以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

要約

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

要約

生体顕微鏡（IVM）は、リアルタイムで、ライブ動物における様々な生物学的事象の可視化、監視および定量化を可能にした強力な光イメージング技術です。この技術は、非常に生理的プロセスおよび特定の器官中の病原体媒介性の現象の理解を進めています。

本研究では、IVMはマウス肝臓に適用され、プロトコルが設計されている画像に、インビボで肝臓の循環系および個々の肝臓の血管内の赤血球（RBC）の速度を測定します。肝臓器官を特徴付ける別の容器サブタイプを視覚化し、血流速度測定を実行するために、C57BL / 6マウスに、静脈内に、肝臓に関連する血管系を標識する蛍光プラズマ試薬を注射します。 IVMは、in vivo、リアルタイム、関心のある特定の容器内のRBC速度の測定に有効になります。この方法論を確立することが可能になります生理学的および病理学的条件下での肝血行動態を調査します。最終的には、このイメージングベースの方法論は、Lの影響を研究するために重要になります肝血行動態上のドノバン感染。

この方法は、他の感染モデルとマウスの臓器に適用することができ、さらに血流に及ぼす影響を定量化することによって、炎症に対する薬物の効果を試験する臨床を事前に拡張することがあります。

概要

器官特異的血行動態が、任意の哺乳動物の臓器の重要な生理学的特徴です。血流の異常は、炎症の結果および臓器不全¹の徴候である可能性があり。したがって、血流組織、構造および機能は、生理学的および病理学的条件下での分析のためのような重要なパラメータを表示されます。一般的に、特定の器官における血流を解析するために使用されている技術は、技術自体の解像限界を含む、いくつかの制限を含む（ 例えば、血流のドップラーイメージング）当たりの血液のみ（容積絶対血流を測定するための能力臓器を提供するユニット）（ 例えば、光コヒーレンストモグラフィー）および血管^2,3の大規模かつ異種集団における速度の平均変化を測定します。肝臓の循環系は、それらのサイズ、構造と機能に不均質である別の容器サブタイプをリンクします。でこの研究は、生体顕微鏡（IVM）イメージング技術は、肝臓器官を構成する個々の血管の特性を明らかにするために、リアルタイムで、高解像度でかつ並列に、インビボでの肝血行動態を評価するために適用されます。この強力な光イメージング技術の最近の開発は、研究者は、高い空間分解能と時間分解能で生きている動物への動的なデータを収集することができます。直接可視化およびインビボでの特異的かつ急速な生物学的過程のリアルタイムの監視を可能にすることにより、IVMは、画像の個々の血管を研究するユニークな機会を提供し、具体的に選択された内の単一の赤血球（RBC）の速度を測定し、定量化します肝臓の血管。

本研究では、肝臓の血行動態上の肝親和性リーシュマニア寄生虫によるマウスの感染の影響を調査するために、マウスの肝臓でのIVMの技術を実装している。L.ドノバンエージェントは、内臓リーシュマニア症、急性·オン·慢性炎症反応と脾臓および肝臓を含む複数の器官で存在する病理学によって特徴付けられる重篤な疾患の原因です。内臓リーシュマニア症の実験マウスモデルでは、脾臓の感染は⁴プログレッシブであるのに対し、肝臓感染症は、自己解決である。個々の器官に対してリーシュマニア感染のこれらの成果は、まだ完全には理解されていません。病理学的条件の下で、肝臓と脾臓血行動態の検討は、ホスト寄生虫相互作用および疾患の病因に新たな光を当てるします。

我々の実験モデル系は、肝intravasculatureの標識に特異的な蛍光色素の静脈内注射を受け、麻酔したマウスの肝臓を露出し画像化に基づいています。肝臓は、イントラ不可欠な顕微鏡検査のための有利な器官です。小さなincisioを行った後nは腹部に、肝臓を穏やかに外部化され、その後、心拍や呼吸による任意のモーションアーチファクトを低減することを目的としたカバースリップ上に、濡れたガーゼの上に置きました。肝臓は、その後、顕微鏡レンズの視野内に配置されます。 IVMの研究のための2光子顕微鏡を使用する必要が脾臓およびリンパ節と比較して、肝臓の利点は、最大侵入深さで、従来の共焦点顕微鏡の使用を可能にする、その均質な3Dアーキテクチャ/解剖学であります約50μm、生体顕微鏡イメージング^5-8。

この研究は、個々の血管におけるRBC速度及び血流速度の定量的測定のための2つの独立した画像化方法を記載しています。第1の方法では、肝血流量は、時間の経過とともに、XY二次元モードを使用して取得されます。得られたXYTデータは個々をの追跡を可能にする無料のImageJソフトウェアでMtrackJプラグインを用いて分析されていますUAL赤血球経時。第2の方法では、単一の血管を選択し、対応する血液の流れは、共焦点レーザー走査顕微鏡のライン走査高速取得モードを使用して分析されます。興味のある容器は、軸線を通って、その中心軸に沿って高頻度で走査されます。血流速度は、次いで、標識されていない暗い赤血球および蛍光標識されたプラズマとの間のコントラストの差に基づいて定量化されます。ラインスキャンに沿って取得された赤血球と血漿の蛍光強度は、角度は、個々のRBCの速度に比例し、筋を得るために時間に対してプロットされています。

この記事の目的は、イメージングのための簡単​​かつ再現性のある方法を提供し、肝臓の個々の血管内の血流速度を測定し、マウスの手術、IVMとの速度の定量分析の成功のパフォーマンスのための基本的なツールを利用できるようにすることです個々の赤血球。 T彼のアプローチは、研究者は、病理学的条件下での血流速度に新たな洞察を得ることができます。

プロトコル

倫理文：すべての動物実験は、エクス·マルセイユ大学、フランスの制度動物実験委員会によって承認されたガイドラインおよびプロトコルに従って実施しました。 8での女性のC57BL / 6マウス - 古い10週間は、商業的にDécretN°8 87から848、1987年10月19日、パリの規則に従って取得され、処理されていました。 L.を使用して、すべての実験ドノバン LD1S寄生虫は、フランスと欧州連合の法律の生物学的安全性の規制に従って実施しました。

L. 1.マウスの感染ドノバン前鞭毛寄生虫

1. L.のインビトロで維持するために培地を準備しますドノバン前鞭毛の寄生虫、LD1S（MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D）。
   1. M199培地を使用してください。 10％ウシ胎児血清（熱不活性化56℃で30分間）とM199培地サプリメント、25mMのHEPES pHが6.9、12 mMの_炭酸水素ナトリウム、1mMのGLUtamine、RPMI 16040ビタミンミックス、10 mMの葉酸、100mMのアデノシン、7.6 mMのヘミン、50 U / mlペニシリンおよび50mg / mlストレプトマイシン。
2. 文化は、25cm ^2の換気フラスコ中で26℃で完全M199培地10ml中の寄生虫をLD1S。
3. 連続した差動遠心分離工程を使用して、metacyclic形で濃縮される前鞭毛の寄生虫の集団を準備します。
   1. 対数中期寄生虫文化を収穫。 hemocytomerを頼りにしています。完全なM199培地10ml中に5×10 ⁵寄生虫/ mlで再懸濁します。彼らは（約5-6日）で後期定常期に達するまで、嫌気的条件で寄生虫の文化を育てます。
   2. 、非metacyclic寄生虫をペレット上清を回収し、10分間26℃で2,500×gで再びそれをスピンする26℃で10分間1200×gでLD1S文化をスピン。
      注：この最終ペレットは非常metacyclic前鞭毛の寄生虫に富んでいます。
   3. 1にペレットを再懸濁PBSの00μlの。 Vと血球計数器を使用して、寄生虫をカウント：25％グルタルアルデヒドで1/100 Vを固定するための小アリコートを削除します。
4. PBS中の1×10 100分の^7μlに富む-metacyclic寄生虫集団を希釈します。麻酔したマウスの尾静脈への寄生虫懸濁液を注入30 G針を1mlシリンジを使用して（下記参照）。対照動物では、尾静脈に100μlのPBSを注入。

2.外科的処置

1. 30分間、70％エタノールで殺生消毒スプレーで作業スペースとすべての手術器具を消毒。
2. ケタミン125mgの/ kgであり、PBSで希釈したキシラジンの12.5ミリグラム/ kgのを含む、動物の体重に応じて、麻酔液を調製します。
3. マウスを計量し、腹腔内に30 G針で1mlシリンジを用いて麻酔薬の適切な投与量を注入します。
4. 暖かいマウスを保持し、マウスが完全にanestheであることを確認してください先に進む前に、フットパッドをつまんでtized。マウスでの麻酔液の半分量を再注入するごとに60分。
5. マウスの腹部を剃るとVetedineを使用してクリーニングします。腹部の左側の胸郭下の皮膚や筋肉組織の小さな切開を行います。
6. ちょうど開いた領域の下の腹部に湿ったガーゼを置きます。肝臓を露出させ、ガーゼの上に置きます。肝臓上記湿ったガーゼの別の部分を置きます。
7. 顕微鏡下で可視化のために肝臓に、シアノアクリレート結合した金属フレームに、150日24時間、週60ミリメートル厚さ^2μmのカバーガラスを配置します。
8. 濡れたガーゼでマウスの目を保護します。
9. イメージングセッションの後、頚椎脱臼により麻酔した動物を安楽死させます。

肝臓アーキテクチャの3生体顕微鏡イメージング

1. 時を備えた倒立型共焦点顕微鏡で生体顕微鏡の実験を行いますhermostatic室、アポクロマート63Xオイルグリセリン浸対物レンズ（NA 1.4）、アルゴン（488 nm）をヘリウムネオン（543ナノメートル、633 nm）のレーザーと青色ダイオード（405 nm）を制御します。
2. 目的に肝臓面を下に覆うカバーガラスと顕微鏡のステージ上にマウスを置きます。 29℃にチャンバーの温度を設定します。正弦波の可視化を可能にするために、肝臓の自己蛍光を使用してフォーカスを調整します。
3. 血管系を可視化するために、各マウスについて100μlのPBSで希釈した500μgのBSA-Alexaの647の溶液を調製。 30 G針を有する1mLの注射器を使用して麻酔したマウスの尾静脈に静脈内にこの溶液を注入します。
4. 肝細胞核を可視化するために、PBS中のヘキスト33342溶液を調製します。腹腔内に30 G針を1mlシリンジを用いて、マウスに8mg / kgでこの溶液を注入します。
5. 肝臓の画像に400 Hzで、通常シーケンシャルモード、63X浸対物レンズとスキャナを使用してください細胞核と肝血管系。ヘキスト励起用の405nmの青色ダイオードとBSA-Alexaの647励起用の633 nmのレーザーをオンにします。アルゴン488 nmレーザーをオンにして、肝臓の自己蛍光を可視化するために大規模な買収帯を定義します。

血流速度測定のための肝臓の4生体顕微鏡イメージング

1. 顕微鏡（LAS-AFビューアバージョン3.1.0ビルド8587）のLASソフトウェアを開きます。顕微鏡ソフトウェアを開くときに共鳴スキャナモードを選択します。
2. ハードウェアを設定するには、[設定]タブをクリックします。レーザーをクリックして、ヘリウムネオンレーザ633を選択します。設定をクリックして、12ビットの分解能を選択します。
3. 取得メニューをクリックします。ビーム経路の設定]ウィンドウで、目的63Xを選択して、100％に633レーザーパワーを設定します。ドロップダウンメニューPM1-3からのAlexa-633を選択することにより、信号利得をアクティブにし、設定したパラメータをオフにします。
4. 取得]タブでは、「XYT」買収を選択モード。 1,024×1024でフォーマット幅を設定します。 8,000 Hzで速度を選択します。 3エアリーユニットのピンホールを選択します。双方向モードを選択しないでください3のズーム倍率を選択します。

RBC速度の5定量分析XYT画像を用いた（方法1）

1. ライブモードでの血液の流れを可視化する「ライブ」アイコンをクリックします。関心のある領域を選択し、分析のための特定の血管を選択します。 USBのコントロールパネルの「X」、「Y」とスキャンフィールド回転座標を調整することにより、水平方向の位置に関心のある血管を設定します。
2. 興味のある容器がセットされると、「ライブ」モードを停止します。選択し、ウィンドウ、ライン平均= 1、フレーム平均= 1を設定取得モードで1024×256のフォーマット設定の幅を変更するには、画像を取得するために「スタート」の150をクリックし、「スタック」。
3. 「XYT」画像を使用して、RBC速度の定量分析のためのImageJソフトウェアを開きます。 「ファイル」を選択しますImageJの中のタブには、その後、対象のファイルを選択して「開く」をクリックします。
4. ImageJの中の「プラグイン」メニューに移動し、遺伝子座およびバイオフォーマットオプションをインポート]を選択します。このウィンドウで、「hyperstack」などのパラメータを表示するスタックを選択します。 「xyzct "：スタック順序のオプションでは、オプションを選択します。注：これは、企業買収のすべての一連のウィンドウが開きます。
5. ImageJのメニューの「プラグイン」をクリックし、MTrackJオプションを選択します。小さなウィンドウにある[追加]アイコンをクリックし、追跡するために、RBCをクリックしてください。各次のフレームで同じRBCをクリックして、速度を測定する「尺度」アイコンをクリックしてください。
   注：生成されたファイルは.exl形式で保存することができます。
6. 容器当たり5 RBCの最小値を追跡し、同じ大きさの3つの個々の血管の最小値を解析します。

XTライン画像を用いたRBC速度の6定量分析（方法2）

1. 血液Fを可視化する「ライブ」をクリックしますライブモードで低いです。分析のための特定の血管を選択します。水平位置に関​​心のある血管を設定します。興味のある容器がセットされると、「ライブ」モードを停止します。
2. 「XT」スキャンモードを選択し、ラインスキャンに沿った選択された容器の中央管腔を設定します。 1,024×512で設定された書式の幅、「開始」とXTライン画像を取得の速度= 8,000Hz、ライン平均= 32、時間= 512]をクリックします。
3. .lifファイルを開いて、目的のXTラインの画像を開くことによって、RBC速度の定量分析のための縞を生成します。 LAS-AFソフトウェアでは、「実験」を選択.lifを開いて画像を選択します。注：これは、自動的にカイモグラフを開きます。
4. このカイモグラフ上（X軸上に得られたD、）一定の距離を移動する（ダーク反射を示す）粒子ストリークのために必要な（T、Y軸上で得られる）の時間を測定します。ツール「線を引く」とスジに水平線を描画を選択します。距離に注意してください。μmで、画像の下部に結果タブで生成秒単位の時間。
5. カイモグラフから得られた値を使用して、V =距離/時間として速度を計算します。
6. XTの画像と同じ大きさの3つの個々の容器ごとに最低5粒子筋の最小値を定量化します。

結果

肝臓での正弦波の特定の建築組織が ​​可視化され、この器官（ 図1、パネルBおよびC、緑）、肝細胞核の標識のためのヘキストの腹腔内注射の自己蛍光性に基づくことができる（ 図1B、青）および肝循環系（ 図1C、赤）の染色用蛍光BSAの静脈内注射。肝臓は、直径（D）小血管の（Dで40-700μmの²の範囲の異なる機能や構造や大きさで、いくつかの...

ディスカッション

マウス肝臓の生体内顕微鏡検査の最近の開発は、in vivoで 、リアルタイム^5,9,10における感染に対する生理的応答の調査のための新しい可能性を開きます。臓器血流量は、しばしば多くの疾患において変化している重大な生理学的パラメータです。しかし、生理学的および感染性条件下での肝血行動態の状態が不十分な探求領域のままです。本研究では、以前に脾臓および腫瘍血...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587