Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Resumo

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Resumo

Microscopia intravital (IVM) é uma técnica de imageamento óptico poderoso que tornou possível a visualização, monitoramento e quantificação de vários eventos biológicos em tempo real e em animais vivos. Esta tecnologia tem avançado muito a nossa compreensão de processos fisiológicos e fenômenos mediada por patógenos em órgãos específicos.

Neste estudo, IVM é aplicada para o fígado do rato e protocolos foram concebidos para a imagem in vivo, o sistema circulatório do fígado e medir glóbulos vermelhos do sangue (RBC) velocidade em vasos hepáticos individuais. Para visualizar os diferentes subtipos dos vasos que caracterizam o órgão hepático e realizar medições da velocidade do fluxo sanguíneo, ratinhos C57BL / 6 são injectados por via intravenosa com um reagente fluorescente de plasma que rotula a vasculatura associada a fígado. IVM permite in vivo, em tempo real, a medição da velocidade de RBC em um vaso de interesse específica. Estabelecer esta metodologia tornará possívelinvestigar a hemodinâmica do fígado, em condições fisiológicas e patológicas. Em última análise, esta metodologia baseada na imagem será importante para o estudo da influência de L. infecção donovani na hemodinâmica hepáticas.

Este método pode ser aplicado a outros modelos infecciosas e órgãos de rato e pode ainda ser alargado para ensaios pré-clínicos do efeito de uma droga sobre a inflamação através da quantificação do seu efeito sobre o fluxo sanguíneo.

Introdução

Hemodinâmica específicos de órgãos são características fisiológicas importantes de qualquer órgão de mamíferos. Anormalidades no fluxo sanguíneo pode ser a consequência de inflamação e um sinal de disfunção de órgãos ^1. Assim, o fluxo de sangue organização, estrutura e função de parâmetros aparecem como críticos para análise sob condições fisiológicas e patológicas. As técnicas que têm sido normalmente utilizadas para a análise de fluxo sanguíneo em um órgão específico contêm várias limitações, incluindo o limite de resolução da técnica em si (por exemplo, o Doppler do fluxo de sangue), a capacidade para a medição de fluxo sanguíneo absoluto única (volume de sangue por unidade que serve um órgão) (por exemplo, a tomografia de coerência óptica) ea medição de mudanças médias em velocidade em uma população grande e heterogêneo de vasos sangüíneos ^2,3. Sistema circulatório do fígado liga diferentes subtipos de vasos que são heterogêneos em seu tamanho, estrutura e função. Dentroesta tecnologia de imagem estudo, microscopia intravital (IVM) é aplicado para avaliar a hemodinâmica do fígado in vivo, em tempo real, com elevada resolução e em paralelo para descobrir as características dos vasos sanguíneos individuais que formam o órgão hepático. O recente desenvolvimento desta técnica de imagem óptico potente permite ao pesquisador para coletar dados dinâmicos em animais vivendo em uma resolução espacial e temporal alta. Ao permitir a visualização direta e acompanhamento dos processos biológicos específicos e rápidos in vivo em tempo real, IVM fornece uma oportunidade única para que o pesquisador vasos sanguíneos imagem individual e medir e quantificar a velocidade de glóbulos vermelhos de solteiro (RBC) dentro de um especificamente selecionados embarcação hepática.

Neste estudo, nós implementamos a técnica de IVM no fígado do rato para investigar a influência da infecção do mouse pelo parasita Leishmania hepatotrópico sobre a hemodinâmica do fígado. L. donovanié o agente responsável pela leishmaniose visceral, uma doença grave caracterizada por respostas inflamatórias agudas-em-uma patologia crónica e que está presente em vários órgãos, incluindo o baço e o fígado. Num modelo de rato experimental de leishmaniose visceral, a infecção do fígado é auto-resolução enquanto que a infecção do baço é progressiva ^4. Estes resultados de infecção por Leishmania em relação aos órgãos individuais são ainda não completamente compreendidas. Investigação de hemodinâmica do fígado e baço em condições patológicas vai lançar uma nova luz sobre as interacções parasita-hospedeiro e patogênese da doença.

Nosso sistema modelo experimental é baseado em expor e imagiologia do fígado de um rato anestesiado que receberam injeção intravenosa de corantes fluorescentes específicos para a rotulagem do intravasculature hepática. O fígado é um órgão favorável para microscopia intra-vital. Depois de realizar uma pequena incision no abdômen, o fígado é suavemente exteriorizada e colocada sobre uma gaze molhada, em seguida, em uma lamela com o objetivo de reduzir quaisquer artefatos de movimento devido à pulsação e respiração. O fígado é então colocado dentro da visão de uma lente do microscópio. Em comparação com o baço e nó de linfa, que exigem a utilização de dois fotões para estudos de microscopia de IVM, a vantagem de o fígado reside na sua arquitectura homogénea 3D / anatomia, que permite o uso de um microscópio confocal convencional, com uma profundidade de penetração máxima de aproximadamente 50 mm, para microscopia intravital imagiologia ^5-8.

Este estudo descreve dois métodos de imagem independentes para a medição quantitativa da RBC velocidade e velocidade do fluxo sanguíneo nos vasos sanguíneos individuais. No primeiro método, o fluxo de sangue no fígado é adquirida utilizando um modo de bi-dimensional xy ao longo do tempo. Os dados XYT resultantes são analisados ​​usando o plugin MtrackJ no software livre ImageJ, que permite o rastreamento de individual hemácias ao longo do tempo. No segundo método, um único vaso sanguíneo é seleccionado e a sua correspondente fluxo de sangue é analisada utilizando o modo de varrimento de linha rápida aquisição do microscópio confocal de varredura a laser. O vaso de interesse é digitalizada de alta frequência ao longo do seu eixo central através de uma linha axial. A velocidade do fluxo de sangue é então quantificada com base na diferença de contraste entre eritrócitos não marcados escuras e plasma marcado por fluorescência. As intensidades de fluorescência de glóbulos vermelhos e plasma adquiridos ao longo da linha de varrimento são representados graficamente contra o tempo para obter estrias, os ângulos dos quais são proporcionais às velocidades de um RBC indivíduo.

O objetivo deste artigo é fornecer um método simples e reprodutível para a imagem latente e medir a velocidade do fluxo de sangue dentro dos vasos sanguíneos individuais do fígado e disponibilizar as ferramentas básicas para a realização bem-sucedida da cirurgia rato, IVM e análises quantitativas da velocidade de glóbulos vermelhos individuais. Tsua abordagem permitirá que os investigadores para ganhar novos insights sobre velocidade do sangue em condições patológicas.

Protocolo

Declaração de ética: Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos que foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Université Aix-Marseille, França animal Institucional. Feminino camundongos C57BL / 6 a 8 - 10 semanas de idade foram comercialmente obtida e manipulada de acordo com as regras do Décret N ° 8 ° 87-848, 19 de outubro, 1987, Paris. Todos os experimentos usando L. donovani parasitas LD1S foram conduzidos de acordo com as normas de biossegurança da legislação francesa e da União Europeia.

1. Rato infecção com L. donovani promastigota Parasitas

1. Prepara-se o meio de cultura para manutenção in vitro de L. donovani parasitas promastigotas, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. Use meio M199. Suplemento de meio M199 com 10% de soro fetal de vitela (inactivado pelo calor a 56 ° C durante 30 min), 25 mM de HEPES pH 6,9, 12 mM de NaHCO _3, 1 mM de glutamina, RPMI 16040 mistura de vitaminas, 10 mM de ácido fólico, 100 mM de adenosina, hemina 7,6 mM, 50 U / ml de penicilina e 50 mg / ml de estreptomicina.
2. Cultura LD1S parasitas em 10 ml de meio M199 completo a 26 ° C num balão ventilado 25cm ^2.
3. Usando sucessivos passos de centrifugação diferencial, preparar uma população de parasitas promastigotas que são enriquecidos em formas metacíclicas.
   1. Colher um mid-log cultura parasita fase. Conte com uma hemocytomer. Ressuspender 5 x 10 ⁵ parasitas / ml em 10 ml de meio M199 completo. Crescer a cultura parasita em condições anaeróbias até atingirem a fase estacionária tardia (em cerca de 5-6 dias).
   2. Girar a cultura LD1S a 1.200 xg durante 10 min a 26 ° C para sedimentar os parasitas não metacíclicos, recuperar o sobrenadante e girá-lo de novo a 2500 xg a 26 ° C durante 10 min.
      Nota: Este sedimento final é altamente enriquecido em parasitas promastigotas metacíclicos.
   3. Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS. Retirar uma pequena alíquota para fixação com 25% de glutaraldeído 1/100 v: v e contar parasitas utilizando um hemocitómetro.
4. Dilui-se a população de parasitas enriquecido-metacíclica a 1 x 10 ^7/100 ul em PBS. Injectar o parasita suspensão na veia da cauda de um rato anestesiado (veja abaixo), utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 30 G. Para os animais de controlo, injectar 100 ul de PBS na veia da cauda.

2. Procedimentos Cirúrgicos

1. Desinfectar o espaço de trabalho com um spray de desinfectante e biocida todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 30 min.
2. Prepara-se uma solução de anestésico, de acordo com o peso do animal, que contém 125 mg / kg de cetamina e 12,5 mg / kg de xilazina diluído em PBS.
3. Pesa-se o rato e intraperitoneal injectar a dose apropriada de anestésico usando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30.
4. Mantenha o mouse quente e verifique se o mouse é completamente anestesiaTized por beliscar a almofada do pé antes de prosseguir. Re-injetar uma meia dose da solução anestésica no rato a cada 60 min.
5. Raspar o abdome do rato e limpe-o com Vetedine. Fazer uma pequena incisão na pele e musculatura sob a caixa torácica, no lado esquerdo do abdómen.
6. Coloque um pedaço de gaze úmida no abdômen logo abaixo da área aberta. Expor o fígado e coloque-o sobre a gaze. Coloque outro pedaço de gaze úmida sobre o fígado.
7. Inserir um 24 x 60 ^mm2 a 150 um de espessura lamela, para uma estrutura de metal, sobre o fígado para visualização sob um microscópio ligado-cianoacrilato.
8. Proteger os olhos do rato com uma gaze molhada.
9. Após a sessão de imagiologia, o animal anestesiado eutanásia por deslocação cervical.

3. Microscopia intravital Imagem da Arquitetura fígado

1. Realizar os experimentos de microscopia intravital em um microscópio confocal invertido equipado com pelocâmara, uma objectiva de imersão 63X glicerol óleo apochromatic (NA 1.4), argônio (488 nm) e HeNe (543 nm, 633 nm) lasers e um diodo azul (405 nm) hermostatic controlada.
2. Posicione o mouse no palco do microscópio com a lamela cobrindo o rosto fígado para baixo no objetivo. Ajustar a temperatura da câmara para 29 ° C. Ajuste o foco com o autofluorescência fígado para permitir a visualização dos sinusóides.
3. Para visualizar a vascularização, preparar uma solução de 500 ug de BSA-Alexa 647 diluído em 100 ul de PBS, para cada ratinho. Injectar esta solução por via intravenosa na veia da cauda do ratinho anestesiado utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 30 G.
4. Para visualizar os núcleos de células do fígado, preparar uma solução de Hoechst 33342 em PBS. Injectar esta solução a 8 mg / kg de rato intraperitonealmente utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30.
5. Use o modo seqüencial normal, a objectiva de imersão 63X eo scanner a 400 Hz para a imagem da hepáticaos núcleos das células e a vasculatura hepática. Ligue a 405 nm diodo azul para Hoechst eo laser de excitação 633 nm para BSA-Alexa 647 excitação. Ligue o laser nm Argon 488 e definir uma banda grande aquisição para visualizar a autofluorescência fígado.

4. Microscopia intravital Imagem do Fígado para medição do fluxo sanguíneo velocidade

1. Abra o software LAS do microscópio (LAS-AF espectador Versão 3.1.0 Build 8587). Selecione o modo de scanner de ressonância ao abrir o software microscópio.
2. Clique na guia de configuração para definir o hardware. Clique em laser e selecione o laser HeNe 633. Clique em Configurações e selecione 12 bits de resolução.
3. Clique no menu de aquisição. Na janela de configurações via o feixe, selecione o 63X objetiva e configurar a potência do laser 633 a 100%. Ative o ganho de sinal e desligar parâmetros definidos selecionando Alexa-633 a partir do menu drop-down PM1-3.
4. Na guia adquirem, selecione a aquisição 'XYT'modo. Definir a largura em formato de 1024 x 1024. Selecione a velocidade a 8.000 Hz. Selecione o pinhole de 3 unidades Airy. Selecione um fator de zoom de 3. Não selecione o modo bidirecional.

5. Análise Quantitativa de RBC Velocidade Usando as Imagens XYT (Método 1)

1. Clique no ícone 'Live' para visualizar o fluxo de sangue em um modo de viver. Escolha da área de interesse e seleccionar um vaso sanguíneo específico para análise. Defina o vaso de interesse para a posição horizontal, ajustando o "X", "Y" e digitalização de rotação de campo coordenadas no painel de controle USB.
2. Pare o modo 'Live' uma vez que o vaso de interesse está definido. Mudar a largura do conjunto formato para 1024 x 256 no modo de aquisição janela, linha média = 1, quadro médio = 1 configuração, selecione "empilha" 150. Clique em 'start' para adquirir imagens.
3. Para a análise quantitativa da velocidade RBC usando as imagens "XYT" abrir o software ImageJ. Selecione a 'File'guia em ImageJ, clique em "Abrir" e escolha o arquivo de interesse.
4. Vá para o menu "plugin" em ImageJ, selecione LOCI e Bio-importar formatos de opções. Nesta janela, selecione a pilha visualizar parâmetros como 'hyperstack'. Na opção ordem da pilha, selecione a opção: "xyzct". Nota: Isso abre uma janela com toda a série de aquisições.
5. Clique em 'Plugins' no menu e selecione a opção ImageJ MTrackJ. Clique no ícone "Adicionar" na pequena janela e clique no RBC para acompanhar. Clique no mesmo RBC em cada seguinte quadro e clique no ícone «medida» para medir a velocidade.
   Nota: O arquivo gerado pode ser salvo no formato .exl.
6. Acompanhe um mínimo de cinco hemácias por navio e analisar um mínimo de três navios individuais do mesmo tamanho.

6. Análise Quantitativa de RBC Velocity usando a linha de xt Imagens (Método 2)

1. Clique em 'Live' para visualizar o sangue fbaixo no modo ao vivo. Selecione um vaso sanguíneo específico para análise. Definir o vaso de interesse para a posição horizontal. Pare o modo 'Live' uma vez que o vaso de interesse está definido.
2. Selecione o modo de digitalização "xt" e defina o lúmen central do navio selecionado ao longo da linha de varredura. Set largura em formato 1.024 x 512, velocidade = 8.000Hz, linha média = 32, o tempo = 512. Clique em 'start' e adquirir as imagens de linha xt.
3. Gerar raias de análise quantitativa de velocidade RBC abrindo o arquivo .lif ea imagem linha xt de interesse abertura. Em software LAS-AF, selecione "experimentos", abra o .lif e selecione a imagem. Nota: Ele vai abrir automaticamente um quimógrafo.
4. Medir o tempo (t, obtido no eixo Y) necessária para um traço de partículas (que mostra a reflexão escuro) para percorrer uma determinada distância (d, obtido no eixo X) nesta quimógrafo. Selecione a ferramenta "desenhar linha" e desenhar uma linha horizontal para a raia. Note-se a distância emum e o tempo em segundos gerados em resultado da aba na parte inferior da imagem.
5. Calcular a velocidade como V = distância / tempo usando os valores obtidos a partir da quimógrafo.
6. Quantificar um mínimo de cinco partículas raias imagem xt e por um mínimo de três navios individuais do mesmo tamanho.

Resultados

A organização arquitectónico específico dos sinusóides do fígado pode ser visualizado com base na propriedade autofluorescente deste órgão (Figura 1, painel B e C, verde), a injecção intraperitoneal de Hoechst para a rotulagem dos núcleos de hepatócitos (Figura 1B, azul) e a injecção intravenosa de BSA fluorescente para a coloração do sistema circulatório hepática (Figura 1C, vermelho). O fígado é composto por vários subtipos dos vasos diferentes co...

Discussão

O desenvolvimento recente de microscopia intravital do fígado do rato abre novas possibilidades para a investigação da resposta fisiológica à infecção in vivo e em tempo real, ^5,9,10. Fluxo sanguíneo de órgãos é um parâmetro fisiológico crítico que é frequentemente alterados em muitas doenças. No entanto, o estado da hemodinâmica hepáticas, sob condições fisiológicas e infecciosas continua a ser uma área pouco explorado. Neste estudo, os métodos baseados em IVM, que foram previ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587