組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析

要約

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

要約

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

概要

マウスモデルは、脳研究¹において広く利用されている。遺伝子型-表現型相関は、他^2-6一方でRNAおよび/ ​​またはタンパク質レベルでの遺伝子発現、及び形態学的、機能的、電気生理学的および/ ​​または行動的表現型を研究することによって、マウスおよびラットの脳において研究されてきた。しかし、完全な遺伝子型と表現型の連結機構を理解するためには、下流のタンパク質の発現、 すなわち分子事象を調査するために不可欠である。酵素が^7を作用する際の生化学的基質の代謝。この要件は、過去10〜15年間で、生物学^8,9の多くの支店での代謝研究のルネサンスに、つながった。古典的な代謝の研究は、多くの場合、特定の経路の詳細に焦点を当ててきたが、新たなメタボロミクスアプローチが検討中の組織のグローバルな代謝プロファイルのすべての包括的な調査を目指している。この概念の1つの結果は、特定の代謝経路および/または化合物のクラスの偏りを最小限にする分析ツールが明らかに必要である。しかし、古典的な生化学的アッセイは、アッセイを行う前に指定する必要がある特定の分析物の特定の化学反応に基づいている。対照的に、核磁気共鳴（NMR）分光法および質量分析（MS）（i）のような分光技術は、生化学的化合物の特定の分子（物理的）特性に基づいて、それぞれがスペクトル中の1つまたはいくつかの別個の信号が生じる一つの実験の過程で検出された。および（ii）実験ごとに異なる​​多数の化合物を検出する。

このように、各スペクトルは、代謝物の全範囲を組み合わせた情報が含まれています。事前選択は測定されるべき分析物の性質について説明する必要がないので、このような理由から、分光学的方法は、メタボロミクスのための適切なツールである⁸ 。彼らは大幅に予想外の代謝変化の検出を容易にするため、結果として、これらの技術は、自然探索の研究に役立つ。

NMR分光法およびMSは、多くの代謝物の分析のために交換可能に使用することができますが、それぞれの方法は、最近^10日された特定の長所と短所を持っています。簡潔には、NMR分光法は、通常、粗抽出物から行うことができ、分析の前にサンプル化合物のクロマトグラフ分離を必要としない。対照的に、MSは、質量分析イメージングのような特定の最近の発展を除いて、ガスまたは液体クロマトグラフィー（GCまたはLC）分離で動作する。異なる糖の共振線路は、プロトン^（1 H）NMRスペクトルにおいて有意に重なるので、そのような糖の分析のようないくつかの特殊なケースでは、LC分離は、同様にNMR分光法のための必需品となってもよい。 CHRのないそれにもかかわらず^、1 H NMR分光法omatographic分離は最も人気のある、ほぼ普遍的に適用されたメタボロミクスNMR法のまま。一般的に、サンプル調製は、NMR分光法の場合よりもMSのためのより多くの時間がかかり、複雑である。マトリックス効果に起因する深刻な問題は、彼らが大幅に減衰された信号につながる可能性があり、MSに比べてNMR分光法であまり一般的である。代謝産物の定量は、いずれの方法で達成することができる。しかし、複数の標準化合物に起因代謝産物間のマトリックス効果及びイオン化効率の変動にMSのために必要とされる。適切な測定条件で、後者の方法は本質的に観察された核によって厳密に線形NMR応答を定量的おかげであるため、これとは対照的に、試料ごとに1つの標準は、NMR分光分析に必要とされる。 NMRの主な欠点は、その比較的低い感度である。 MSは、特定のLC-MSで、数桁NMRよりも敏感である。この理由のために、MSは、NMRのために好まれるべきである非常に低い濃度で存在する化合物の分析。一方、NMR実験の非破壊的性質は、MSを超える明確な利点である。このように、NMRは^、1 H、リン^31（31 P）、炭素^13（13 C）、フッ素^-19（19 F）などの異なるNMR活性核のために、 例えば 、同じサンプルを繰り返し実行することができるなど 、MS測定とは対照的にない物質がNMRによって消費されないように。

NMRおよびMSの両方が異なるモードで使用することができ、それぞれが特定の化学的特性を有する化合物の検出のために最適である。ほとんど全てのリン酸化された代謝物はまた、プロトンを含んでいますが、例えば^、31 P NMRは、多くの場合、適度に集中し、リン酸化化合物の分析のための¹ H-NMRより適しています。後者はしかし、それらの¹ H NMRシグナルは、他の、非リン酸化化合物の¹ H NMRシグナルによって不明瞭にすることができる明らかに³¹ P NMRスペクトルにバックグラウンド信号は発生しません。 ¹³ C NMRの特別な場合は、ほぼ独占的に重要である一方、アナログ状況では^、19 F NMR分析は、フッ素化化合物、 例えば 、フッ素化剤（内因性代謝からのない背景信号）のために好ましいことがあるかの¹³ Cの運命により¹³ C同位体（ 約 1％）の非常に低い天然存在度に、続いする必要がある外因性の代謝前駆体を標識した。多くの質量分析計は、陰イオンモードまたは陽イオンモードのいずれかで動作します。したがって、観察されるイオンは正または負に帯電しているかどうかを先に分析知ることが重要である。この方法は、低コストで重要な代謝物濃度の多数を生じるので、私たちはサンプル調製aのに必要な（i）の時間的に¹ Hおよび³¹ P NMR分光法による脳組織のメタボロームを分析するためのプロトコルに焦点を当てるND（ⅱ）の努力は、代謝物の定量のために必要。全ての実験は、標準的な湿式化学実験室の装置および高分解能NMR分光機能を用いて行うことができる。さらなる要件は、以下のプロトコルの項に記載されている。

プロトコル

注：ANIMAL倫理声明
ラットに対する動物研究は、フランスで有効なガイドラインに従って、地元の倫理委員会（＃40.04、エクス·マルセイユ大学医学部、マルセイユ、フランス）により承認された。

1収穫と凍結ラット脳

1. 必要な項目を準備し、液体窒素_（。のN _2liq）デュワー内の凍結クランプ（少なくとも2-3のLボリューム）を維持するのに十分な大きさである。麻酔薬（ 例えば 、イソフルラン、またはケタミン/キシラジン）;麻酔チャンバー;無菌解剖ツール：外科用ハサミ、外科用メス、鉗子;組織ワイプクリーニングアルコール（エタノール）とボトル;針（25 G）; 1ミリリットルと10ミリリットルの注射器。粘着テープとラベルアルミニウムシート（ 約 10×10センチ）。個別の凍結クランプされたラットの脳をラップするシートを使用してください。
   注：液体窒素を取り扱う際は、必ず保護手袋および眼の保護ゴーグルやマスクを着用！
2. N個の_2liqとデュワーを満たします_。、自由に置くデュワー内の熱意クランプ。デュワー内のN _2liqの量が（;各凍結クランプ中に蒸発するN個の_2liqの量は、クランプの大きさに依存する数リットル）を繰り返し凍結クランプ手続きのために十分であることを確認してください。
3. （ 例えば 、イソフルランによる、またはケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射により）、動物を麻酔。頭皮を除去し、頭蓋骨を開いたときに、出血を防ぐために心臓穿刺により安楽死に進みます。 手順以下の1.4から1.7には 、この標準的な手順について説明します。
   注：漏斗凍結Nで麻酔動物の脳をすることによって、グルコースと高エネルギーの代謝物、犠牲ラットの最大保存を必要とする特別なプロトコルでは、頭皮の後退後に¹¹ _2liq。そして、死後の代謝^12を最小化するために断続的なN個の_2liq下頭蓋骨から脳を解剖。
4. アルコールをクリーニングして、ラットの頭部を湿ら。 （ⅰ）レムに外科用ハサミを使用してくださいオベ頭皮と​​頭蓋縫合に沿って（ii）のオープン頭蓋骨。
5. さらに頭蓋骨を開くために鉗子を使用し、上下逆さまにヘッドを位置決め、オープン頭蓋骨の下から脳全体を削除する。迅速組織ワイプを用いて血液の目に見える痕跡を削除します。脳半球の代謝的及び形態学的に対称である場合には、外科用メスで切開することにより、他の半球からそれを分離した後、代謝解析のための半球のいずれかを使用するのが便利である。必要であれば、そのような組織学などの他の脳研究のために、残りの半球を使用しています。
6. すぐに削除デュワーがN _2liqからクランプを-filled凍結、1内面、クランプに全体またはハーフラット脳を置き、すぐにN個の_2liqにクランプを凍結挿入しっかりと圧縮されたクランプを保持しながら、デュワーを-filled。それは1.3〜1.6は、もはや60秒よりかかる手順ないことを確認します。
7. 1-2分後、デュワーからオープンクランプをクランプを凍結除去クランプから凍結した脳組織を緩め、ラップ適切に標識されたアルミニウムシートでの凍結組織（上記1.1参照）。ラベルが判読可能であり、サンプルがラップされた後、所定の位置にしっかりと留まることを確認してください。すぐにN個の_2liqに包まれたサンプルを配置します。凍結した脳組織の融解を避けるために、可能な限り迅速に全体の手順を実行します。
8. 代謝物抽出まで-80℃でのN _2liqまたは冷凍庫で凍結されたサンプルを保管してください。
   注：生物学的サンプルは一年以上保存されるたびに、N個の_2liq温度での貯蔵は-80℃よりも好ましいことである。また、これは、このプロトコルの残りの部分に適用されます。

代謝物の抽出手順の調製

1. 組織ホモジナイザーと一致する試験管（、通常はプラスチック製のホモジナイザーシャフトの直径に応じて、例えば 、内径10mmなど）を準備する。電気ホモジナイザーではなく、手動で駆動さホモジナイザー（組織グラインダー）を使用します。前ボルテックスおよび実験室のバランスを削減する。
2. 砕いた氷で満たされたバケツを用意します。 （250-350 mgの凍結した脳組織につき各4ミリリットル）氷上でメタノール、クロロホルムと水の十分なquantititesしてください。
3. ホールピペット及びバイアルを準備します。
   1. 氷上でスクリューキャップと場所（組織抽出液ごとに1つのバイアル）でガラスバイアル（≥20容）を準備します。クロロホルムに耐性テフロンセプタムスクリューキャップを取り付けます。
   2. クロロホルムを分配するためのメタノールと水、そしてガラスピペットまたはハミルトンシリンジを分配するための5ミリリットルのプラスチックピペットを準備します。組織ホモジネートおよびメタノールの混合物を移送するための追加のプラスチックピペット（5または10ミリリットル容積）を準備。
   3. すべてのガラス器具は、蒸留水で十分にすすぎ、慎重に微量の不純物、特に、NMR検出可能なギと酢酸を除去するために、使用前に乾燥されていることを確認します。
4. モルタル中のN _2liq、場所の磁器の乳棒で磁器モルタルを充填し、N個の_{2リットル}を補充IQ。乳鉢と乳棒の温度が十分に低くなるまで窒素が蒸発する。乳鉢でN個の_2liq少量にしてください。

代謝物の3。抽出

1. ストレージ（N個の_{2liqタンク}や-80℃の冷凍庫）から凍結した脳組織のサンプルを削除します。その後、すぐに部分的にN個の_2liqで満たさ乳鉢に組織サンプルを移す。
2. 簡単に組織の均質化のために使用した試験管に収まる小さな部分に凍結した脳組織を破壊するために、N _2liq -cold乳棒を使用してください。それでもアルミシートに包まれながら、プロセスでモルタルの外に投影されてから凍結した組織片を防止するために、組織を破壊する。 （結露のリスク増加）試験管への転送がより困難になるだろう。このような粉末に凍結組織を粉砕しないでください。重要：手順全体を通して、深い凍結したサンプルを維持するために必要な乳鉢にN個の_2liqを追加します。
3. ミックスS凍結した脳組織のモール片は完全に、氷冷メタノール（250-350 mgの脳組織のために4ml）で充填された試験管に250-350 mgの転送を量る。凍結組織片が追加されるたびに、組織ホモジナイザーで直ちにこれらを均質化する。
   注：回避するために、すぐにこの全体の手順を実行します（i）のサンプルのサンプル重量、及び（ii）加熱融解を過大評価につながる試料上の水の著しい結露。個別の組織片は、均質化プロセスの開始時に凍結状態にあるべきである。
4. 凍結ラット脳サンプルの最後のピースは、試験管、均質化に追加された後、≥20容のガラスバイアル、近いスクリューキャップにホモジネートを転送し、氷上で15分間放置。試験管の体積が≥4mlのメタノールために十分に大きくない場合、この混合物を移す、凍結脳組織の一部を均質化するために小さいメタノールボリュームを使用するガラスバイアルと、新鮮なメタノールで残留組織片をホモジナイズ続ける。総メタノール体積が250-350 mgの脳組織あたり4 mlであることを確認してください。
5. 徹底的ホモジネート、渦への氷冷クロロホルム（ すなわち 、250〜350 mgの脳組織あたり4 ml）と同じボリュームを追加し、15分間氷上に放置。
   注：特にクロロホルム、揮発性溶剤を取り扱う際には、必ず換気された化学フードを使用する！
6. 同体積の水を追加します（ つまり 、250〜350 mgの脳組織あたり4 ml）のホモジネート、ボルテックスに徹底的に、-20℃で一晩放置する。

相分離し、溶媒を蒸発させる4。準備

1. 冷たい遠心（4℃、最大半径で13000×g）で遠心管を準備します。後者はクロロホルムに耐性≥20容、であり、13000×gでの遠心力に耐えることができていることを確認してください。なり、専用のガラス製遠心管を使用したが、蒸留水で（すべてのガラス製品など）すすぎフォアの使用（2.3参照）。
2. 十分に洗浄したガラスパスツールピペットおよび適切propipettor（電球、手動ピペットポンプ、自動ピペットエイド/ピペッター、 等 。）を準備します。
3. クロロホルムに耐性である必要がある一方は脳試料、（ガラスまたはテフロン製）当たり2つの付加的な十分に洗浄チューブ（≥15容）を調製し、（メタノール、或いはガラスに対して耐性プラスチック製）メタノール他方。
4. （市販または自家製）溶媒蒸発装置を準備します。この装置は、揮発性溶剤を含む抽出液の表面上に向けられる乾燥窒素ガス（メタノール、クロロホルム）の細かく制御ストリームを提供することを確認してください。
5. 氷上でのサンプル輸送のための1、および蒸発プロセスの間に冷たいサンプルを維持するための別の1：氷で満たされた二つの追加トレイやバケツを用意します。
6. 凍結乾燥機を準備します（凍結乾燥機）を、凍結乾燥のために必要な材料は、（i）1 50mlの遠心管または真空の丸底フラスコあたりエキス、及び（ii）Nの_2liqは、サンプルの水相（試料当たり≤0.3L）を凍結した。遠心管を使用する場合、また凍結乾燥に適したワイドネック真空濾過瓶を準備。

5。相分離し、溶媒を蒸発させる

1. 完全な相分離のために、13000×gで40分間、4℃のクロロホルム耐性遠心管（≥20容）と遠心分離機にメタノール/クロロホルム/水/脳組織ホモジネートを（3.6参照） を転送します。
   注：2相は、沈殿したタンパク質の層によって分離され、形成することになる。アッパー（軽い）相は水、メタノール、溶解している水溶性の代謝物で構成され、一方、より低い（重い）相が、メタノール、クロロホルム、溶解させた脂質で構成されています。
2. 適切な≥15mlチューブ（メタノールに耐性プラスチックまたはガラス）に上相を転送するためにパスツールピペットを使用してください。私にしてくださいCE。
3. 適切な≥15mlのチューブ（ガラスまたはテフロン）に下相を転送するために、新鮮なパスツールピペットを使用してください。氷の上に保管してください。
4. それは総タンパク質の決定のために使用される場合、-80℃で沈殿したタンパク質の層を保存;あるいは破棄します。
5. 氷の上で水/メタノール相（5.2を参照）でチューブを保持し、抽出液の表面上に乾燥窒素流を流すことにより、メタノールを蒸発させる。代わりに、静かにバブル窒素抽出液を通して。窒素バブリングはもはや抽出液中の体積減少を引き起こしたときに蒸発プロセスを終了していない。この時、凍結乾燥を続行（5.7を参照）、またはチューブを-80℃でサンプルを凍結し、凍結乾燥の維持のための準備ができるまで（スクリューキャップまたはパラフィルム）を閉じた。
6. 氷の上でメタノール/クロロホルム相（5.3参照）でチューブを配置し、suの上に乾燥窒素流を流すことにより、メタノールを蒸発させる抽出液のデータポート。すべての溶媒を蒸発すると、プロセスを終了し、チューブを閉じた状態でNMR解析のための準備ができるまで（スクリューキャップまたはパラフィルム）-80℃でサンプルを維持する。
7. 凍結乾燥のための水相を調製
   1. メタノールの蒸発プロセスの終了（5.5を参照）した後、十分に洗浄した50ml遠心チューブにサンプルを移す（この試料を凍結した場合、解凍転写前）。別の方法として、真空丸底フラスコに移す。
   2. 部分的にチューブまたはフラスコの内面が漸次凍結された液体によって覆われるように、Nの_2liqに挿入された遠心分離管（又は丸底フラスコ）を回転させることによって抽出液を凍結する。わからないN個の_2liqを行います_。レセプタクルを入力することができます。
   3. すべての液体が凍結されると、蒸気を逃がすためにパンクした蓋またはスクリューキャップ付きチューブをカバーし、広いネック真空フィルターボトルにチューブを配置します。
   4. アタ後に凍結乾燥を開始チン凍結乾燥機にフラスコまたはボトル。
8. サンプルが完全に乾燥している時に、凍結乾燥プロセスを終了します。 NMR分析に使用するまで（タイトキャップ付き！）、閉じたチューブ内で-80℃でサンプルを保管してください。
   注：通常せいぜい24時間、凍結乾燥のために必要とされる。いくつかのサンプルは、凍結乾燥機の設計に応じて、同時に凍結乾燥し、広口瓶または丸底フラスコ中で遠心管を使用するかどうかにすることができる。

NMR試料の6。準備

1. 店舗で乾燥させ、非常に低温で凍結乾燥された抽出物（≤-80°C）。 直ちに NMR実験の前に、NMR試料を調製するための凍結乾燥物を再溶解させる。
   注：溶液中および/または室温付近での保存サンプルは、サンプルの劣化を生じ得る！
2. 以下のように、キレート剤、トランス-1,2 - cyclohexyldiaminetetraacetic酢酸（CDTA）の水性200mMの溶液を調製する。
   1. 試験管や遠心管に純水（ 例えば 、20 ml）を追加し、200 mM溶液を生成するのに必要なCDTA粉末の量を追加する。
      注：CDTAの酸形態がCDTA塩ではなく、使用されたことから、pHが非常に低いので、CDTAのかなりの割合は、水溶性ではありません。
   2. 慎重に徹底的に各添加後CDTA溶液、および渦にCsOHを粉末の量を増加、段階的に追加する。
      NOTE：CDTA可溶性画分は、水溶液中のCsOH含量の増加と共に増加する。 「overtitration」を避け、 すなわち CDTA溶液にCsOHを、化学量論量よりも少ないを追加します。
   3. ほぼすべてのCDTA粉末が解散されたときは、各CsOHを添加および徹底的なボルテックスした後のpHの測定を開始。最終的なpHは（ 表1）に達したときにCsOHを追加を終了します。
      注：この時点では、すべてのCDTAは解散いたします。 CDTAに対する対イオンとしてのCs ⁺を使用することはGENERです同盟国のNa ⁺またはK ⁺よりも好ましい。小さ ​​いイオン半径を有し、硬い酸でのNa ⁺とK ⁺とは対照的に、Csの^+は 、その大きなイオン半径によるソフトルイス酸である。あまり容易に行うことのNa ⁺およびK ⁺よりリン酸塩（ハード塩基）との結果として、CS ⁺複合体を形成する。複合体形成は、特に中間イオン交換に遅い条件下で、NMR線幅を増加させる傾向があるので、これはリン酸化された代謝物の³¹ P NMR分光法のために有利で ​​ある。
3. 4：1、リン脂質（PL）の³¹ P NMR分析のために、5（乾燥重クロロホルム（CDCl ₃中）からなる溶媒混合物の700μlの脂質（5.6を参照） を 、メタノールおよび6.2に記載のように調製CDTA液を溶解する体積比）。マイクロチューブにサンプルを移す。レジストクロロホルムで直接変位（または容積）マイクロピペットを使用してください両工程におけるアリヒント。
   メモ：以下のパラメータのいずれかを変更すると、PL ³¹ P NMRスペクトル^13-17の外観（化学シフトや線幅）に影響することに注意してください：
   （ⅰ）体積比_を CDCl _3：メタノール：CDTAソリューション
   （ⅱ）全溶媒量使用
   （iii）は、溶​​媒の水性成分のpH
   溶剤の水性成分の（ⅳ）CDTA濃度。
   注：これらのサンプルパラメータの一般的な微調整（ 表1）は不要であり、特別な場合には、所望であれば、細心の注意を払って行われるべきでは。溶媒の体積比を変更すると、簡単に1つではなく均一相の二相からなる系の形成をもたらす。一相系は、ほとんどのアプリケーション^13,14の二相系よりも実用的であることが見出された。
4. 水溶性代謝物の¹ H NMR分析のために、（5.8を参照）で凍結乾燥物を溶解ミリモルの範囲で3-（トリメチルシリル）プロピオン-2,2,3,3-d4の酸ナトリウム塩（TSPD _4）を含有する700μlの重水（D ₂ O）（TSPD ₄ 0.05％Tween20を含むD ₂ Oは市販されている） 。マイクロチューブにサンプルを移す。
5. 重水素ライド（DCL）とナトリウム重水素（NaOD中）ソリューション、少量（ 約 2μl）を加えることによって7.3に得られた水性抽出液のpHを調整する。まず、0.02 NのDClまたはNaOD中のソリューションで始まります。 2または3に続く追加が十分なpH変化を起こさない場合は、0.2 NのDClまたはNaOD中のソリューションを続行します。 overtitrateないように注意してください。
   注：必要なのDClまたはNaOD中の溶液の全体量は、抽出された脳組織の量に依存する。正確な代謝物の定量のために、この値を確認します。ほとんどの場合、追加のDClとNaOD中のソリューションを組み合わせたボリュームは（NMR試料量の1％に近い）事実上無視できるはずです。

脳リン脂質の分析^13,14のための³¹ P NMR実験のitle "> 7。パフォーマンス

1. 最良の結果を得るために、（162メガヘルツ³¹ P、または400MHzの¹ H共鳴周波数に対応する、≥9.4テスラの磁場強度）多核高分解能NMR分光計を使用する。 ³¹ Pコイルのほかに^、31 P NMRプローブは、プロトンデカップリングのため^の1 Hコイルを有していることを確認してください。所望の目標値へのNMRプローブのセット温度調節（通常25°C）。
   注：プローブの温度が安定化するために10〜20分を必要とするかもしれない！
2. 遠心分離機PLエキス、4℃でマイクロ遠心チューブ内の溶液（6.3を参照）、30分間11000×gで、試料中の固体残留物をスピンダウンします。高品質のNMR管（5ミリメートル、外径）に上清の600μlのを転送します。
3. 化学シフト参照のためのpH 7.0の水性20mMのメチレンジ（MDP）溶液で満たし、適切な同軸挿入ステムを準備および定量。 PL抽出液で満たされたNMR管中でこの挿入を置きます。
4. NMR磁石に適切なスピナーと転送したNMRチューブを取り付けます。今15〜20 Hzでサンプルを回転し、サンプルが設定温度（ 約 10分）に調整されるまで待ちます。
5. 注意深くシムコイル電流¹⁸軸上および軸外調整することにより、サンプルを横切る磁場不均一性を最小限に抑える。
6. 磁場強度の関数として変化し得る最適値、（9.4 Tシステムのために、推奨パラメータ値については表1を参照）NMRスペクトル取得パラメータを設定する。
7. 実験ごとのトランジェントのセット数（= NS）。
   1. 唯一の最も普及しているのPLは、高精度で定量される場合、約80（データ収集、約 20分の合計時間）にNSを設定します（ホスファチジルコリン（PtdCho）、ホスファチジルエタノールアミン（PtdEtn）、エタノールアミンプラスマローゲン）。
   2. dは約100〜200（合計期間にNSを設定してくださいATA取得1〜2時間）低濃度のPLは、（アルキル - アシル - ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジル酸）定量することになる場合。
   3. （データ収集7-10時間の合計時間、一晩実験）約1,500〜2,000にNSを設定し、非常に低濃度のPLを定量しようとする場合、 例えば、ホスファチジルイノシトールモノと二リン酸（PtdIPとPtdIP _2）、カルジオリピン、リゾ-PLS 、アルキル - アシル - ホスファチジルエタノールアミン、時には他。
8. スペクトル取得、最適化されたパラメータを使用して、プロセス自由誘導減衰（FID）の終了後。これらのパラメータの値は、磁界強度、シムの品質、及び定量化するためにPL信号の関数として変化する。
   1. plsは複数の（少なくとも2）異なるフィルタリング手順を使用して繰り返し処理の全範囲のための最良の結果を得るためには。 たとえば 、強く重なった信号のための強力な分解能向上を使用します。、PtdChoとPtdEtnのために地域。
   2. 弱い信号のための強力なフィルタリング（弱いか無い解像度向上）を使用します。
   3. アポダイゼーションによってかなりの重複がなく、非常に弱く、ブロードなシグナルをフィルタリングし、信号対雑音比、 たとえば PtdIPとPtdIP _2を増加させる（ 例えば 、LB = 3ヘルツ）。特徴的な処理パラメータについては、表1を参照してください。
9. 同じスペクトルにおける参照化合物（MDP）の信号の下の面積に対する各PL信号の面積を定量化する。
10. （（i）の既知濃度のリン化合物、およびPL ³¹ P NMR実験で用い（ii）は、同一の同軸インサートのステムを充填した5mmのNMR管を使用して、別の実験における対照化合物（MDP）の信号を較正7.3および7.9）を参照してください。
11. 一方PL信号の相対領域に基づいて個別のPL濃度を計算する（7.9を参照）、および較正値に基づいからMDPについて得られた他方では、同軸のインサート（7.10を参照）。特に³¹ P NMR信号に寄与リン核の数は、その信号の分子起源の関数として変化し得ることを考慮している。
    注：カルジオリピンリン酸シグナルがそうであるように、MDPホスホ信号（通常は19.39 ppmの参照先）は、2つのリン核を表します。脳抽出物中に検出されたすべての他のPL ³¹ P NMRシグナルは、一つのリン核をそれぞれ表す。
12. 動物の群間で脳のPLレベルを比較するために、必要に応じて統計ソフトウェアを使用してください。

水溶性脳代謝物の分析のための¹ H NMR実験の8パフォーマンス

1. 所望の目標値（通常^25℃）1 H NMRプローブの設定温度調整。も参照してください。7.1で発言。
2. 4℃、11000で遠心マイクロチューブ内の水抽出液（6.5参照 ）30分間の遠心は、試料中の固体残留物をスピンダウンします。高品質のNMR管（5ミリメートル、外径）に上清の600μlのを転送します。
3. NMRマグネット、シム及び7.4〜7.6で説明したように、最適な値に設定さNMRスペクトル取得パラメータへの転送のNMRチューブ。推奨されるパラメータ値にも表1を参照してください。
4. NSが32（データ取得約 13分の合計時間）を=程度に実験あたりのトランジェント数を設定します。特に芳香族領域において、非常に弱い信号のために良好な信号対雑音比を得るためには、NSは以上の64（データ収集、約 26分の合計時間）を=を使用します。
5. スペクトル取得、最適化されたパラメータを使用して、プロセス自由誘導減衰（FID）の終了後。これらのパラメータの値は、磁場強度、シムの品質、及び定量化する代謝産物信号の関数として若干変化する。
   注：ほとんどの場合、一度各スペクトルを処理するのに十分である、すべての代謝産物信号の適切な妥協点を提示する処理パラメータのセットを使用する。特徴的な処理パラメータについては、表1を参照してください。
6. 同じスペクトルにおける参照化合物（TSP-dの_4）の信号の下の面積に対する（多くの場合、多重線、時には異なる分子に由来する他のシングレットまたは多重線とオーバーラップ）各代謝シグナルの面積を定量化する。
7. TSP-d _4は濃度に基づいて個別の代謝物濃度（6.4参照 ）を計算します。特定の¹ H NMRシグナルに寄与するプロトンの数は、その信号の分子起源の関数として変化し得ることを考慮する。 （0.0 ppmの基準）TSP-d _4はトリメチル信号が9プロトンを表しています。
8. 動物の群間の脳の代謝産物レベルを比較するために、必要に応じて統計ソフトウェアを使用してください。

結果

抽出溶液中に存在する：脳および他の組織抽出物の代謝NMRスペクトルにおける最高の解像度を得るためには、長い金属イオン（常磁性イオン、最も重要なこと）を削除するか、マスクするのが一般的となっている。これは、またはそのようなキレックス-100 ²⁰としてイオン交換樹脂を通過エキスを通過させることによって抽出物¹⁹へEDTAまたはCDTAなどのキレート剤を添加するこ?...

ディスカッション

NMR分光法は、非常に再現性および正確な方法で、溶液中の化学物質の濃度を測定するための効率的な方法である。しかし、高品質のデータを得るために、サンプル調製および分析に関する特定の規則を遵守する必要がある。観察されたシグナルの強度が検出閾値（特に弱い信号）に近づくない限り、NMR分光法による代謝産物濃度の測定では、生成もNMR信号の受信のいずれも、定量誤差を支配...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913