温敏纳米结构表面的组织工程准备

摘要

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

摘要

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

引言

纳米结构表面最近吸引了大量关注，因为它们的各种潜在应用，包括图案化，细胞培养，清洗，和表面交换。例如，通过荷叶和其它响应表面的纳米结构启发超疏水表面是能够反应以外部刺激^1-4。

朗缪尔膜是最广泛研究的聚合物涂层中的一个。朗缪尔膜通过滴两性分子到空气-水界面^5-8形成。该膜然后可通过物理或化学吸附被转移到一个固体表面上，并且可以使用垂直和水平转移方法^9-12被控制在固体表面上的分子的构象。朗缪尔膜的密度可以通过压缩的空气 - 水界面精确地调节。最近，这种方法也被证明有效的用于制造纳米尺度的海岛structur利用两亲性嵌段共聚物上课。纳米结构被假定为是由疏水性链段的芯和亲水性链段^13-17的壳的。此外，在表面上的纳米结构的数量是通过控制在界面上的嵌段共聚物的每个分子的面积（A _M）调节。

我们专注于一个原始，独特的无支架组织工程方法，细胞片工程，使用温度响应培养表面。所开发的技术已经应用到再生疗法为各种器官^18。温度响应培养表面是由接枝聚（N- -isopropylacrylamide）（PIPAAm），温度响应分子到表面^19-27制成。 PIPAAm及其共聚物表现出的低临界溶液温度（LCST）在水性介质中在接近32℃的温度。培养表面还表现出一个温度响应alternati关于疏水性和亲水性之间。在37℃时，PIPAAm接枝的表面变得疏水的，细胞容易附着和增殖的表面上，以及对现有的组织培养聚苯乙烯。当温度降低至20℃时，表面变得亲水，和细胞表面的自发分离。因此，表面上培养的汇合细胞可被收获作​​为通过改变温度完整片。这些细胞粘附和剥离性能也由朗缪尔膜包衣对实验室演示^26,27制成的表面显示。聚苯乙烯（P（ST））和PIPAAm（ST-IPAAm）构成的嵌段共聚物的朗缪尔膜制成。与特定的A _M的朗缪尔膜可以水平地转移到疏水改性的玻璃基板。此外，对细胞粘附和脱离由响应于温度的准备好的表面进行评价。

_content">这里，我们描述协议热 - 反应的两亲嵌段共聚物的玻璃基板上构成的纳米结构的Langmuir膜的制造。我们的方法可以用于在表面科学的各个领域的有机纳米膜提供有效的制造技术，并可以有利于更在有效控制细胞粘附和从表面自发支队。

研究方案

1.聚苯乙烯块聚（N -isopropylacrylamide）通过两步可逆加成断裂链转移（RAFT）自由基聚合合成

1. 溶解苯乙烯（153.6毫摩尔），4-氰基-4-（ethylsulfanylthiocarbonyl）sulfanylpentanoic酸（ECT; 0.2毫摩尔）和4,4'-偶氮二（4-氰基戊酸）（ACVA; 0.04毫摩尔）在40ml 1， 4-二恶烷。冻结真空下在液氮中的溶液15-20分钟以除去反应性物质，并逐步在RT解冻。确保该解决方案完全解冻并重复这一冷冻泵解冻循环脱气三次。
2. 得到的聚苯乙烯（PST）（分子量:13500），通过聚合一大分子RAFT试剂在70℃的油浴中15小时。
3. 沉淀聚苯乙烯大分子RAFT试剂用800毫升乙醚，并在真空干燥。
4. 溶解在4ml的1,4-二恶烷的IPAAm单体（4.32毫摩尔），聚苯乙烯大分子RAFT试剂（0.022毫摩尔），和ACVA（0.004毫摩尔）。
5. 去掉如在步骤1.1中提到在由冷冻 - 抽吸 - 解冻脱气循环溶液中的氧气。
6. 在70℃下进行聚合为在脱气处理后的油浴15小时。获得合成的St-IPAAm分子（MW:32800）中相同的方式作为聚苯乙烯大分子RAFT试剂。

2.硅烷化修饰的疏水玻璃基板的制备

1. 洗涤玻璃基板（24毫米×50毫米）与过量的丙酮和乙醇超声的为5分钟，除去表面的污染物。
2. 干燥烘箱中在基片在65℃下30分钟。然后用氧等离子体（400瓦特，3分钟）在RT以激活基片的表面上。
3. 浸入基板中含有1％己基三甲过夜在RT silanize基板甲苯。
4. 洗硅烷化基板在甲苯和丙酮中浸泡30分钟以除去未反应试剂。
5. 在110℃下进行2小时退火衬底以彻底固定在Surface。
6. 削减玻璃刀硅烷化衬底25毫米×24毫米，以适应细胞培养皿（碟尺寸:φ35毫米）。

3.朗缪尔电影和电影调入表面的制备

1. 放置朗缪尔膜仪器在机柜防止尘埃积聚。
2. 洗朗缪尔槽（尺寸:580毫米×145毫米）中，用蒸馏水和乙醇以除去污染物的障碍。
3. 通过用絮的毛巾擦干槽和障碍。然后填充约1.1毫升蒸馏水槽，并设置在槽两侧的障碍。请注意，应在不在下面的步骤溢出从3.5至3.13中加入蒸馏水。
4. 热的铂的Wilhelmy板（周长:39.24毫米），用于与一个气体燃烧器监测的表面张力，直到板变红，然后用蒸馏水洗涤以除去污染物。暂停威廉米悬片上附接至电线表面压力测量仪。
5. 根据制造商的协议零表面压力测量仪。通过在槽的两侧的障碍压缩上槽的空气-水界面直到接口达到大约50厘米²没有聚合物的任何液滴。
6. 抽吸小的污染物，直到表面压力几乎为0达因/厘米。
7. 重新定位在两侧的障碍，并加入蒸馏水，以补偿的蒸馏水从步骤3.6的减少。
8. 溶解5毫克合成的St-IPAAm分子在5毫升氯仿中显影溶液。
   注意:二氯甲烷或甲苯，也可以用作溶剂。
9. 轻轻放下圣IPAAm的27微升溶于氯仿到使用微量或微量低谷。
10. 等待5分钟后，以允许氯仿完全蒸发，水平移动两个壁垒以压缩的St-IPAAm molecu勒在界面。保持在0.5毫米/秒，直到50达到厘米²目标区域的障碍压缩率。
    注:一种快速的压缩率会导致在朗缪尔薄膜缺陷。
11. 测量表面压力具有根据制造商的协议压缩过程中附着于表面压力测量仪器的铂的Wilhelmy板（π）-A _米等温线。
12. 到达目标区域的大小后，保持表面5分钟，以使圣IPAAm分子放松;该分子不压缩后立即达到平衡。
13. 使用传送装置5分钟以有力吸附膜转移的Langmuir膜疏水改性的玻璃基板。固定在装置上平行疏水玻璃基板。将设备连接到对准平台和垂直移动。
14. 在一个desiccato传送装置和干燥1天水平提起衬底河

4.培养细胞和朗缪尔电影转印表面优化细胞粘附和支队

1. 至在37℃，在5％的组织培养聚苯乙烯（TCPS）用含有10％胎的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）制备细胞悬浮液，培养的牛颈动脉内皮细胞（牛主动脉内皮）至三分之一合流_的 CO ₂和95％空气牛血清（FBS）和100单位/毫升青霉素。
2. 达到汇合后，在37℃下在5％CO ₂和95％空气治疗的BAECs用3ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA的3分钟。
3. 通过加入10毫升含有10％FBS的所述DMEM中停用胰蛋白酶-EDTA，并收集细胞悬液至50ml锥形管中。
4. 离心，在120×g离心5分钟，吸出上清液。重悬用10ml的DMEM中的细胞。
5. 将在紫外线照射下的圣IPAAm表面干净的长椅上消毒5分钟。
6. 种子回收CE在圣IPAAm LLS表面以1.0×10 ^4个细胞/ cm ²通过一次性血细胞计数器计数的浓度，并通过在37℃下装有的培养箱，用5％ _的 CO ₂和95％的显微镜观察表面上的细胞空气。
   注:装备净化台紫外线消毒的圣IPAAm表面。
7. 通过用放大10倍相差显微镜，在37℃大约24.5小时粘附的BAECs的记录时间推移的图像。后BAEC粘附，在20℃下从圣IPAAm表面的BAECs的记录脱离大约3.5小时。

在朗缪尔电影调入表面5.细胞板材加工

1. 以相同的方式用于培养牛主动脉内皮第4节中叙述。
2. 种子上的St-IPAAm表面共1.0×10 ^5个细胞/ cm ²的和在5％CO ₂在37℃下孵育3天。汇合的BAECs在20℃自发分离。

结果

聚苯乙烯和聚（N- -isopropylacrylamide）（圣IPAAms）具有特定分子量的构成的嵌段共聚物通过RAFT自由基聚合来合成。 ECT被作为Moad 等人 ²⁸所述制备作为链转移剂。不同PIPAAm链长的二圣IPAAm分子合成，并且所得到的嵌段聚合物进行表征通过¹ H核磁共振（NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）。圣IPAAms的分子量分别为32800和67900，具有窄分子量分布（1.31和1.50）。?...

讨论

温度响应性表面由朗缪尔 - 谢弗方法制造，并为细胞粘附/拆卸和细胞片恢复表面性能进行了优化。当使用表面的制造这种方法，几个步骤是关键的。圣-IPAAm分子的分子的组合物具有在表面结构和有很大影响的表面的稳定性，并且通过扩展，对细胞粘附和脱离。特别是，圣IPAAm分子应具有窄的分子量分布。在我们的方法中，两次与不同PIPAAm链长的St-IPAAm分子通过RAFT聚合合成，使分子量和分子量分布?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon