Прижизненные микроскопия Визуализация печени следующие<em&gt; Лейшмания</em&gt; Инфекция: оценка печеночного гемодинамики

Резюме

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Аннотация

Прижизненные микроскопии (IVM) является мощной техникой оптических изображений, что сделало возможным визуализацию, мониторинг и количественную оценку различных биологических событий в режиме реального времени, так и в живых животных. Эта технология значительно расширили наше понимание физиологических процессов и патогенных-опосредованной явлений в конкретных органах.

В этом исследовании, IVM применяется для печени мыши и протоколы предназначены для изображения в естественных кровеносную систему печени и измерять эритроцитов (RBC) скорость в отдельных сосудах печени. Для визуализации сосудов различных подтипов, которые характеризуют орган печени и выполнять измерения скорости кровотока, мышей C57BL / 6 внутривенно вводили с флуоресцентным плазмы реагента, который маркирует печени ассоциированных сосудистую. IVM позволяет в естественных условиях, режиме реального времени, измерения скорости РБК в определенном судне интересов. Установление этой методологии сделает возможнымисследовать гемодинамику печени в физиологических и патологических условиях. В конечном счете, эта методология визуализации на основе будет иметь важное значение для изучения влияния L. donovani инфекции на печени гемодинамики.

Этот метод может быть применен к другим инфекционным моделей и органов мышей и может быть продлен до доклинических испытаний эффекта препарата на воспаление путем количественного его влияние на кровоток.

Введение

Органоспецифические гемодинамики являются важными физиологические особенности любого органа млекопитающих. Нарушения в потоке крови может быть следствием воспаления и знак органной дисфункции ^1. Таким образом, кровоток организация, структура и функции появляются, как критические параметры для анализа в физиологических и патологических условиях. Методы, которые были широко используется для анализа потока крови в определенном органе содержит ряд ограничений, в том числе предела разрешения самой методики (например, допплерографии кровотока), емкость для измерения абсолютной кровотока только (объем крови в Блок служит орган) (например, оптической когерентной томографии) и измерение средних изменений в скорости в большом и гетерогенной популяции кровеносных сосудов ^2,3. Кровеносная система печени в соединяет различные подтипы сосудов, которые неоднородны по своим размерам, структуре и функции. Вэто исследование, прижизненный микроскопии (IVM) Технология формирования изображения применяется для оценки гемодинамики печени в естественных условиях, в режиме реального времени, с высоким разрешением и параллельно раскрыть характеристики отдельных кровеносных сосудов, которые составляют орган печени. Недавнее развитие этой мощной техники оптической визуализации позволяет исследователю собирать динамические данные на живых животных с высоким пространственным и временным разрешением. Позволяя прямой визуализации и реальную контроль времени конкретных и быстрых биологических процессов в естественных условиях, IVM предоставляет уникальную возможность для исследователя к изображению индивидуальный кровеносных сосудов, и измерить количественно и скорость одиночных красных кровяных клеток (эритроцитов) в течение специально выбран печеночная судно.

В этом исследовании, мы внедрили методику IVM в печень мыши, чтобы исследовать влияние инфекции мыши по гепатотропного Leishmania паразитов на гемодинамики печени. Л. donovaniэто агент, ответственный за висцеральный лейшманиоз, тяжелого заболевания характеризуется острым-на-хронических воспалительных реакций и патологии, который присутствует во многих органах, в том числе селезенки и печени. В экспериментальной модели мыши висцерального лейшманиоза, инфекция печени самостоятельно решения, тогда как селезенки инфекция является прогрессивным ^4. Эти результаты Leishmania инфекции по отношению к отдельным органам до сих пор не полностью поняты. Исследование печени и селезенки гемодинамики при патологических условиях прольет новый свет на хост-паразит взаимодействия и патогенеза заболевания.

Наша экспериментальная модель системы на основе выявления и визуализации печень наркозом мыши, которые получили внутривенную инъекцию специальных флуоресцентных красителей для маркировки печеночной intravasculature. Печень является благоприятным органом внутри жизненно микроскопии. После выполнения небольшого incisioп в животе, печени осторожно вовне и размещены на мокрой марлей, затем на покровное с целью сокращения каких-либо артефактов движения в связи с сердцебиение и дыхание. Затем печень помещают в поле зрения микроскопа линзы. По сравнению с селезенки и лимфатического узла, которые требуют использования двух фотонов микроскопии для исследования IVM, преимущество печени заключается в гомогенной 3D архитектура / анатомии, что позволяет использование обычной конфокальной микроскопии, с максимальной глубиной проникновения примерно 50 мкм, для прижизненной микроскопии изображений ^5-8.

Это исследование описывает два независимых метода визуализации для количественного измерения скорости РБК и скорости кровотока в отдельных кровеносных сосудов. В первом способе, кровоток печени получены с помощью ху би-мерный режим в течение долгого времени. Полученные данные XYT анализируются с помощью плагина MtrackJ в свободное программное обеспечение ImageJ, которая позволяет для отслеживания IndividUAL эритроциты в течение долгого времени. Во втором способе, одного кровеносного сосуда выбрано и соответствующий поток крови анализировали с использованием строчной развертки в режим быстрой приобретения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии-. Судно интерес сканируется на высокой частоте вдоль своей центральной оси через осевой линии. Скорость кровотока затем количественно на основе разницы в контрасте между немеченого темных эритроцитов и флуоресцентно-меченного плазмы. Интенсивность флуоресценции эритроцитов и плазмы, полученных по линии сканирования приведены на время, чтобы получить полосы, углы которых пропорциональны скоростям индивидуальной РБК.

Цель этой статьи заключается в предоставлении простой и воспроизводимый метод для визуализации и измерения скорости потока крови в пределах отдельных кровеносных сосудов печени и предоставлять основные инструменты для успешного выполнения операции мыши, IVM и количественного анализа скорости отдельные эритроциты. Тего подход позволит исследователям получить новые знания скорости кровотока при патологических условиях.

протокол

Заявление по этике: Все исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколами, которые были утверждены по уходу и использованию комитета Институциональная животных в Экс-Марсель Université, Франции. Женский мышей C57BL / 6 на 8 - 10 недель были получены в промышленном и обрабатываются в соответствии с правилами декрет N ° 8 87-848, 19 октября, 1987, Париж. Все эксперименты с использованием L. donovani LD1S паразиты были проведены в соответствии с правилами биобезопасности из Франции и Европейского союза законодательства.

1. Мышь Заражение L. donovani промастиготы Паразиты

1. Подготовьте питательную среду для поддержания в пробирке L. donovani промастиготы паразиты, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. Используйте M199 среду. Дополнение M199 среду с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (инактивированной нагреванием при 56 ° С в течение 30 мин), 25 мМ HEPES рН 6,9, 12 мМ NaHCO _3, 1 мМ Glutamine, RPMI 16040 смесь витаминов, 10 мМ фолиевой кислоты, 100 мМ аденозина, 7,6 мМ гемина, 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
2. Культура LD1S паразитов в 10 мл полной среды M199 при 26 ° С в 25 см ² вентилируемом колбу.
3. Использование последовательных дифференциальных шаги центрифугирования, подготовить население промастиготы паразитов, которые обогащены метациклических форм.
   1. Урожай в середине журнала фазы паразита культуры. Граф на hemocytomer. Ресуспендируют 5 × 10 ⁵ паразитов / мл в 10 мл полной среды M199. Растут паразита культуры в анаэробных условиях, пока они не достигнут конце стационарной фазы (примерно за 5-6 дней).
   2. Спин LD1S культуру при 1200 х г в течение 10 мин при 26 ° С для осаждения без метациклические паразитов, извлечения супернатанта и вращать его снова при 2500 х г при 26 ° С в течение 10 мин.
      Примечание: Этот последний осадок сильно обогащены метациклических промастиготы паразитов.
   3. Ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS. Удалить небольшой аликвоты для фиксации с 25% глутарового альдегида 1/100 по объему и рассчитывать паразитов с помощью гемоцитометра.
4. Развести обогащенного метациклических населения паразита до 1 х 10 ^7/100 мкл PBS в. Вводите паразита суспензии в хвостовую вену мыши наркозом (см ниже), используя 1 мл шприц с иглой 30 G. Для контрольных животных, вводят 100 мкл PBS в хвостовую вену.

2. Хирургические процедуры

1. Лечить рабочее пространство с биоцидной спрей дезинфицирующим и все хирургические инструменты с 70% этанола в течение 30 мин.
2. Подготовка раствора анестетика, в зависимости от веса животного, содержащий 125 мг / кг кетамина и 12,5 мг / кг ксилазина разбавленный в PBS.
3. Взвесить мыши и внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу анестетика с использованием 1 мл шприц с иглой 30 G.
4. Держите мышь теплой и убедитесь, что мышь полностью anestheквантующих, зажимая ноги площадку перед переходом. Re-вводить половину дозы раствора анестетика в мыши каждые 60 мин.
5. Бритье живот мыши и очистите его с Vetedine. Сделать небольшой надрез на коже и мускулатуре при грудной клетки с левой стороны живота.
6. Положите кусок влажной марлей на животе чуть ниже открывшемся области. Expose печень и поместить его на марлю. Положите еще один кусок влажной марлей над печени.
7. Поместите 24 х 60 мм ² до 150 мкм толщиной покровное, цианоакрилат связью с металлической рамой, на печень для визуализации под микроскопом.
8. Защитите глаза мыши с мокрым марли.
9. После сессии изображений, усыпить наркозом животного шейки дислокации.

3. Прижизненные микроскопия Визуализация печени архитектуры

1. Провести прижизненной микроскопии эксперименты на перевернутой конфокальной микроскопа, снабженного наhermostatic контролируется камеру, в апохроматические 63x масло глицерин иммерсионный объектив (NA 1.4), аргон (488 нм) и гелий-неоновый (543 нм, 633 нм) лазеров и синий диод (405 нм).
2. Наведите на сцене микроскопа с покровным покрывающей лицо печени вниз на цель. Установка температуры в камере до 29 ° С. Отрегулируйте фокусировку с помощью флуоресценции печени, чтобы для визуализации синусоиды.
3. Для визуализации сосудистой, приготовить раствор 500 мкг BSA-Alexa 647 разбавленный в 100 мкл PBS, для каждой мыши. Вводят этот раствор внутривенно в хвостовую вену под наркозом мыши с использованием 1 мл шприц с иглой 30 G.
4. Для визуализации ядер клеток печени, приготовить раствор Hoechst 33342 в PBS. Вводят этот раствор при дозе 8 мг / кг внутрибрюшинно мыши с использованием 1 мл шприц с иглой 30 G.
5. Используйте обычный последовательный режим, иммерсионный объектив 63X и сканер на 400 Гц до изображения печениЯдра клеток и сосудистой печени. Включите нм голубой диод 405 для возбуждения Hoechst и лазера 633 нм для БСА Alexa 647 возбуждения. Включите нм лазера Аргон 488 и определить большую полосу захвата для визуализации флуоресценции печени.

4. Прижизненные микроскопия Визуализация печени для измерения скорости потока крови

1. Откройте программное обеспечение LAS микроскопа (ЛАГ-AF просмотра версия 3.1.0 сборка 8587). Выберите режим резонанса сканера при открытии программы микроскопа.
2. Перейдите на вкладку конфигурации для установки оборудования. Нажмите на лазера и выберите He-Ne лазер 633. Нажмите на настройки и выберите 12 бит разрешение.
3. Нажмите на меню приобретения. В окне настроек тропинка пучка, выберите объективную 63x и настроить мощность лазера 633 до 100%. Активируйте усиления сигнала и от заданных параметров, выбрав Alexa-633 в меню PM1-3 упасть.
4. На вкладке приобретают, выберите '' XYT приобретениеРежим. Установите ширину формата в 1024 х 1024. Выберите скорость 8000 Гц. Выберите крошечное отверстие 3 Эйри единиц. Выберите коэффициент масштабирования 3. Не выбирайте режим двунаправленной.

5. Количественный анализ РБК Velocity Использование XYT изображений (метод 1)

1. Нажмите на иконку "Live", чтобы визуализировать поток крови на живом режиме. Выберите область интересов и выбрать конкретный кровеносный сосуд для анализа. Установите сосуд интерес в горизонтальное положение путем регулировки 'X', 'Y' и проверки вращения поля координаты на панели управления USB.
2. Остановите режим "Live" сразу судно интерес устанавливается. Изменить формат Установить ширину 1024 х 256 в режиме обнаружения окно, линия средний = 1, рамка средний = 1 установку, выберите "складывает" 150. Нажмите на "Пуск", чтобы получать изображения.
3. Для количественного анализа скорости РБК Использование "XYT" изображения откройте программное обеспечение ImageJ. Выберите "Файл"Вкладка в ImageJ, нажмите кнопку "Открыть", а затем выбрать интересующий файл.
4. Перейти к меню "плагин" в ImageJ, выберите локусов и Био-форматы импорта варианты. В этом окне выберите стек параметры просмотра как «HyperStack". В опции заказа стек, выберите опцию: "xyzct". Примечание: Это открывает окно со всеми сериями приобретений.
5. Нажмите на кнопку 'Plugins' в меню ImageJ и выберите опцию MTrackJ. Нажмите на иконку "Добавить" на маленьком окне и нажмите на РБК отслеживать. Нажмите на той же РБК в каждом следующем кадре и нажмите на значок «меры», чтобы измерить скорость.
   Примечание: файл, сгенерированный могут быть сохранены в формате .exl.
6. Трек менее пяти эритроцитов на судно и анализировать как минимум три отдельных сосудов одинакового размера.

6. Количественный анализ РБК Velocity Использование XT Line изображений (Метод 2)

1. Нажмите на "Live", чтобы визуализировать крови Fнизкий в режиме реального времени. Выбор конкретного кровеносного сосуда для анализа. Установите сосуд интерес к горизонтальном положении. Остановите режим "Live" сразу судно интерес устанавливается.
2. Выберите '' XT режим сканирования и установить центральный просвет выбранного судна вдоль линии сканирования. Установить ширину формата в 1024 х 512, скорость = 8,000Hz, линии среднего = 32, время = 512. Нажмите на "Пуск" и приобрести изображения XT линии.
3. Создание полосы для количественного анализа скорости РБК, открыв файл .lif и открытия изображения XT линии интересов. В программном обеспечении ЛАГ-AF, выберите "эксперименты", откройте .lif и выберите изображение. Примечание: Это будет автоматически открывать кимографе.
4. Измерьте время (т, полученный на оси Y), необходимое для полосы частиц (показывая темно отражение), чтобы поехать на определенное расстояние (D, полученный на оси X) на этом кимографе. Выберите инструмент "рисовать линию" и проведите линию по горизонтали на полосу. Обратите внимание на расстояние вмкм, а время в секундах, генерируемых в результате вкладки в нижней части изображения.
5. Рассчитать скорость как V = расстояние / время, используя значения, полученные из кимографе.
6. Количественно минимум пяти частиц полосы на хг изображения и минимум три отдельных судов того же размера.

Результаты

Конкретных архитектурная организация синусоид в печени может быть на autofluorescent имущества этого органа (рис 1, панель B и С, зеленый), внутрибрюшинного введения Hoechst для маркировки гепатоцитов ядер визуализируются основе (рис 1B, синий) и внутривенное введение флуоресцент...

Обсуждение

Недавнее развитие прижизненной микроскопии печени мыши открывает новые возможности для исследования физиологической реакции на инфекцию в естественных условиях и в режиме реального времени ^5,9,10. Орган кровотока является критическим физиологический параметр, который част...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587