肝脏活体如下显微成像<em&gt;利什曼原虫</em&gt;感染:肝脏血流动力学的评估

摘要

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

摘要

活体显微镜（IVM）是已经成为可能在实时和在活体动物各种生物事件的可视化，监测和量化一个强大的光学成像技术。该技术极大地提高了我们的生理过程，并在特定器官病原体介导的现象的理解。

在这项研究中，IVM施加到小鼠肝脏和协议设计为图像在体内肝脏的循环系统，并测量在个体肝脏血管的红血细胞（RBC）的速度。为了显现不同容器亚型表征肝器官和执行血流速度的测量，之C57B1 / 6小鼠进行静脉内注射一种荧光等离子体试剂标签的肝相关脉管。 IVM能够在体内实时，红细胞速度的测量中感兴趣的特定容器中。建立这一方法将使得能够研究生理和病理条件下肝血流动力学。最终，这种基于成像的方法将是非常重要的研究L的影响原虫感染对肝脏血流动力学。

这种方法可以适用于其它感染模型和小鼠的器官和可能进一步扩展通过量化其对血流量的影响预临床的炎症的药物的效果的测试。

引言

器官特异性血流动力学是任何哺乳动物器官重要的生理功能。血流异常可能是炎症的后果和器官功能障碍¹的标志。因此，血液流动的组织，结构和功能出现生理和病理条件下进行分析的关键参数。已普遍用于分析在特定器官的血流量的技术包含一些限制，包括技术本身的分辨率极限（ 例 ​​如血流的多普勒成像），为的绝对血液流量只（体积的血液每次测量的能力单元服务器官）（ 例如光学相干断层扫描）和在速度在大量异质群体血管^2,3的平均变化的测量。肝脏的循环系统链接不同容器亚型是异质在它们的大小，结构和功能。在这项研究中，活体显微镜（IVM）成像技术被应用到评估肝脏血流动力学体内，实时，在高分辨率和在平行于揭露的组成该肝器官的个体的血管的特征。这个强大的光学成像技术的最新发展使研究人员收集的动物生活在高时空分辨率的动态数据。通过允许直接可视化和体内特异性和快速生物过程的实时监控，IVM提供了一个独特的机会，研究者将图像的个别血管，并测量和量化单个红血球内的特别选定的速度（RBC）肝血管。

在这项研究中，我们已经实现了在小鼠肝脏的IVM技术研究小鼠感染的肝血流动力学的嗜肝寄生虫利什曼原虫的影响。L.原虫负责内脏利什曼病，严重的疾病，其特征急性上慢性炎症反应和病理学，其存在于多个器官，包括脾和肝脏中的试剂。内脏利什曼病的实验小鼠模型中，肝感染是自我解决，而脾感染是渐进^4。 利什曼原虫属感染的相对于该个体的器官，这些结果仍然没有完全了解。肝，脾血流动力学病理状态下调查将揭示宿主相互作用的寄生虫和疾病发病机制的新光源。

我们的实验模型系统是基于曝光和成像接受静脉注射特异性的荧光染料对肝intravasculature的标记麻醉小鼠的肝脏。肝脏是一个有利的器官内活体显微镜。执行一个小incisio后中的n腹部，肝脏轻轻外在并置于湿纱布，然后在与减少由于心跳和呼吸的任何运动伪影的目标盖玻片。肝脏，然后放置在显微镜透镜的视图内。相比于需要使用两个光子显微镜对IVM研究脾和淋巴结，肝的优势在于其均质3D架构/解剖学，允许使用常规共焦显微镜，具有最大穿透深度约50微米，对于活体显微镜成像^5-8。

这项研究描述了两个独立的成像方法是在个别血管红细胞流速和血流速度的定量测量。在第一种方法中，使用的是XY二维的模式随时间获取肝脏血流量。所得XYT数据使用MtrackJ插件在自由的ImageJ软件，其允许individ的跟踪分析UAL红细胞随着时间的推移。在第二种方法中，一个单一的血管被选择及其相应的血流是利用共焦激光扫描显微镜的线扫描快速采集模式进行分析。感兴趣的容器被扫描在沿其中心轴的高频通过的轴线。血流速度，然后根据在未标记暗红细胞和荧光标记的等离子体之间的对比度的差量化。沿着线扫描中获得的红细胞和血浆的荧光强度对时间作图，得到的条纹，角度，其中成比例的单个红细胞的速度。

本文的目的是提供肝个别血管内的简单和可再现的方法进行成像并测量血流速度，并备妥的基本工具小鼠手术，IVM和速度的定量分析的成功表现个别红细胞。 Ť他的做法将允许研究人员获得病理状态下新的见解血流速度。

研究方案

伦理声明:所有的动物研究是按照批准了埃克斯 - 马赛UNIVERSITE，法国的机构动物护理和使用委员会的指导方针和协议执行。雌性C57BL / 6小鼠在8 - 10周，根据DécretN°8 87-848，1987年10月19日，巴黎的规则购得和处理。全部采用L.实验原虫 LD1S寄生虫根据来自法国和欧洲联盟立法生物安全法规进行。

1.鼠标感染L.原虫鞭毛体寄生虫

1. 制备培养基进行体外维持L的原虫鞭毛体寄生虫，LD1S（MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D）。
   1. 使用M199中。补充M199培养基，用10％胎牛血清（加热灭活在56℃，30分钟），25毫米的HEPES pH值6.9，12mM的_碳酸氢钠 ，1mM的谷氨酸tamine，RPMI 16040维生素混合物，10毫叶酸，100mM的腺苷，7.6毫血红素，50U / ml青霉素和50mg / ml链霉素。
2. 培养LD1S寄生虫在10ml完全M199培养基的在26℃在25 cm ²的通风烧瓶中。
3. 连续使用差速离心步骤，准备一个富含亚循环前鞭毛体形式的寄生虫人口。
   1. 收获了数中期寄生虫文化。指望一个hemocytomer。重悬^5×10 5个寄生虫/ ml的在10ml完整的M199培养基中培养。生长的寄生虫培养在厌氧条件下，直到它们到达晚固定相（在约5-6天）。
   2. 旋LD1S培养于1200×g离心10分钟，在26℃，以沉淀非亚循环寄生虫，回收上清液，并在2,500 xg离心再次旋转它在26℃下进行10分钟。
      注意:此最终沉淀高度富集亚循环前鞭毛体寄生虫。
   3. 悬浮在1颗粒00微升PBS。删除一个小等份固定用25％戊二醛1/100体积:体积和使用血球计数的寄生虫。
4. 稀释富集-亚循环寄生虫种群至1×10 ^{一百分之七}微升PBS中。注入寄生虫悬浮到尾静脉麻醉小鼠的（见下文），使用1ml注射器与地下30针。对于对照动物，注入100μl的PBS中至尾静脉。

2.外科手术

1. 消毒用杀生物喷雾消毒的工作空间和所有的手术器械用70％乙醇30分钟。
2. 制备的麻醉剂溶液，根据动物的体重，含有氯胺酮125毫克/公斤和12.5毫克/千克甲苯噻嗪的在PBS中稀释。
3. 称重小鼠并通过腹膜内用1ml注射器与地下30针注射麻醉剂的适当剂量。
4. 按住鼠标温暖和检查鼠标是完全anesthe通过继续之前捏垫脚级分配。重新注入在小鼠每隔60分钟的麻醉剂溶液的一半剂量。
5. 刮胡子鼠标的腹部，并与Vetedine清洁。使一个小切口在腹部的左侧胸廓下皮肤和肌肉。
6. 躺在刚打开面积腹部下方的一块湿纱布。暴露肝脏，将它放在纱布。躺在另一块纱布湿润肝上的。
7. 放置一个24×60毫米²到150微米厚的盖玻片，氰基丙烯酸酯，结合到金属框架，在显微镜下肝脏进行可视化。
8. 保护的小鼠的眼中，用湿纱布。
9. 成像会话后，安乐死颈椎脱位的麻醉动物。

肝脏结构的活体3显微成像

1. 开展活体显微镜实验上的倒置共聚焦显微镜配备有hermostatic受控室，复消色差63X油甘油浸没物镜（NA 1.4），氩（488纳米）和氦氖（543纳米，633纳米）激光器和蓝色二极管（405纳米）。
2. 将鼠标与盖玻片覆盖肝脏面朝下放在客观的显微镜阶段。设置在腔室的温度升高到29℃。使用肝自发荧光，以允许血窦可视调整焦点。
3. 为了显现血管，制备500微克的BSA-Alexa的647中的溶液稀释在100μlPBS中，每只小鼠。静脉内注射该溶液到尾静脉麻醉小鼠用1ml注射器与地下30针。
4. 为了显现肝细胞核，制备的Hoechst 33342的在PBS中的溶液。注入此溶液在8毫克/公斤的小鼠腹膜内用1ml注射器与地下30针。
5. 使用正常的顺序方式，63X浸没物镜和扫描仪在400赫兹到图像肝细胞核和肝脉管。打开405纳米的蓝色二极管激发赫斯特和BSA-647 Alexa的激发633纳米的激光。打开氩488 nm激光上定义大量收购乐队以可视化的肝自体荧光。

肝脏血流速度测量的活体4显微成像

1. 打开显微镜（LAS-AF浏览器版本3.1.0版本8587）的LAS软件。打开显微镜软件时选择共振扫描仪模式。
2. 单击配置选项卡上设置硬件。点击激光，然后选择氦氖激光633。点击设置并选择12位分辨率。
3. 点击获取菜单上。在光束路径设置窗口中，选择目标63X，并成立了633激光功率为100％。激活信号增益和关闭设定的参数从PM1-3下拉菜单中选择Alexa的-633。
4. 在采集选项卡中，选择"XYT"收购模式。设置格式宽1024×1024。在8000赫兹选择速度。选择3艾里单位针孔。选择3，缩放因子不要选择双向模式。

RBC速度的使用XYT图片5.定量分析（方法1）

1. 点击"在线"图标，在可视化的实时模式的血流量。选择感兴趣的区域，并选择一个特定的血管进行分析。通过调整USB控制面板上的"X"，"Y"和扫描磁场旋转坐标设定感兴趣的水平位置的容器中。
2. 停止"现场"模式，一旦感兴趣的容器设置。更改格式设置宽度为1024×256的采集模式设置窗口，平均线= 1，帧平均= 1，选择"栈"150点击"开始"，以获取图像。
3. 对于使用红细胞速度的定量分析"XYT"图片打开ImageJ的软件。选择"文件"在ImageJ的选项卡，单击"打开"，然后选择感兴趣的文件。
4. 转至ImageJ的"插件"菜单，选择基因座和生物格式导入选项。在这个窗口中，选择查看栈参数"hyperstack"。在堆叠顺序选项，选择该选项:"xyzct"。注意:这将打开一个窗口，所有的一系列收购。
5. 点击ImageJ的菜单上的"插件"，然后选择MTrackJ选项。点击"添加"图标上的小窗口，点击RBC跟踪。点击相同的红细胞中的每个以下框架，然后单击"度量"图标来测量速度。
   注:生成可以保存在.exl格式的文件。
6. 跟踪至少每容器5 RBC和分析至少相同大小的三个单独的容器中。

RBC速度的使用XT线路图像6.定量分析（方法2）

1. 点击"直播"进行可视化血˚F低在实时模式。选择一个特定的血管进行分析。设定感兴趣的水平位置的容器中。停止"现场"模式，一旦感兴趣的容器设置。
2. 选择"XT'扫描模式，并设置沿行扫描所选容器的中心内腔中。定格宽1,024×512，速度= 8,000Hz，平均线= 32，时间= 512。点击"开始"，并获得XT线路图像。
3. 通过打开.lif文件，并打开感兴趣的XT线图像产生条纹的红细胞速度的定量分析。在LAS-AF软件，选择"实验"，打开.lif并选择图像。注意:它会自动打开一个kymograph。
4. 测量所需的颗粒条纹（表示暗反射）的时间（t，获得的在Y轴）的旅行有关此kymograph一定距离（d，所得的X轴）。选择工具"画线"水平画一条线条纹。注意在远处微米，在图像的底部中的结果标签产生秒的时间。
5. 计算速度为使用从kymograph获得的值:V =距离/时间。
6. 量化最少每XT图像5颗粒条纹和最小的尺寸相同的三个单独的容器中。

结果

在肝血窦的特定的架构组织可以基于这个器官（ 图1，小图B和C，绿色），腹膜内注射的Hoechst的肝细胞核的标记的自身荧光属性可视（ 图1B，蓝）和静脉注射荧光牛血清白蛋白为肝循环系统（ 图1C，红色）的染色。肝脏是由若干不同容器亚型具有不同的功能和结构以及尺寸范围从40-700微米²直径（D）的（小血管D是间40-80微米²和大血管D是大于300...

讨论

小鼠肝脏的活体显微镜的最近发展开辟了在体内和实时^5,9,10生理响应于感染的调查新的可能性。器官的血流量是一个关键的生理参数是经常改变的许多疾病。然而，生理和传染性条件下肝脏血流动力学的状态仍然是一个探索不良的区域。在这项研究中，IVM为基础的方法，这在以前适于脾和肿瘤脉管系统的研究中，实施了以量化在单个容器内肝脏血流速度，并测量在体内 ^11...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587