Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Özet

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Özet

Intravital mikroskopi (IVM) gerçek zamanlı ve canlı hayvan, çeşitli biyolojik olayların görselleştirme, izleme ve miktarının mümkün kıldı güçlü optik görüntüleme tekniğidir. Bu teknoloji çok fizyolojik süreçler ve belirli organlarda patojen-aracılı olayların anlayışımızı ilerlemiştir.

Bu çalışmada, IVM fare karaciğer uygulanır ve protokoller tasarlanmış görüntü, in vivo olarak karaciğer dolaşım sistemi ve tek tek hepatik damarlarda kırmızı kan hücresi (RBC) hızını ölçmek. Hepatik organı karakterize Farklı damar alt tiplerini görselleştirmek ve kan akış hızının ölçümlerini gerçekleştirmek için, C57BL / 6 fareleri, damar, karaciğer ile ilişkili damar etiket bir floresan plazma reaktifi ile enjekte edilir. IVM ilgi belirli bir kap içinde vivo, gerçek zamanlı, RBC hızının ölçümünde sağlar. Bu metodoloji kurulması mümkün hale getirecekfizyolojik ve patolojik koşullar altında karaciğer hemodinamik araştırmak. Sonuçta, bu görüntüleme bazlı metodoloji L. etkisini incelemek için önemli olacaktır Karaciğer hemodinami üzerine donovani enfeksiyonu.

Bu yöntem, diğer enfeksiyöz modelleri ve fare organ uygulanabilir ve daha fazla kan akışı üzerindeki etkisinin nicelenmesiyle enflamasyon ile ilgili bir ilacın etkisinin test klinik öncesi da kapsayacak şekilde genişletilebilir.

Giriş

Organ spesifik hemodinamik herhangi bir memeli organı önemli fizyolojik özellikleri vardır. Kan akımı anormallikler inflamasyon sonucu ve organ disfonksiyonu ¹ bir işareti olabilir. Böylece, kan akışı organizasyonu, yapısı ve fonksiyonları fizyolojik ve patolojik koşullar altında analiz gibi kritik parametreleri görünür. genel olarak, belirli bir organa kan akışını analiz etmek için kullanılmıştır teknikleri tekniğin kendi çözünürlük sınırını da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara içeren (örneğin, kan akışının Doppler görüntüleme), her kan sadece (hacim mutlak kan akışının ölçülmesi için kapasite bir organ) (örn optik koherens tomografi) ve kan damarlarının ^2,3 geniş ve heterojen nüfus hız ortalama değişikliklerin ölçümü hizmet birimi. karaciğerin dolaşım sistemi kendi büyüklüğü, yapısı ve işlevi heterojen farklı damar alt tiplerini bağlar. IçindeBu çalışmada, intravital mikroskobu (IVM) görüntüleme teknolojisi, yüksek çözünürlükte, gerçek zamanlı, in vivo karaciğer hemodinamiği değerlendirmek için uygulanır ve paralel olarak karaciğer organı oluşturan bireysel kan damarlarının özelliklerini ortaya çıkarmak için. Bu güçlü optik görüntüleme tekniğinin son gelişmeler araştırmacı, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte yaşayan hayvanlar dinamik veri toplamak için izin verir. Doğrudan görselleştirme ve in vivo spesifik ve hızlı biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı izleme izin vererek, IVM görüntü bireysel kan damarlarının araştırmacıya eşsiz bir fırsat sunuyor ve ölçmek ve özellikle seçilmiş olan tek kırmızı kan hücrelerinin hızını (RBC) ölçmek hepatik damar.

Bu çalışmada, karaciğer hemodinami hepatotropik Leishmania parazitinin fare enfeksiyon etkisini araştırmak için fare karaciğerinde IVM tekniği hayata geçirdik. L. donovaniviseral leishmaniasis akut-on-kronik inflamatuar tepkileri ile karakterize bir hastalıktır ve dalak ve karaciğer dahil olmak üzere, birden fazla organ, içinde mevcut olan bir patolojiden sorumlu maddedir. Visseral leishmaniasis deneysel fare modelinde, karaciğer enfeksiyonu kendiliğinden çözülmesi dalak enfeksiyonu ⁴ ilerici ise olduğunu. Hala tam olarak anlaşılamamıştır bireysel organlara göre Leishmania enfeksiyonunun Bu sonuçlar. Patolojik koşullar altında karaciğer ve dalak hemodinaminin incelenmesi konak-parazit etkileşimleri ve hastalık patogenezi üzerine yeni bir ışık tutacaktır.

Bizim deneysel model sistemi maruz bırakılması ve hepatik intravasculature etiketlenmesi için belirli bir floresan boyalar damardan enjekte edildi, bir anestezi uygulanmış fare karaciğer görüntüleme dayanır. Karaciğer içi hayati mikroskopi için olumlu bir organdır. Küçük bir incisio yapıldıktan sonran karın bölgesinde, karaciğer hafifçe dışa ve daha sonra kalp atışı ve solunum nedeniyle herhangi bir hareket eserler azaltılması amacı ile bir lamel, ıslak gazlı bez yerleştirilir. Karaciğer sonra bir mikroskop lenslerin görüş içine yerleştirilmiştir. IVM çalışmaları için, iki foton mikroskopi kullanılmasını gerektirir, dalak ve lenf düğümü ile karşılaştırıldığında, karaciğer avantajı maksimum nüfuz etme derinliği, bilinen bir konfokal mikroskop kullanımı için izin veren homojen bir 3D mimarisi / anatomi yatmaktadır Yaklaşık 50 mikron, intravital mikroskopi görüntüleme ^5-8 için.

Bu çalışma, bireysel kan damarlarında RBC hız ve kan akış hızının kantitatif ölçümü için iki bağımsız görüntüleme yöntemleri açıklanır. İlk yöntemde, karaciğer kan akımı zaman içinde xy iki boyutlu bir modu kullanılarak elde edilir. Elde edilen veriler XYT! Tek takibi sağlayan ücretsiz ImageJ yazılımı MtrackJ eklentisi kullanılarak analiz edilirzamanla ual RBCs. İkinci yöntemde ise, tek bir kan damarı seçilir ve karşılık gelen kan akımı konfokal lazer tarama mikroskobu çizgi taraması, hızlı edinim durumuna kullanılarak analiz edilir. ilgi kabı bir eksen hattı boyunca orta ekseni boyunca yüksek frekansta taranır. Kan akış hızı daha sonra, etiketlenmemiş koyu eritrositler ve floresan etiketli plazma arasındaki aksine farka dayanarak ölçülür. çizgi tarama boyunca alınan eritrositler ve plazmanın floresan yoğunlukları çizgiler elde edilmesi için, zamana karşı çizilen, açıları bağımsız bir RBC hızları ile orantılıdır.

Bu makalenin amacı karaciğer bireysel kan damarları içinde görüntüleme için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ve ölçüm kan akış hızı sağlamak ve fare cerrahisi, IVM ve hızının kantitatif analizleri başarılı bir performans için temel araçları kullanılabilir hale getirmektir Bireysel RBCs. TOnun yaklaşımı araştırmacılar patolojik koşullarda kan hızı yeni bakış açıları kazanmak için izin verir.

Protokol

Etik bildirimi: Tüm hayvan çalışmaları Aix-Marseille Université, Fransa Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi kurallar ve protokoller doğrultusunda yapıldı. 8 dişi C57BL / 6 fareler - eski 10 hafta ticari tarihli kararnamede N ° 8 87-848, 19 Ekim 1987, Paris kurallarına göre elde edilmiş ve ele alınmıştır. L. kullanan tüm deneyler donovani LD1S parazitler Fransız ve Avrupa Birliği mevzuatı gelen biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır.

L. ile 1. Fare Enfeksiyon donovani promastigot Parazitler

1. L., in vitro kültür bakım ortamı hazırlayın donovani promastigot parazitler, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. M199 ortamı kullanın. (30 dakika boyunca 56 ° C'de ısı ile inaktive edilmiş),% 10 fetal dana serumu ile M199 ortamı Ek, 25 mM HEPES pH 6.9, 12 mM NaHCO _3, 1 mM gluhistamin RPMI 16040 vitamin karışımı, 10 mM folik asit, 100 mM adenozin, 7.6 mM hemin, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin.
2. Kültür 25 cm ² havalandırılmış kap içinde 26 ° C de tam bir M199 medyumu 10 ml parazitleri LD1S.
3. Ardışık diferansiyel santrifüj adımları kullanarak, metacyclic formlarda zenginleştirilmiş promastigot parazitlerin nüfusu hazırlamak.
   1. Bir orta-log faz parazit kültürü hasat. Bir hemocytomer güvenin. Tam M199 medyumu 10 ml 5 x 10 ⁵ parazit / ml yeniden süspanse edin. Onlar (yaklaşık 5-6 gün) geç sabit faz ulaşana kadar anaerobik koşullarda parazit kültürü büyütün.
   2. Olmayan metacyclic parazitleri topak süpernatantı kurtarmak ve 10 dakika boyunca 26 ° C 'de 2500 xg'de tekrar dönmeye 26 ° C'de 10 dakika boyunca 1200 x g'de LD1S kültürü dönerler.
      Not: Bu son derece pelet metacyclic promastigot parazitleri zenginleştirilmiştir.
   3. 1 pelet yeniden süspansePBS 00 ul. V ve hemasitometre kullanarak parazitleri saymak:% 25 glutaraldehit ile 1/100 v sabitleme için küçük bir kısım çıkarın.
4. PBS içinde 1 x 10 ^7/100 ul zenginleştirilmiş-metacyclic parazit nüfusu sulandırmak. Anestezi altında farenin kuyruk venine parazit süspansiyonu enjekte bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile (aşağı bakınız). Kontrol hayvanları için, kuyruk venine 100 ul PBS enjekte edilir.

2. Cerrahi İşlemleri

1. 30 dakika boyunca% 70 etanol ile biyosidal dezenfektan sprey ile çalışma alanı ve tüm cerrahi aletler dezenfekte edin.
2. 125 mg / kg ketamin ve 12.5 mg / PBS içinde seyreltilmiş ksilazin kg ihtiva eden hayvanın ağırlığına göre, bir anestetik çözelti hazırlayın.
3. Fareyi tartılır ve intraperitoneal 30 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak anestezik uygun dozu enjekte.
4. Sıcak fare tutun ve fare tamamen anesthe olup olmadığını kontrolDevam etmeden önce ayak pedi kısma tized. Fare her 60 dk içinde anestezik solüsyonun yarım doz yeniden enjekte edilir.
5. Farenin karın Tıraş ve Vetedine ile temizleyin. Karnın sol tarafında göğüs kafesinin altında deri ve kas içinde küçük bir kesi yapmak.
6. Sadece açılan alanının altındaki karın nemli gazlı bez parçası koyun. Karaciğer Açığa ve gazlı bez üzerine yerleştirin. Karaciğer yukarıda nemli gazlı bez başka bir parça yatıyordu.
7. Yeri 24 x 60 mm ^2-150 mikron kalınlığında lamel, siyanoakrilat-bağlı bir mikroskop altında görünüm için karaciğer, metal bir çerçeveye.
8. Islak bir gazlı bez ile fare gözleri koruyun.
9. Görüntüleme seansından sonra, servikal dislokasyon anestezi hayvan euthanize.

Karaciğer Mimarlık 3. intravital Mikroskopi Görüntüleme

1. At ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop intravital mikroskopi deneyler yürütmekhermostatic odasını, bir apochromatic 63X petrol gliserol daldırma hedefi (NA 1.4), Argon (488 nm) ve HeNe (543 nm, 633 nm) lazerler ve mavi diyot (405 nm) kontrol edilir.
2. Objektif karaciğer yüzü aşağı kaplayan lamel ile mikroskop sahnede fare yerleştirin. 29 ° C odasının sıcaklığı ayarlayın. Sinüzoidler görselleştirilmesi için izin vermek için karaciğer otofloresans kullanarak odağı ayarlayın.
3. Damar görselleştirmek için, her bir fare için 100 ul PBS içinde seyreltilmiş 500 ug BSA-Alexa 647 içeren bir çözelti hazırlamak. Bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile anestezi uygulanmış fare kuyruk venine intravenöz, bu çözelti enjekte edilir.
4. Karaciğer hücre çekirdekleri görselleştirmek için, PBS içinde Hoechst 33342 içeren bir çözelti hazırlayın. Intraperitonal, bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile bir fare 8 mg / kg, bu çözelti enjekte edilir.
5. Görüntünün hepatik 400 Hz normal sıralı mod, 63X daldırma objektif ve tarayıcıyı kullanınHücre çekirdekleri ve karaciğer damarsal. Hoechst uyarım için 405 nm mavi diyot ve BSA-Alexa 647 uyarma için 633 nm lazer açın. Argon 488 nm lazer açın ve karaciğer otofloresans görselleştirmek için büyük bir kazanım bandı tanımlar.

Kan Akışı Hız Ölçüm Karaciğer 4. intravital Mikroskopi Görüntüleme

1. Mikroskobu (LAS-AF görüntüleyici Sürüm 3.1.0 build 8587) LAS yazılımını açın. Mikroskop yazılımını açarken rezonans tarayıcı modunu seçin.
2. Donanım ayarlamak için yapılandırma sekmesine tıklayın. Lazer tıklayın ve HeNe 633 lazer seçin. Ayarlarına tıklayın ve 12 bit çözünürlüğü seçin.
3. Iktisap menüsüne tıklayın. Işın yolu ayarları penceresinde, objektif 63x seçin ve% 100 633 lazer gücü kurdu. Sinyal kazancı ve PM1-3 açılan menüden Alexa-633 seçerek parametrelerini ayarlamak kapalı etkinleştirin.
4. Acquire sekmesinde, 'XYT' edinilmesini seçinmodu. 1024 x 1,024 Set biçim genişliği. 8.000 Hz hızını seçin. 3 Havadar birimlerinin iğne deliği seçin. İki yönlü modunu seçmeyin 3. yakınlaştırma faktörünü seçin.

RBC Hızının 5. Kantitatif Analiz XYT Görüntüleri Kullanma (Yöntem 1)

1. Canlı modu kan akışını görselleştirmek için 'Canlı' simgesini tıklayın. Ilgi alanını seçin ve analiz için özel bir kan damarı seçin. USB kontrol panelindeki 'X', 'Y' ve tarama alan rotasyon koordinatlarını ayarlayarak yatay konuma ilgi gemi ayarlayın.
2. Ilgi damar ayarlandıktan sonra 'Live' modunu durdurun. Seçeneğini, pencere, çizgi ortalama = 1, çerçeve ortalama = 1 ayarını edinim modunda 1024 x 256 formatında set genişliğini değiştirme görüntüler elde etmek için 'start' üzerinde 150 tıklayınız "yığınlarının".
3. Kullanarak RBC hızının kantitatif analiz için "XYT" görüntüleri ImageJ yazılımı açın. 'Dosya' SeçImageJ sekmesini, ardından faiz dosyayı seçin "Aç" düğmesini tıklatın.
4. ImageJ "eklentisi" menüsüne gidin, LOCI ve Bio-biçimleri seçeneklerini ithal belirleyin. Bu pencerede, 'hyperstack' gibi parametreleri görüntüleme yığını seçin. "Xyzct": yığın sırası seçeneğinde, seçeneği seçin. Not: Bu satın almalar, tüm serisi ile bir pencere açar.
5. ImageJ menüsünde 'Eklentiler' tıklayın ve MTrackJ seçeneği seçin. Küçük pencerede 'eklenti' ikonuna tıklayın ve izlemek için RBC tıklayın. Her aşağıdaki çerçeve içinde aynı RBC tıklayın ve hızını ölçmek için 'tedbir' simgesine tıklayın.
   Not: .exl formatında kaydedilebilir oluşturulan dosyayı.
6. Kap başına beş eritrositlerde az izlemek ve aynı büyüklükte üç ayrı kapların en az analiz eder.

Xt Hattı Görüntüleri Kullanma RBC Hızının 6. Kantitatif Analiz (Yöntem 2)

1. Kan f görselleştirmek için 'Canlı' tıklayınCanlı modda düşük. Analizi için, belirli bir kan damarı seçin. Yatay konuma ilgi gemi ayarlayın. Ilgi damar ayarlandıktan sonra 'Live' modunu durdurun.
2. 'Xt' tarama modunu seçin ve satır tarama boyunca seçilen teknenin merkez lümeni ayarlayın. Set biçimi genişliği 1024 x 512, hız = 8,000Hz, satır ortalama = 32, 'başlangıç' ve xt hattı görüntü elde zamanı = 512 Click.
3. .lif Dosyasını açarak ve ilgi xt hattı görüntüsünü açarak RBC hızının kantitatif analiz için çizgiler oluşturun. LAS-AF yazılımında, "deneyleri" seçeneğini .lif açın ve görüntü seçin. Not: otomatik kymograph açılacaktır.
4. Bu kymograph üzerine (X ekseninde elde edilen d) belirli bir mesafe seyahat (koyu yansımasını gösteren) bir parçacık çizgi için gerekli (t, Y ekseninde elde edilir) zamanı ölçün. Aracı "çizgi çizmek" ve çizgi yatay bir çizgi çizin seçin. Uzaklığı Notum ve görüntünün altındaki sonucu sekmesinde oluşturulan saniye zaman.
5. Kymograph elde edilen değerleri kullanarak V = mesafe / zaman olarak hız hesaplayın.
6. Xt görüntü başına beş parçacık çizgiler bir minimum ve aynı büyüklükte üç ayrı kapların en az ölçmek.

Sonuçlar

Karaciğerde sinüzoidler özgü mimari organizasyon görüntülendi bu organın (Şekil 1, panel B ve C, yeşil), hepatosit çekirdeğinin etiketleme için Hoechst intraperitoneal enjeksiyonu ve autofluorescent özelliğine dayalı olabilir (Şekil 1B, mavi) ve hepatik kan dolaşımı sistemi (Şekil 1C, kırmızı) boyama için floresan BSA intravenöz enjeksiyonu. çapı 40-700 mikron ² (D), 300 um ² üzerinde ² um ve büyük damarlar...

Tartışmalar

Fare karaciğer intravital mikroskopi son gelişme in vivo ve gerçek zamanlı ^5,9,10 enfeksiyona fizyolojik yanıtın araştırılması için yeni olanaklar açar. Organ kan akışı, genellikle pek çok hastalıkta değiştirilmiş bir kritik fizyolojik bir parametredir. Ancak, fizyolojik ve enfeksiyon koşullar altında karaciğer hemodinamiklerin durumu kötü keşfedilmeyi alan kalır. Bu çalışmada, daha önce dalak ve tümör damar sisteminin çalışması için adapte edilmiştir IVM-bazlı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587