מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Summary

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Abstract

מיקרוסקופיה intravital (IVM) היא טכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה שאפשרה את ההדמיה, הניטור והכימות של אירועים ביולוגיים שונים בזמן אמת ובבעלי חיים. טכנולוגיה זו התקדמה מאוד ההבנה של תהליכים פיסיולוגיים ותופעות בתיווך הפתוגן באיברים ספציפיים שלנו.

במחקר זה, IVM מוחל על כבד העכבר ופרוטוקולים נועדו תמונת in vivo מערכת הדם של הכבד ולמדוד תא דם אדום מהירות (RBC) בכלי כבד בודדים. כדי להמחיש את תת כלי שונה המאפיינים את האיבר הכבד ולבצע מדידות זרימת דם מהירות, C57Bl / 6 עכברים מוזרקים לוריד עם מגיב פלזמה ניאון שתוויות כלי הדם הקשורים בכבד. IVM מאפשר in vivo, בזמן אמת, מדידה של RBC מהירות בכלי ספציפי של עניין. הקמת מתודולוגיה זו תאפשר ללחקור פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. סופו של דבר, מתודולוגיה מבוססת הדמיה זה תהיה חשובה ללימוד ההשפעה של ל ' זיהום donovani על פרמטרים המודינמיים בכבד.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים זיהומיות אחרים ואיברי עכבר ועשויה להתארך עוד יותר לפרה-קלינית לבדיקה של ההשפעה של תרופה על ידי דלקת כימות השפעתו על זרימת דם.

Introduction

פרמטרים המודינמיים איברים ספציפיים הם תכונות פיסיולוגיות חשובות של כל איבר של יונקים. הפרעות בזרימת דם יכולות להיות התוצאה של דלקת וסימן לבעיות בתפקוד איבר ^1. כך, זרימת דם ארגון, מבנה ותפקוד יופיעו פרמטרים קריטיים כמו לניתוח בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. הטכניקות שהיו בשימוש נפוץ לניתוח זרימת דם באיבר מסוים מכילות מספר מגבלות, כוללים מגבלת הרזולוציה של הטכניקה עצמה (למשל ההדמיה דופלר זרימת דם), היכולת למדידת זרימת דם מוחלטת בלבד (נפח דם ל יחידה משרתת איבר) (למשל טומוגרפיה אופטי קוהרנטיות) והמדידה של שינויים במהירות ממוצע באוכלוסייה גדולה והטרוגנית של כלי דם ^2,3. מערכת הדם של כבד קישורים תת כלי שונה ההטרוגנית בגודל, המבנה והתפקוד שלהם. בטכנולוגיית הדמיה מחקר, מיקרוסקופיה intravital (IVM) זה מיושמת להעריך פרמטרים המודינמיים כבד in vivo, בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה ובמקביל לחשוף את המאפיינים של כלי דם הבודדים המרכיבים את האיבר הכבד. הפיתוח האחרון של טכניקת הדמיה זה חזק אופטית מאפשר לחוקר לאסוף נתונים דינמיים בחי בעלי חיים ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה. כך שהוא מאפשר להדמיה הישירה וניטור בזמן אמת של תהליכים ביולוגיים ספציפיים ומהירים in vivo, IVM מספק הזדמנות ייחודית לחוקר לכלי דם בודד תמונה, ולמדוד ולכמת את המהירות של תאי דם אדומים יחידים (RBC) בתוך נבחר במיוחד כלי כבד.

במחקר זה, יישמנו את טכניקת IVM בכבד העכבר כדי לחקור את ההשפעה של זיהום על ידי עכבר טפיל שושנת יריחו hepatotropic על פרמטרים המודינמיים כבד. L. donovaniהוא הסוכן האחראי לleishmaniasis הקרביים, מחלה קשה המתאפיינת בתגובות דלקתיות חריפות-על-כרוני ופתולוגיה שנמצאת באיברים רבים, כולל הטחול והכבד. במודל עכבר ניסיוני של leishmaniasis הקרביים, דלקת הכבד היא ואילו זיהום הטחול הוא פרוגרסיבי ⁴ פתרון עצמי. תוצאות אלה של זיהום שושנת יריחו ביחס לאיברים הבודדים עדיין לא הבינו לגמרי. חקירה של פרמטרים המודינמיים כבד וטחול במצבים פתולוגיים תשפוך אור חדש על יחסי גומלין מארח-טפיל והיווצרות מחלה.

מערכת המודל הניסיונית שלנו מבוססת על חשיפה והדמית הכבד של עכבר הרדים שקיבל הזרקה תוך ורידית של צבעי ניאון ספציפיים לתיוג של intravasculature הכבד. הכבד הוא איבר חיובי למיקרוסקופיה פנים-חיונית. לאחר ביצוע incisio קטןn בבטן, הכבד מוחצנת בעדינות והניח על גזה רטובה, ולאחר מכן על coverslip עם המטרה של הפחתת כל חפצי תנועה בשל פעימות לב ונשימה. הכבד ממוקם אז במבט של עדשת מיקרוסקופ. בהשוואה לצומת הטחול והלימפה הדורשת השימוש בשני מיקרוסקופיה פוטון ללימודי IVM, היתרון של הכבד הוא בארכיטקטורת 3D הומוגנית / האנטומיה שלה, המאפשרת לשימוש במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, עם עומק חדירה מקסימאלי של כ 50 מיקרומטר, הדמיה מיקרוסקופיה intravital ^5-8.

מחקר זה מתאר שתי שיטות הדמיה עצמאיות למדידת כמותית של מהירות וזרימת דם במהירות RBC בכלי דם בודדים. בשיטה הראשונה, זרימת דם בכבד נרכשה באמצעות מצב דו-ממדי XY לאורך זמן. נתונים xyt התוצאה מנותחים באמצעות תוסף MtrackJ בתוכנת ImageJ החופשית, המאפשר למעקב של individרע"מ RBCs לאורך זמן. בשיטה השנייה, כלי דם בודדים שנבחרו ואת זרימת הדם המתאים מנותחת באמצעות מצב רכישה מהירה סריקת קו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. הכלי של העניין נסרק בתדירות גבוהה לאורך הציר המרכזי שלה באמצעות קו צירי. זרימת דם המהירות אז לכמת מבוססת על ההבדל בניגוד בין אריתרוציטים כהים ללא תווית והפלזמה שכותרתו fluorescently. עוצמות הקרינה של תאי דם אדומים ופלזמה שנרכשו לאורך קו הסריקה הם זממו נגד זמן כדי להשיג פסים, הזוויות שלו הן פרופורציונליות למהירויות של RBC בודד.

מטרתו של מאמר זה היא לספק שיטה פשוטה לשחזור להדמיה ומדידת מהירות זרימת דם בתוך כלי דם בודדים של הכבד ולהפוך לזמינים את הכלים הבסיסיים לביצוע המוצלח של ניתוח עכבר, IVM וניתוחים כמותיים של המהירות RBCs הבודד. Tגישתו תאפשר לחוקרים כדי לקבל תובנות חדשות דם מהירות בתנאים פתולוגיים.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אקס-מרסיי Université, צרפת. C57Bl / 6 עכברים נקבה ב8-10 שבועות היו מסחריים שהושגו ויטופלו בהתאם לכללים של Décret N ° 8 87-848, 19 אוקטובר 1987, פריז. כל הניסויים באמצעות L. טפילי donovani LD1S נערכו בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מהחקיקה הצרפתית ואיחוד האירופי.

1. זיהום עכבר עם ל ' donovani Promastigote טפילים

1. הכן את מדיום התרבות לתחזוקה במבחנה של ל ' טפילי promastigote donovani, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
   1. השתמש בינוני M199. להשלים בינוני M199 עם 10% עוברי עגל בסרום (חום מומת-על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות), 25 מ"מ HEPES pH 6.9, 12 מ"מ NaHCO _3, Glu 1 מ"מtamine, RPMI 16040 שילוב ויטמין, חומצה פולית 10 מ"מ, 100 מ"מ אדנוזין, hemin 7.6 מ"מ, 50 U / פניצילין מיליליטר ו 50 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין.
2. תרבות LD1S טפילים ב 10 מיליליטר של מדיום M199 מלא ב 26 מעלות צלזיוס בבקבוק מאוורר 25 סנטימטר ^2.
3. באמצעות צעדי צנטריפוגה ההפרש רצופים, להכין אוכלוסייה של טפילי promastigote שמועשרים בצורות metacyclic.
   1. קציר תרבות טפילה שלב אמצע יומן. לסמוך על hemocytomer. Resuspend 5 x 10 ⁵ מיליליטר / טפילים ב 10 מיליליטר של מדיום M199 מלא. לגדול התרבות טפילה בתנאים אנאירוביים עד שהם מגיעים לשלב מאוחר הנייח (בכ 5-6 ימים).
   2. ספין תרבות LD1S ב1,200 XG במשך 10 דקות ב 26 ° C עד גלולה טפילים שאינם metacyclic, לשחזר את supernatant ולסובב אותו שוב ב 2500 XG ב 26 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
      הערה: גלולה סופית זה מועשר בטפילי promastigote metacyclic.
   3. Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. להסיר aliquot קטן לקיבוע עם glutaraldehyde 25% 1/100 v: v ולספור טפילים באמצעות hemocytometer.
4. לדלל את האוכלוסייה טפילה המועשר-metacyclic בPBS 1 x 10 ^7/100 μl. להזריק את ההשעיה הטפיל לוריד הזנב של עכבר הרדים (ראה להלן) באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G. לבעלי חיים שליטה, להזריק 100 μl PBS לתוך וריד הזנב.

2. ניתוחים

1. לחטא את מקום העבודה עם תרסיס חיטוי הורגות וכל מכשירי הניתוח עם אתנול 70% למשך 30 דקות.
2. הכן פתרון הרדמה, בהתאם למשקלו של בעל החיים, המכיל 125 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו12.5 מ"ג / קילוגרם של Xylazine מדולל PBS.
3. לשקול את העכבר וintraperitoneally להזריק המינון המתאים של הרדמה באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G.
4. שמור על העכבר חם ולבדוק שהעכבר הוא anesthe לחלוטיןtized ידי צובט את כרית כף הרגל לפני שתמשיך. להזריק מחדש מחצית מינון של חומר ההרדמה בעכבר בכל 60 דקות.
5. לגלח את הבטן של העכבר ולנקות אותו עם Vetedine. לעשות חתך קטן בעור והשרירים מתחת לכלוב בית החזה בצד השמאל של הבטן.
6. הנח פיסת הגזה לחה בבטן ממש מתחת לאזור פתח. לחשוף את הכבד ומניח אותו על הגזה. הנח פיסת הגזה לחה מעל הכבד אחר.
7. מניחים 24 x 60 מ"מ ^2-150 coverslip העבה מיקרומטר, למסגרת מתכת, על הכבד להדמיה תחת מיקרוסקופ-הערובה cyanoacrylate.
8. להגן על העיניים של העכבר עם גזה רטובה.
9. לאחר פגישת ההדמיה, להרדימו בהרדמה על ידי נקע בצוואר הרחם.

3. מיקרוסקופית Intravital הדמיה של האדריכלות הכבד

1. לבצע את ניסויי מיקרוסקופיה intravital במיקרוסקופ confocal הפוכה מצוידים בhermostatic מבוקר קאמרי, מטרת טבילת גליצרול שמן apochromatic 63X (NA 1.4), ארגון (488 ננומטר) וHeNe (543 ננומטר, 633 ננומטר) לייזרים ודיודה כחולה (405 ננומטר).
2. מניחים את העכבר על הבמה של מיקרוסקופ עם coverslip מכסה את פניו הכבד על המטרה. הגדר את הטמפרטורה של החדר עד 29 מעלות צלזיוס. התאם את המיקוד באמצעות autofluorescence הכבד כדי לאפשר להדמיה של sinusoids.
3. כדי להמחיש את כלי הדם, להכין פתרון של 500 מיקרוגרם BSA-Alexa 647 בדילול המלא של PBS 100 μl, לכל עכבר. להזריק את הפתרון הזה לוריד לוריד הזנב של העכבר הרדים באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G.
4. כדי להמחיש את גרעין תא הכבד, להכין פתרון של Hoechst 33342 בPBS. להזריק את הפתרון הזה בשעה 8 מ"ג / קילוגרם של עכבר intraperitoneally באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 30.
5. השתמש במצב הרגיל רציף, במטרה טבילת 63X והסורק ב 400 הרץ לתמונה הכבדגרעין תא וכלי הדם בכבד. הפעל דיודה 405 ננומטר הכחולה לעירור Hoechst וליזר 633 ננומטר לעירור BSA-Alexa 647. הפעל את לייזר ננומטר ארגון 488 ולהגדיר להקת רכישה גדולה כדי להמחיש את autofluorescence הכבד.

4. מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד למדידת זרימת דם מהיר

1. פתח את תוכנת LAS של המיקרוסקופ (הגרסה הצופה לאס-AF 3.1.0 לבנות 8587). בחר את מצב סורק תהודה בעת פתיחת תוכנת מיקרוסקופ.
2. לחץ על כרטיסיית התצורה כדי להגדיר את החומרה. לחץ על לייזר ובחר את לייזר HeNe 633. לחץ על הגדרות ובחר ברזולוציה ביטים 12.
3. לחץ על תפריט הרכישה. בחלון הגדרות מסלול הקרן, בחר 63X האובייקטיבי ולהגדיר את כוח הלייזר 633 עד 100%. הפעל את רווח אות ואת הפרמטרים שנקבעו על ידי בחירת Alexa-633 מהתפריט הנפתח PM1-3.
4. בכרטיסייה לרכוש, בחר את הרכישה 'xyt'מצב. רוחב פורמט נקבע על 1,024 x 1,024. בחר את המהירות ב 8000 הרץ. בחר את חריר של 3 יחידות אווריריות. בחר גורם הזום של 3. אל תבחר במצב דו-כיווני.

5. ניתוח כמותי של RBC מהירות שימוש בתמונות xyt (שיטה 1)

1. לחץ על סמל "חי" כדי להמחיש את זרימת הדם במצב חי. בחר תחום עניין ובחר כלי דם ספציפיים לניתוח. הגדר את הכלי של עניין למצב אופקי על ידי התאמת 'X', 'Y' וקואורדינטות סיבוב שדה סריקה בלוח בקרת USB.
2. עצור את המצב "חי" ברגע שהספינה של עניין מוגדרת. לשנות את רוחב סט הפורמט ל1,024 x 256 במצב רכישת הגדרת חלון, קו ממוצע = 1, ממוצע מסגרת = 1, בחר "ערימות" 150. לחצו על "התחל" כדי לרכוש תמונות.
3. לניתוח כמותי של RBC מהירות באמצעות התמונות "xyt" לפתוח את תוכנת ImageJ. בחר 'הקובץ'כרטיסייה בImageJ, לחץ על "פתח" ואז לבחור את הקובץ של עניין.
4. לכו לתפריט "תוסף" בImageJ, בחר לוקוסים וביו-פורמטים לייבא אפשרויות. בחלון זה, בחר את ערימת צפייה פרמטרים כמו 'hyperstack'. באפשרות כדי ערימה, בחר באפשרות: "xyzct". הערה: זה פותח חלון עם כל הסדרה של רכישות.
5. לחץ על 'תוספים' בתפריט ImageJ ובחר באפשרות MTrackJ. לחץ על סמל 'הוסף' בחלון הקטן ולחץ על RBC כדי לעקוב אחר. לחץ על אותו RBC בכל מסגרת הבאה ולחץ על סמל 'מידה' כדי למדוד את המהירות.
   הערה: הקובץ שנוצר ניתן לשמור בפורמט .exl.
6. עקוב אחר מינימום של חמישה RBCs לאונייה ולנתח מינימום של שלושה כלי בודדים באותו הגודל.

6. ניתוח כמותי של RBC מהירות שימוש בתמונות קו XT (שיטה 2)

1. לחץ על "חי" כדי להמחיש את F הדםנמוך במצב חי. בחר כלי דם ספציפיים לניתוח. הגדר את הכלי של עניין למצב אופקי. עצור את המצב "חי" ברגע שהספינה של עניין מוגדרת.
2. בחר את מצב הסריקה 'XT "ולהגדיר את לומן של הכלי הנבחר לאורך קו הסריקה המרכזי. רוחב פורמט סט ב1,024 x 512, מהירות = 8,000Hz, ממוצע הקו = 32, זמן = 512. לחצו על "התחל" ולרכוש את תמונות קו XT.
3. צור פסים לניתוח כמותי של RBC מהירות על ידי פתיחת קובץ .lif ופתיחת תמונת קו XT של עניין. בתוכנה לאס-AF, בחר "ניסויים", לפתוח את .lif ובחר את התמונה. הערה: באופן אוטומטי זה ייפתח רשם גלים.
4. מדוד את הזמן (t, מתקבל על ציר Y) הנדרש לפס חלקיקים (מראה השתקפות כהה) לנסוע מרחק מסוים (ד, שהושג על ציר X) על רשם גלים זה. בחר באפשרות "לצייר קו" ולמתוח קו אופקי לפס. שים לב למרחק במיקרומטר והזמן בשניות שנוצרו בכרטיסיית התוצאה בחלק התחתון של התמונה.
5. חישוב מהירות כV = מרחק / זמן שימוש בערכים המתקבלים מרשם הגלים.
6. לכמת מינימום של חמישה פסי חלקיקים לכל תמונת XT ומינימום של שלושה כלי בודדים באותו הגודל.

תוצאות

הארגון האדריכלי הספציפי של sinusoids בכבד יכול להיות דמיינו מבוסס על רכוש autofluorescent של איבר זה (איור 1, לוח ב 'וג', ירוק), זריקת intraperitoneal של Hoechst לתיוג של גרעיני hepatocyte (איור 1, כחול) וההזרקה תוך ורידית של BSA ניאון להכתמה של מערכת דם בכבד (איור 1 ג, אד?...

Discussion

הפיתוח האחרון של מיקרוסקופיה intravital של כבד העכבר פותח אפשרויות חדשות לחקירת תגובה הפיזיולוגית לזיהום in vivo ובזמן אמת ^5,9,10. זרימת דם איברים היא פרמטר פיסיולוגי קריטי שבו לעתים קרובות שינה במחלות רבות. עם זאת, מעמדו של פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
BSA-Alexa 647	lifetechnologies	A34785
Dextran-FITC 500 mol wt	SIGMA	46947
Ketamine	PanPharma	20434
Xylazine	Bayer	KP07KEU
Vetedine	Pharma Animal	6869029
Cyanoacrylate liquid	Cyanolit	5833300005
Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013	Molecular machines	50103
Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm	DiaPath	61061
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS-SP5
LAS-AF viewer	Leica software	Version 3.1.0 buid 8587