Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Zusammenfassung

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Zusammenfassung

Intravitalmikroskopie (IVM) ist ein leistungsfähiges optisches bildgebendes Verfahren, das die Visualisierung, Überwachung und Quantifizierung der verschiedenen biologischen Ereignisse in Echtzeit und mit lebenden Tieren möglich gemacht hat. Diese Technologie hat sich unser Verständnis der physiologischen Prozesse und die Pathogen-vermittelte Phänomene in bestimmten Organen vorgerückt.

In dieser Studie IVM ist mit der Mausleber zur In-vivo das Kreislaufsystem der Leber angewendet und Protokolle sind so konzipiert und messen roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeit in einzelnen Lebergefäße. Um die verschiedenen Behälter Subtypen, der Leberorgan charakterisieren visualisieren und führen Blutströmungsgeschwindigkeit Messungen werden C57BL / 6-Mäusen intravenös mit einem fluoreszierenden Reagenz Plasma, die die Leber-assoziierten Gefäßen Etiketten injiziert. IVM ermöglicht in vivo, Echtzeit, Messung von RBC Geschwindigkeit in einem bestimmten Gefäß von Interesse. Gründung dieser Methode wird es möglich zu machen,Untersuchung der Leber-Hämodynamik unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Letztlich wird dies Imaging-basierte Methodik wichtig für die Untersuchung des Einflusses von L. sein donovani-Infektion auf die Leber-Hämodynamik.

Dieses Verfahren kann auf andere Infektionsmodelle und Maus Organe angewandt werden und könnte weiter ausgebaut vor, eine klinische Prüfung eines Arzneimittels Wirkung auf die Entzündung durch die Quantifizierung seiner Wirkung auf den Blutfluss werden.

Einleitung

Organspezifische Hämodynamik sind wichtige physiologische Eigenschaften aller Säugetierorgans. Anomalien des Blutflusses können die Folge von Entzündungen und ein Zeichen von Organdysfunktion ¹ sein. Somit Blutfluß Organisation, Struktur und Funktion werden als kritischer Parameter für die Analyse unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die Techniken, die üblicherweise zur Analyse des Blutflusses in einem spezifischen Organ verwendet worden sind, enthalten mehrere Einschränkungen, einschließlich der Auflösungsgrenze des Verfahrens selbst (zB Doppler-Bildgebung des Blutflusses), die Fähigkeit zur Messung der absoluten Blutfluß nur (Volumen Blut pro Einheit dient ein Organ) (zB die optische Kohärenztomographie) und die Messung der durchschnittlichen Veränderungen in der Geschwindigkeit in einem großen und heterogenen Population von Blutgefäßen ^2,3. Der Leber-Kreislauf-System verbindet verschiedene Gefäßtypen, die heterogene in ihrer Größe, Struktur und Funktion sind. ImDiese Studie, Intravitalmikroskopie (IVM) Bildgebungstechnik wird angewandt, um Leber-Hämodynamik in vivo zu bewerten, in Echtzeit mit hoher Auflösung und in parallelen, um die Eigenschaften der einzelnen Blutgefäße, die den Leberorgan umfassen aufzudecken. Die jüngste Entwicklung dieser leistungsfähigen optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht es dem Forscher, um dynamische Daten an lebenden Tieren mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu sammeln. Dadurch, dass die direkte Visualisierung und Echtzeit-Überwachung von spezifischen und schnellen biologischen Prozesse in vivo, bietet IVM eine einzigartige Gelegenheit, den Forscher für Bild in einzelne Blutgefäße und zu messen und zu quantifizieren, die Geschwindigkeit der einzelnen roten Blutzellen (RBC) in einem speziell ausgewählten Lebergefäß.

In dieser Studie haben wir die IVM Technik in der Mausleber L. geführt, um den Einfluss der Maus Infektion mit dem hepatotropen Parasiten Leishmania auf Leber-Hämodynamik zu untersuchen. donovaniist die für die viszerale Leishmaniose, einer schweren Krankheit, die durch akut auf chronisch entzündliche Reaktionen und eine Pathologie, die in mehreren Organen, einschließlich der Milz und der Leber verantwortlich ist Mittel. In einem experimentellen Mausmodell von viszeraler Leishmaniose, ist die Leberinfektion ohne Behandlung während die Milz-Infektion ist progressiv. ⁴ Diese Ergebnisse Leishmania Infektion in Bezug auf einzelne Organe noch nicht vollständig verstanden. Untersuchung von Leber und Milz Hämodynamik unter pathologischen Bedingungen wird ein neues Licht auf Wirt-Parasit-Interaktionen und Krankheitsentstehung zu vergießen.

Unsere experimentelle Modellsystem ist auf Belichtung und Abbildung der Leber eines anästhesierten Maus, die eine intravenöse Injektion von spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung der Leber intravasculature erteilt hat. Die Leber ist ein Organ für die günstigen innerVitalMikroskopie. Nach der Durchführung einer kleinen incision in den Bauch, ist die Leber sanft externalisiert und auf nasser Gaze gelegt, dann auf einem Deckglas mit dem Ziel der Verringerung keine Bewegungsartefakte durch Herzschlag und Atmung. Die Leber wird dann innerhalb der Ansicht eines Mikroskopobjektivs angeordnet. Im Vergleich zu der Milz und Lymphknoten, die die Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie für IVM Studien erfordern, ist der Vorteil der Leber liegt in der homogenen 3D-Architektur / Anatomie, die für die Verwendung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskop ermöglicht, mit einer maximalen Eindringtiefe etwa 50 & mgr; m für Intravitalmikroskopie Bildgebung ^5-8.

Diese Studie beschreibt zwei unabhängige bildgebenden Verfahren für die quantitative Bestimmung von RBC Geschwindigkeit und Blutströmungsgeschwindigkeit in den einzelnen Blutgefäßen. Im ersten Verfahren wird Leberblutfluss unter Verwendung eines xy zweidimensionalen Modus über die Zeit erfasst. Die resultierenden xyt Daten werden mit dem MtrackJ Plugin im freien ImageJ Software, die für die Verfolgung der indivi ermöglicht analysiertual RBCs im Laufe der Zeit. Bei der zweiten Methode wird eine einzelne Blutgefäß ausgewählt und dessen entsprechende Durchblutung unter Verwendung der Zeilenabtastung schnelle Erfassungsmodus der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Das interessierende Gefäß wird bei hoher Frequenz entlang seiner zentralen Achse durch eine axiale Linie abgetastet. Die Blutflussgeschwindigkeit wird dann auf der Basis der Kontrastunterschied zwischen unmarkiertem dunklen Erythrozyten und fluoreszenzmarkierten Plasma quantifiziert. Die Fluoreszenzintensitäten der RBCs und Plasma entlang der Linie Abtastung erfasst werden gegen die Zeit aufgetragen, um Streifen zu erhalten, deren Winkel sind proportional zu den Geschwindigkeiten eines RBC.

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Bildgebung und Messung des Blutströmungsgeschwindigkeit in den einzelnen Blutgefäßen der Leber zu geben und für die erfolgreiche Performance der Maus Chirurgie, IVM und quantitative Analysen der Geschwindigkeit verfügbar zu machen die grundlegenden Werkzeuge einzelnen RBCs. Tsein Ansatz wird es den Forschern ermöglichen neue Einblicke in Blutgeschwindigkeit unter pathologischen Bedingungen zu gewinnen.

Protokoll

Ethics Statement: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der Aix-Marseille Université, Frankreich genehmigt wurden durchgeführt. Weibliche C57BL / 6-Mäuse in 8 - 10 Wochen wurden im Handel bezogen und nach den Regeln der Décret N ° 8 87-848, 19. Oktober 1987, Paris abgewickelt. Alle Experimente mit L. donovani LD1S Parasiten wurden in Übereinstimmung mit der biologischen Sicherheit Verordnungen aus dem Französisch und Rechtsvorschriften der Europäischen Union durchgeführt.

1. Maus Infektion mit L. donovani-Promastigoten Parasites

1. Vorbereitung des Kulturmediums für die in vitro Aufrechterhaltung L. donovani-Promastigoten Parasiten, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. Verwenden Sie M199-Medium. Ergänzen M199-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (bei ​​56 ° C für 30 min hitzeinaktiviert), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO _3, 1 mM GluTamine RPMI 16040 Vitaminmischung, 10 mM Folsäure, 100 mM Adenosin, 7,6 mM Hämin, 50 U / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin.
2. Kultur LD1S Parasiten in 10 ml Komplettmedium M199 bei 26 ° C in einem 25 cm ² Kolben belüftet.
3. Unter Verwendung aufeinanderfolgender Differenz Zentrifugationsschritte, bereiten eine Bevölkerung von promastigote Parasiten, die in metazyklisch Formen angereichert sind.
   1. Ernte einen mittleren logarithmischen Phase Parasit Kultur. Zählen Sie auf ein hemocytomer. Resuspendieren 5 x 10 ⁵ Parasiten / ml in 10 ml Komplettmedium M199. Wächst der Parasit Kultur in anaeroben Bedingungen, bis sie das Ende der stationären Phase (in etwa 5-6 Tage) zu erreichen.
   2. Drehen Sie das LD1S Kultur bei 1200 × g für 10 min bei 26 ° C zu pelletieren nicht metazyklisch Parasiten, erholen Sie den Überstand und Spin es wieder bei 2500 × g bei 26 ° C für 10 min.
      Hinweis: Diese endgültige Pellet wird in hohem Grade in metazyklisch promastigote Parasiten bereichert.
   3. Das Pellet in 100 & mgr; l PBS. Entfernen Sie eine kleine Teilmenge zur Fixierung mit 25% Glutaraldehyd 1/100 v: v und zählen Parasiten mit einer Zählkammer.
4. Verdünne das angereicherte metazyklisch Parasitenpopulation bis 1 x 10 ^7/100 & mgr; l in PBS. Spritzen Sie die Suspension Parasit in die Schwanzvene einer narkotisierten Maus (siehe unten) mit einer 1-ml-Spritze mit einer 30-G-Nadel. Für Kontrolltieren injizieren 100 ul PBS in die Schwanzvene.

2. Chirurgische Verfahren

1. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit einem Biozid Desinfektionsspray und alle chirurgischen Instrumente mit 70% Ethanol für 30 min.
2. Vorbereiten eines Anästhetikums, entsprechend dem Gewicht des Tieres, die 125 mg / kg Ketamin und 12,5 mg / kg Xylazin in PBS verdünnt.
3. Wiegen Sie die Maus intraperitoneal injiziert und die geeignete Dosis des Anästhetikums unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 30 G-Nadel.
4. Halten Sie die Maus warm und prüfen Sie, ob die Maus vollständig anesthedurch Einklemmen des Fuß-Pad, bevor abgeschrieben. Re-Injektion eine halbe Dosis des Anästhetikums in der Maus alle 60 min.
5. Rasieren Sie die Maus Bauch und reinigen Sie sie mit Vetedine. Einen kleinen Einschnitt in der Haut und der Muskulatur unter dem Brustkorb auf der linken Seite des Bauches.
6. Legen Sie ein Stück feuchten Gaze auf dem Bauch knapp unter dem geöffneten Bereich. Setzen Sie die Leber und legen Sie sie auf die Gaze. Legen Sie ein Stück feuchten Gaze über der Leber.
7. Platzieren Sie eine 24 x 60 mm ² bis 150 & mgr; m dicke Deckglas, Cyanacrylat-gebundene an einem Metallrahmen, auf die Leber für die Visualisierung unter dem Mikroskop.
8. Schützen Sie die Augen der Maus mit einem nassen Gaze.
9. Nach dem Imaging-Sitzung, einschläfern das Tier betäubt durch Genickbruch.

3. Intravitalmikroskopie Imaging der Leber Architektur

1. Führen Sie die Intravitalmikroskopie-Experimente auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit ausgestattethermostatic gesteuerten Kammer, eine apochromatische 63X Ölimmersionsobjektiv Glycerin (NA 1,4), Argon (488 nm) und He-Ne (543 nm, 633 nm) und ein blauer Laser-Diode (405 nm).
2. Platzieren Sie die Maus auf der Bühne des Mikroskops mit dem Deckglas für den Leber nach unten auf das Ziel. Eingestellt, die Temperatur der Kammer auf 29 ° C. Stellen Sie den Fokus mit der Leber, um Autofluoreszenz zur Visualisierung der Sinuskurven zu ermöglichen.
3. Um das Gefäßsystem sichtbar zu machen, wird eine Lösung von 500 ug BSA-Alexa 647 in 100 ul PBS, für jede Maus. Injizieren dieser Lösung intravenös in die Schwanzvene von anästhesierten Maus unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 30 G-Nadel.
4. Um die Leberzellkerne sichtbar zu machen, wird eine Lösung aus Hoechst 33342 in PBS. Injizieren dieser Lösung bei 8 mg / kg Maus intraperitoneal unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 30 G-Nadel.
5. Benutzen Sie die normalen sequentiellen Modus, die 63X Sionsobjektiv und den Scanner bei 400 Hz, um Bild die LeberZellkerne und die Leber Vaskulatur. Schalten Sie den 405 nm blauen Diode für Hoechst Anregung und 633 nm Laser für BSA-Alexa 647-Anregung. Schalten Sie den Argon-Laser 488 nm, und definieren eine große Akquisition Band, um die Leber Autofluoreszenz zu visualisieren.

4. Intravitalmikroskopie Imaging der Leber für den Blutfluss Geschwindigkeitsmessung

1. Öffnen Sie die LAS-Software des Mikroskops (LAS AF-Viewer Version 3.1.0 build 8587). Wählen Sie das Resonanzscanner-Modus beim Öffnen des Mikroskop-Software.
2. Klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration, um die Hardware eingestellt. Klicken Sie auf und wählen Sie den Laser HeNe 633 Laser. Klicken Sie auf Einstellungen und wählen Sie 12 Bit Auflösung.
3. Klicken Sie auf die Übernahme-Menü. Im Weg Einstellungsfenster Strahl, wählen Sie die Ziel 63X und die 633 Laserleistung auf 100%. Aktivieren Sie die Signalverstärkung und Ausschalten eingestellten Parameter durch Auswahl Alexa-633 aus der PM1-3 Dropdown-Menü.
4. In der Registerkarte erwerben, wählen Sie die 'XYT' ErwerbModus. Stellen Formatbreite bei 1.024 x 1.024. Wählen Geschwindigkeit bei 8.000 Hz. Wählen Sie die Lochblende von 3 Airy-Einheiten. Wählen Sie einen Zoomfaktor von 3. den bidirektionalen Modus wählen Sie nicht.

5. Quantitative Analyse von RBC Velocity Mit den xyt Images (Methode 1)

1. Klicken Sie auf "Live" Symbol, um die Durchblutung an einem Live-Modus zu visualisieren. Wählen Sie das Gebiet von Interesse und ein bestimmtes Blutgefäß für die Analyse. Stellen Sie das Gefäß von Interesse in die horizontale Position durch Einstellung des "X", "Y" und Scanfeld Drehkoordinaten auf USB Bedienfeld.
2. Stoppen Sie den "Live" Modus, sobald das Gefäß von Interesse eingestellt. Ändern Sie das Format Satzbreite zu 1.024 x 256 in der Erfassungsmodus-Einstellungsfenster, Rauh = 1, Rahmen mittel = 1, wählen Sie "Stapel" 150. Klicken Sie auf "Start", um Bilder zu erwerben.
3. Für die quantitative Analyse von RBC Geschwindigkeit mit dem "xyt" Bild öffnen Sie die ImageJ Software. Wählen Sie das "Datei"Registerkarte in ImageJ, klicken Sie auf "Öffnen" wählen Sie dann die Datei von Interesse.
4. Gehen Sie auf die "Plugin" -Menü in ImageJ, wählen LOCI und Bio-Formaten importieren Optionen. In diesem Fenster wählen Sie den Stapel sehen Parameter als "Hyperstack. In dem Stapel Bestelloption, wählen Sie die Option: "xyzct". Hinweis: Es öffnet sich ein Fenster mit der ganzen Reihe von Akquisitionen.
5. Klicken Sie auf "Plugins" auf der ImageJ Menü und wählen MTrackJ Option. Klicke Sie auf 'Add' auf das kleine Fenster und klicken Sie auf die RBC zu verfolgen. Klicken Sie auf das gleiche RBC in jedem folgenden Frame und klicken Sie auf das Symbol "Maßnahme", um die Geschwindigkeit zu messen.
   Hinweis: Die erzeugte in .exl-Format gespeichert werden Datei.
6. Verfolgen Sie mindestens fünf RBCs pro Schiff und ein Minimum von drei einzelnen Schiffen gleicher Größe zu analysieren.

6. Quantitative Analyse von RBC Velocity Mit den xt Linienbilder (Methode 2)

1. Klicken Sie auf "Live", um das Blut f visualisierenniedrig im Live-Modus. Wählen Sie einen bestimmten Blutgefäß für die Analyse. Stellen Sie das Gefäß von Interesse in die horizontale Position. Stoppen Sie den "Live" Modus, sobald das Gefäß von Interesse eingestellt.
2. Wählen Sie den "xt" Scan-Modus und stellen Sie die zentralen Lumen des ausgewählten Schiffes entlang der Linie Scan. Set Formatbreite bei 1.024 x 512, speed = 8,000Hz, Linie mittel = 32 Zeit = 512. Klicken Sie auf "Start" und die xt Linienbilder erwerben.
3. Generieren Streifen zur quantitativen Analyse von RBC Geschwindigkeit durch Öffnen des .lif Datei und Öffnen des xt Linienbild von Interesse. In LAS AF-Software, wählen Sie "Experimente", öffnen Sie das .lif und wählen Sie das Bild. Hinweis: Es wird automatisch eine kymograph öffnen.
4. Messen der Zeit (t, auf der Y-Achse erhalten wird) für ein Partikel Strähne (die dunklen Reflexion) erforderlich, um einen bestimmten Abstand (d, auf der X-Achse erhalten wird) zu diesem kymograph reisen. Wählen Sie das Werkzeug "Draw line" und ziehen Sie eine Linie horizontal zur Ader. Beachten Sie die Entfernung inum und die Zeit in Sekunden, in der Ergebnis Lasche an der Unterseite des Bildes erzeugt.
5. Berechnen Geschwindigkeit als V = Weg / Zeit unter Verwendung der von der kymograph erhaltenen Werte.
6. Quantifizierung mindestens fünf Teilchen Streifen Bild xt pro und ein Minimum von drei einzelnen Schiffen der gleichen Größe.

Ergebnisse

Die spezifische architektonische Gestaltung der Sinuskurven in der Leber visualisiert basieren auf dem Autofluoreszenz Eigenschaft dieses Organs (Abbildung 1, Abbildung B und C, grün), die intraperitoneale Injektion von Hoechst für die Kennzeichnung von Hepatozyten-Kerne (1B, blau) und die intravenöse Injektion von BSA für die Fluoreszenzfärbung des Leberkreislaufsystems (1C, rot). Die Leber ist von mehreren verschiedenen Gefäß Subtypen mit verschiedenen Funktion...

Diskussion

Die jüngste Entwicklung der intravitalmikroskopische der Mausleber eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung der physiologischen Reaktion auf die Infektion in vivo und in Echtzeit ^5,9,10. Organdurchblutung ist ein wichtiger physiologischer Parameter, der häufig bei vielen Erkrankungen verändert ist. Der Status der Leber-Hämodynamik unter physiologischen und ansteckende Bedingungen bleibt jedoch ein wenig erforscht Bereich. In dieser Studie IVM-basierte Verfahren, das zuvor für die Unte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587