ° C y 11.000xg durante 30 min se detenga por residuos sólidos en la muestra. Transferir 600 l del sobrenadante a un tubo de RMN de alta calidad (5 mm de diámetro exterior).
3. Tubo de RMN Traslado al imán RMN, cuña y establecer los parámetros de adquisición de espectro RMN a valores óptimos como se explica en 7.4 a 7.6. Ver también la Tabla 1 para valores de los parámetros recomendados.
4. Establecer el número de transitorios por experimento a cerca NS = 32 (duración total de la adquisición de datos a aproximadamente 13 min). Para obtener una buena relación señal-ruido para señales muy débiles, en particular en la región aromática, utilice NS = 64 (duración total de adquisición de datos ca. 26 min) o más.
5. Tras el final de la adquisición de espectro, proceso de decaimiento de inducción libre (FID) utilizando parámetros optimizados. Los valores de estos parámetros varían ligeramente en función de la fuerza del campo magnético, la calidad de cuña, y la señal de metabolito a ser cuantificada.
   NOTA: En la mayoría de los casos, es suficiente para procesar cada espectro una vez, Empleando un conjunto de parámetros de procesamiento que presentan un buen compromiso para todas las señales de metabolitos. Ver Tabla 1 para los parámetros de procesamiento característicos.
6. Cuantificar el área de cada señal de metabolito (a menudo un multiplete, a veces se superponen con otros singletes o multipletes derivados de diferentes moléculas) con respecto al área bajo la señal del compuesto de referencia _(TSP-4 d) en el mismo espectro.
7. Calcular las concentraciones de metabolitos individuales basados ​​en _TSP-d4 concentración (ver 6.4). Tener en cuenta que el número de protones que contribuyen a una señal de RMN ¹ H particular puede variar en función del origen molecular de esa señal. La señal de trimetil _TSP-d4 (referenciado a 0,0 ppm) representa nueve protones.
8. Utilice software de estadísticas, según sea necesario para comparar los niveles de metabolitos cerebrales entre los grupos de animales.

Resultados

Para obtener mejor resolución en los espectros de RMN metabólica de cerebro y otros extractos de tejidos, se ha sido durante mucho tiempo una práctica común para eliminar iones o máscara de metal (lo más importante: iones paramagnéticos) presentes en soluciones de extracto. Esto se ha logrado ya sea mediante la adición de un agente quelante tal como EDTA o CDTA al extracto ^19, o haciendo pasar el extracto a través de una resina de intercambio iónico tal como Chelex-100 ^20. Los resultados ...

Discusión

Espectroscopía de RMN es un método eficiente para la medición de concentraciones de compuestos químicos en solución de una manera muy reproducible y precisa. Sin embargo, para obtener datos de alta calidad, es necesario cumplir con ciertas normas relativas a la preparación y análisis de muestras. En la determinación de las concentraciones de metabolitos por espectroscopía de RMN, ni la generación ni la recepción de la señal de RMN domina el error de cuantificación, a menos que la intensidad de una señal ob...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913