Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Resumen

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Resumen

Microscopía intravital (IVM) es una poderosa técnica de imagen óptica que ha hecho posible la visualización, monitoreo y cuantificación de diversos eventos biológicos en tiempo real y en los animales vivos. Esta tecnología ha avanzado enormemente nuestra comprensión de los procesos fisiológicos y fenómenos patógenos mediada en órganos específicos.

En este estudio, IVM se aplica al hígado de ratón y protocolos están diseñados para imagen in vivo el sistema circulatorio del hígado y medir los glóbulos rojos (RBC) de velocidad en vasos hepáticos individuales. Para visualizar los diferentes subtipos de los vasos que caracterizan el órgano hepático y llevar a cabo mediciones de la velocidad del flujo sanguíneo, C57BL / 6 ratones se inyectaron por vía intravenosa con un reactivo de plasma fluorescente que etiqueta la vasculatura hepática asociada. IVM permite in vivo, en tiempo real, la medición de la velocidad de RBC en un recipiente específico de interés. El establecimiento de esta metodología permitirá ainvestigar la hemodinámica hepática bajo condiciones fisiológicas y patológicas. En última instancia, esta metodología basada en la proyección de imagen será importante para el estudio de la influencia de L. infección donovani en la hemodinámica hepática.

Este método se puede aplicar a otros modelos infecciosas y órganos de ratón y podría extenderse aún más para pre-clínica de pruebas del efecto de un fármaco sobre la inflamación mediante la cuantificación de su efecto sobre el flujo sanguíneo.

Introducción

Hemodinámica órgano-específicas son importantes características fisiológicas de cualquier órgano de mamífero. Anomalías en el flujo sanguíneo puede ser la consecuencia de la inflamación y un signo de disfunción de órganos ^1. Por lo tanto, el flujo de sangre organización, estructura y función aparecen como parámetros críticos para el análisis en condiciones fisiológicas y patológicas. Las técnicas que se han utilizado comúnmente para el análisis de flujo de sangre en un órgano específico contienen varias limitaciones, incluyendo el límite de resolución de la técnica en sí (por ejemplo, formación de imágenes Doppler del flujo sanguíneo), la capacidad para la medición del flujo sanguíneo absoluta solamente (volumen de sangre por unidad que sirve un órgano) (por ejemplo, la tomografía de coherencia óptica) y la medición de los cambios en la velocidad promedio en una población grande y heterogéneo de los vasos sanguíneos ^2,3. El sistema circulatorio del hígado vincula diferentes subtipos de los vasos que son heterogéneos en su tamaño, estructura y función. Enesta tecnología de imagen estudio, microscopía intravital (IVM) se aplica para evaluar la hemodinámica del hígado in vivo, en tiempo real, en alta resolución y en paralelo para descubrir las características de los vasos sanguíneos individuales que componen el órgano hepático. El reciente desarrollo de esta poderosa técnica de imagen óptica permite al investigador para recolectar datos dinámicos sobre los animales que viven en una alta resolución espacial y temporal. Al permitir la visualización directa y el monitoreo en tiempo real de los procesos biológicos específicos y rápidos en vivo, IVM ofrece una oportunidad única para el investigador a los vasos sanguíneos imagen individual, y medir y cuantificar la velocidad de los glóbulos rojos individuales (RBC) dentro de un seleccionado específicamente buque hepática.

En este estudio, hemos implementado la técnica de IVM en el hígado del ratón para investigar la influencia de la infección del ratón por el parásito Leishmania hepatotropos en la hemodinámica hepática. L. donovanies el agente responsable de la leishmaniasis visceral, una enfermedad grave caracterizada por respuestas inflamatorias agudas-sobre-crónica y una patología que está presente en múltiples órganos, incluyendo el bazo y el hígado. En un modelo experimental de ratón de leishmaniasis visceral, la infección del hígado es auto-resolver mientras que la infección esplénica es progresiva ^4. Estos resultados de la infección por Leishmania con respecto a los órganos individuales son todavía no completamente entendidos. Investigación de la hemodinámica de hígado y bazo en condiciones patológicas arrojará nueva luz sobre las interacciones huésped-parásito y patogénesis de la enfermedad.

Nuestro sistema modelo experimental se basa en la exposición y la obtención de imágenes del hígado de un ratón anestesiado que recibió la inyección intravenosa de tintes fluorescentes específicas para el etiquetado de la intravasculature hepática. El hígado es un órgano favorable para microscopía intra-vital. Después de realizar un pequeño incision en el abdomen, el hígado se exterioriza y se coloca en una gasa húmeda, luego en un cubreobjetos con el objetivo de reducir los artefactos de movimiento debido a latidos del corazón y la respiración suavemente. El hígado se coloca entonces dentro de la vista de una lente de microscopio. En comparación con el nodo linfático y bazo que requiere el uso de dos fotones para los estudios de microscopía de IVM, la ventaja de que el hígado se encuentra en su arquitectura 3D homogénea / anatomía que permite el uso de un microscopio confocal convencional, con una profundidad máxima de penetración de aproximadamente 50 micras, para obtener imágenes de microscopía intravital ^5-8.

Este estudio describe dos métodos de imagen independientes para la medición cuantitativa de RBC velocidad y la velocidad de flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos individuales. En el primer método, el flujo de sangre del hígado se adquiere usando un modo de bi-dimensional xy con el tiempo. Los datos XYT resultantes se analizan usando el plugin MtrackJ en el software ImageJ libre, que permite el seguimiento de individUAL glóbulos rojos en el tiempo. En el segundo método, se selecciona un solo vaso sanguíneo y su correspondiente flujo de sangre se analiza usando el análisis de la línea modo de adquisición rápida del microscopio de escaneo láser confocal. El vaso de interés se escanea a alta frecuencia a lo largo de su eje central a través de una línea axial. La velocidad del flujo sanguíneo se cuantifica a continuación, en base a la diferencia de contraste entre los eritrocitos y el plasma oscuros sin etiqueta marcada con fluorescencia. Las intensidades de fluorescencia de los glóbulos rojos y el plasma adquiridos a lo largo de la línea de exploración se representan gráficamente contra el tiempo para obtener rayas, los ángulos de las cuales son proporcionales a las velocidades de un RBC individual.

El objetivo de este artículo es proporcionar un método simple y reproducible para la imagen y la medición de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales del hígado y de poner a disposición las herramientas básicas para el buen desarrollo de la cirugía ratón, IVM y análisis cuantitativos de la velocidad glóbulos rojos individuales. Tsu enfoque permitirá a los investigadores a obtener nuevos conocimientos sobre la velocidad de la sangre en condiciones patológicas.

Protocolo

Declaración de Ética: se realizaron todos los estudios en animales, de acuerdo con las directrices y protocolos que fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Aix-Marsella, Francia. Mujer C57Bl / 6 ratones a 8-10 semanas de edad se obtuvieron comercialmente y manejarse de acuerdo con las reglas del Decreto N ° 8 87-848, 19 de octubre de 1987, París. Todos los experimentos utilizando L. parásitos donovani LD1S se llevaron a cabo de acuerdo con normas de bioseguridad de la legislación francesa y la Unión Europea.

1. Ratón La infección con L. donovani Promastigote parásitos

1. Preparar el medio de cultivo para el mantenimiento in vitro de L. parásitos promastigotes donovani, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. Utilice medio M199. Suplemento medio M199 con 10% de suero de ternera fetal (inactivado con calor a 56 ° C durante 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO _3, glu 1 mMtamine, RPMI 16040 mezcla de vitaminas, ácido fólico 10 mM, adenosina 100 mM, hemina 7,6 mM, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina.
2. Cultura LD1S parásitos en 10 ml de medio completo M199 a 26 ° C en un matraz de 25 cm ² ventilado.
3. El uso de sucesivas etapas de centrifugación diferencial, preparar una población de parásitos promastigotes que se enriquecen en formas metacíclicos.
   1. Cosechar un cultivo de parásitos mediados de la fase de registro. Cuente con un hemocytomer. Resuspender 5 x 10 ⁵ parásitos / ml en 10 ml de medio completo M199. Mantener el cultivo del parásito en condiciones anaeróbicas hasta que alcanzan la fase estacionaria tardía (en aproximadamente 5-6 días).
   2. Girar la cultura LD1S a 1200 xg durante 10 min a 26 ° C para sedimentar los parásitos no metacíclicos, recuperar el sobrenadante y girar de nuevo a 2500 xg a 26 ° C durante 10 min.
      Nota: Este sedimento final es altamente enriquecido en los parásitos promastigotes metacíclicos.
   3. Resuspender el precipitado en 100 l de PBS. Retirar una pequeña alícuota para la fijación con 25% de glutaraldehído centésimas v: v y contar parásitos utilizando un hemocitómetro.
4. Diluir la población de parásitos enriquecido con metacyclic a 1 x 10 ^7/100 l en PBS. Inyectar la suspensión parásito en la vena de la cola de un ratón anestesiado (ver a continuación) utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G. Para los animales de control, inyecte 100 l de PBS en la vena de la cola.

2. Procedimientos Quirúrgicos

1. Desinfectar el espacio de trabajo con un spray desinfectante biocida y todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 30 min.
2. Preparar una solución anestésica, de acuerdo con el peso del animal, que contiene 125 mg / kg de ketamina y 12,5 mg / kg de xilazina diluido en PBS.
3. Pesar el ratón y por vía intraperitoneal inyectar la dosis apropiada de anestesia utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G.
4. Mantenga el ratón cálido y compruebe que el ratón es completamente anestheTized pellizcando la almohadilla de la pata antes de proceder. Vuelva a inyectar una dosis media de la solución anestésica en el ratón cada 60 min.
5. Afeitarse el abdomen del ratón y limpiarlo con Vetedine. Hacer una pequeña incisión en la piel y la musculatura debajo de la caja torácica en el lado izquierdo del abdomen.
6. Coloque un pedazo de gasa húmeda sobre el abdomen justo por debajo de la zona abierta. Exponer el hígado y colocarlo en la gasa. Coloque otro pedazo de gasa húmeda sobre el hígado.
7. Colocar un 24 x 60 mm ² a 150 micras de espesor cubreobjetos, cianoacrilato-unido a un armazón de metal, sobre el hígado para la visualización bajo un microscopio.
8. Proteja los ojos del ratón con una gasa húmeda.
9. Después de la sesión de imágenes, la eutanasia del animal anestesiado por dislocación cervical.

3. Microscopia intravital de imágenes de la arquitectura hepática

1. Llevar a cabo los experimentos de microscopía intravital en un microscopio confocal invertido equipado con alcámara, un objetivo de inmersión 63X glicerol aceite apocromático (NA 1.4), argón (488 nm) y HeNe (543 nm, 633 nm) láseres y un diodo azul (405 nm) hermostatic controlada.
2. Coloca el ratón sobre la platina del microscopio con el cubreobjetos cubriendo la cara de hígado sobre el objetivo. Ajuste la temperatura de la cámara a 29 ° C. Ajuste el enfoque utilizando la autofluorescencia hígado para permitir la visualización de los sinusoides.
3. Para visualizar la vasculatura, preparar una solución de 500 mg BSA-Alexa 647 diluido en 100 l de PBS, para cada ratón. Inyectar esta solución por vía intravenosa en la vena de la cola del ratón anestesiado utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G.
4. Para visualizar los núcleos de las células hepáticas, preparar una solución de Hoechst 33342 en PBS. Inyectar esta solución a 8 mg / kg de ratón por vía intraperitoneal usando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G.
5. Utilice el modo secuencial normal, el objetivo de inmersión 63X y el escáner en 400 Hz a la imagen de la hepáticanúcleos de las células y la vasculatura hepática. Encienda el 405 nm diodo azul para Hoechst excitación y el láser de 633 nm para BSA-Alexa 647 de excitación. Encienda el láser de argón 488 nm y definir una banda adquisición grande para visualizar el autofluorescencia hígado.

4. Microscopia intravital de imágenes del hígado para la medición de flujo sanguíneo velocidad

1. Abra el software LAS del microscopio (LAS-AF visor Versión 3.1.0 build 8587). Seleccione el modo de escáner de resonancia al abrir el software de microscopio.
2. Haga clic en la pestaña de configuración para configurar el hardware. Haga clic en láser y seleccione el láser HeNe 633. Haga clic en configuración y seleccione una resolución de 12 bits.
3. Haga clic en el menú de adquisición. En la ventana de configuración de la vía de haz, seleccione el objetivo 63X y establecer la potencia del láser 633 a 100%. Active la ganancia de la señal y fuera de los parámetros establecidos por la selección de Alexa-633 en el menú desplegable PM1-3.
4. En la pestaña de adquirir, seleccione la adquisición 'XYT'de modo. Ancho formato establecido en 1024 x 1024. Seleccione la velocidad a 8.000 Hz. Seleccione el agujero de 3 unidades de Airy. Seleccione un factor de zoom de 3. No seleccione el modo bidireccional.

5. Análisis Cuantitativo de RBC Velocity Utilizando los XYT Imágenes (Método 1)

1. Haga clic en el icono de 'Live' para visualizar el flujo sanguíneo en un modo directo. Seleccione el área de interés y seleccione un vaso sanguíneo específico para el análisis. Ajuste el vaso de interés a la posición horizontal mediante el ajuste de la rotación de campo de coordenadas de escaneo de "X", "Y" y en el panel de control USB.
2. Detenga el modo 'Live' una vez que el vaso de interés se fija. Cambie el conjunto de ancho formato a 1024 x 256 en el modo de adquisición de la ventana, la línea media = 1, marco Media = 1 ajuste, seleccione "pilas" 150. Haga clic en 'inicio' para adquirir imágenes.
3. Para el análisis cuantitativo de la velocidad de RBC usando las imágenes "XYT" abren el software ImageJ. Seleccione la opción 'Archivo'pestaña en ImageJ, haga clic en "Abrir" y luego elegir el archivo de su interés.
4. Vaya al menú "plugin" en ImageJ, seleccione Opciones LOCI y Bio-formatos de importación. En esta ventana, seleccione la pila de visualización parámetros como 'HyperStack'. En la opción de orden de apilamiento, seleccione la opción: "xyzct". Nota: Se abrirá una ventana con toda la serie de adquisiciones.
5. Haga clic en "Plugins" en el menú y seleccione la opción ImageJ MTrackJ. Haga clic en el icono 'Añadir' en la pequeña ventana y haga clic en el RBC para realizar un seguimiento. Haga clic en la misma RBC en cada trama siguiente y haga clic en el icono de "medida" para medir la velocidad.
   Nota: El archivo generado se pueden guardar en formato .exl.
6. El seguimiento de un mínimo de cinco glóbulos rojos por buque y analizar un mínimo de tres vasos individuales del mismo tamaño.

6. Análisis Cuantitativo de RBC velocidad utilizando la línea xt Imágenes (Método 2)

1. Haga clic en 'Live' para visualizar el f sangrebaja en el modo directo. Seleccionar un vaso sanguíneo específico para el análisis. Ajuste el vaso de interés a la posición horizontal. Detenga el modo 'Live' una vez que el vaso de interés se fija.
2. Seleccione el modo de escaneo "xt" y establecer el lumen central del buque seleccionado a lo largo de la línea de exploración. Conjunto ancho formato en 1024 x 512, velocidad = 8,000Hz, línea media = 32, tiempo = 512. Haga clic en "Inicio" y adquirir las imágenes de líneas xt.
3. Generar rayas para el análisis cuantitativo de la velocidad de RBC abriendo el archivo .lif y la apertura de la imagen de la línea xt de interés. En el software LAS-AF, seleccione "experimentos", abra el .lif y seleccione la imagen. Nota: se abrirá automáticamente una quimógrafo.
4. Medir el tiempo (t, obtenido en el eje Y) requerida para una racha de partículas (que muestra la reflexión oscuro) para recorrer una cierta distancia (d, obtenido en el eje X) en este quimógrafo. Seleccione la herramienta "dibujar la línea" y trazar una línea horizontal a la racha. Tenga en cuenta la distancia enmicras y el tiempo en segundos que se generan en la pestaña resultado en la parte inferior de la imagen.
5. Calcula la velocidad como V = distancia / tiempo usando los valores obtenidos a partir de la quimógrafo.
6. Cuantificar un mínimo de cinco partículas rayas imagen por xt y un mínimo de tres vasos individuales del mismo tamaño.

Resultados

La organización arquitectónica específica de los sinusoides del hígado puede ser visualizado basa en la propiedad autofluorescente de este órgano (Figura 1, panel B y C, verde), la inyección intraperitoneal de Hoechst para el etiquetado de los núcleos de los hepatocitos (Figura 1B, azul) y la inyección intravenosa de BSA fluorescente para la tinción del sistema circulatorio hepática (Figura 1C, rojo). El hígado se compone de varios subtipos diferentes de los ...

Discusión

El reciente desarrollo de la microscopía intravital del hígado del ratón abre nuevas posibilidades para la investigación de la respuesta fisiológica a la infección in vivo y en tiempo real ^5,9,10. El flujo sanguíneo de órganos es un parámetro fisiológico crítico que a menudo se altera en muchas enfermedades. Sin embargo, el estado de la hemodinámica hepática en condiciones fisiológicas e infecciosas sigue siendo un área poco explorada. En este estudio, los métodos basados ​​en IVM...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587