Preparación de Superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la Ingeniería de Tejidos

Resumen

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Resumen

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Introducción

superficies nanoestructuradas recientemente han atraído considerable atención debido a sus diversas aplicaciones potenciales, incluyendo patrones, cultivo celular, limpieza y cambio de superficie. Por ejemplo, las superficies superhydrophobic inspirados en la nanoestructura de la hoja de loto y otras superficies sensibles son capaces de reaccionar a los estímulos externos ^1-4.

La película de Langmuir es uno de los recubrimientos de polímeros más ampliamente estudiados. Una película de Langmuir está formada por moléculas anfifílicas caer en una interfaz aire-agua ^5-8. La película puede ser entonces transferida a una superficie sólida por adsorción física o química, y la conformación molecular sobre una superficie sólida se puede controlar utilizando métodos de transferencia vertical y horizontal ^9-12. La densidad de la película de Langmuir se puede regular con precisión mediante la compresión de la interfaz aire-agua. Recientemente, este método también ha demostrado ser eficaz para la fabricación nanométrica structur mar-islaes mediante la utilización de copolímeros de bloques anfifílicos. Las nanoestructuras se supone que consisten en un núcleo de segmentos hidrófobos y una cubierta de segmentos hidrófilos ^13-17. Además, el número de nanoestructuras sobre una superficie se regula controlando el área por molécula (A _m) del copolímero de bloque en la interfase.

Nos hemos centrado en un original, el enfoque de la ingeniería de tejidos sin andamios únicos, ingeniería lámina celular, utilizando una superficie de cultivo sensible a la temperatura. La tecnología desarrollada se ha aplicado a terapias regenerativas para diversos órganos ^18. Una superficie de cultivo sensible a la temperatura fue fabricado por injerto de poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), una molécula sensible a la temperatura, sobre una superficie de ^{19 a 27.} PIPAAm y sus copolímeros presentan una temperatura de solución crítica inferior (LCST) en medio acuoso a temperaturas cerca de 32 ° C. La superficie de cultivo también exhibió una alternati sensible a la temperatura en entre hidrofobicidad e hidrofilicidad. A 37 ° C, la superficie injertada con PIPAAm se convirtió hidrófobo, y las células fácilmente conectado y proliferaron en la superficie, así como en poliestireno de cultivo tisular convencional. Cuando la temperatura se bajó a 20 ° C, la superficie se hizo hidrófila, y células separadas espontáneamente de la superficie. Por lo tanto, las células confluentes cultivadas en la superficie podrían ser cosechadas como una hoja intacta cambiando la temperatura. Estas propiedades de adhesión celular y la separación también se muestran por una superficie fabricada por recubrimiento de película de Langmuir para la demostración de laboratorio ^{26, 27.} Se fabricó una película de Langmuir de copolímeros de bloque compuestos de poliestireno (P (St)) y PIPAAm (St-IPAAm). La película de Langmuir con una A específica _m podría ser transferido horizontalmente a un sustrato de vidrio hidrofóbicamente modificado. Además, se evaluó la adhesión celular encendido y el desprendimiento de la superficie preparada en respuesta a la temperatura.

_content "> A continuación, describimos los protocolos para la fabricación de una película de Langmuir nanoestructurado compuesto por copolímeros de bloques anfifílicos termo-sensible en un sustrato de vidrio. Nuestro método puede proporcionar una técnica de fabricación eficaz para nanopelículas orgánicos en diversos campos de la ciencia de superficies y puede facilitar más el control efectivo de la adhesión celular en y el desprendimiento espontáneo de una superficie.

Protocolo

1. Síntesis de poli bloque de poliestireno (N -isopropylacrylamide) por dos pasos reversible de transferencia de cadena por adición-fragmentación (RAFT) polimerización por radicales

1. Disolver estireno (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) ácido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmol), y 4,4'-azobis (ácido 4-cianovalérico) (ACVA; 0,04 mmol) en 40 ml de 1, 4-dioxano. Congelar la solución en nitrógeno líquido al vacío durante 15-20 minutos para eliminar las especies reactivas y poco a poco se descongele a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución esté completamente descongelado y repetir este ciclo de desgasificación por congelación-descongelación de la bomba tres veces.
2. Obtener el poliestireno (PST) (Mw: 13.500) como agente de RAFT macro mediante polimerización a 70 ° C durante 15 horas en un baño de aceite.
3. Agente de macro BALSA precipitado PSt con 800 ml de éter y se seca al vacío.
4. Disolver monómero IPAAm (4,32 mmol), agente de RAFT macro PST (0,022 mmol), y ACVA (0,004 mmol) en 4 ml de 1,4-dioxano.
5. retirarel oxígeno en la solución por los ciclos de desgasificación por congelación bombeo-descongelación como se ha mencionado en el paso 1.1.
6. Realizar una polimerización a 70 ° C durante 15 horas en un baño de aceite después de la desgasificación. Obtener sintetizado molécula St-IPAAm (Mw: 32.800) en la misma manera que el agente de RAFT macro PST.

2. Preparación de sustratos de vidrio Silanized hidrófoba modificados

1. sustratos de vidrio de lavado (24 mm x 50 mm) con un exceso de acetona y etanol y se somete a ultrasonidos durante 5 min para eliminar contaminantes de la superficie.
2. Secar los sustratos en un horno a 65 ° C durante 30 min. A continuación, utilice plasma de oxígeno (400 W, 3 min) para activar las superficies de los sustratos a temperatura ambiente.
3. Sumergir los sustratos en tolueno que contiene 1% hexiltrimetoxisilano durante la noche a RT a silanizar el sustrato.
4. Lavar los sustratos silanizados en tolueno y se sumerja en acetona durante 30 minutos para eliminar los agentes que no han reaccionado.
5. sustratos de recocido durante 2 horas a 110 ° C para inmovilizar a fondo los sTu cara.
6. Cortar los sustratos silanized por un cortador de vidrio de 25 mm x 24 mm para adaptarse a las placas de cultivo celular (tamaño del plato: φ35 mm).

3. Preparación de Langmuir Films y Cine-transferido Superficie

1. Coloque el instrumento película de Langmuir en un armario para evitar la acumulación de polvo.
2. Lavar la artesa de Langmuir (tamaño: 580 mm x 145 mm) y las barreras con agua destilada y etanol para eliminar los contaminantes.
3. Secar la cubeta y las barreras frotando con una toalla sin pelusa. A continuación, llenar la cubeta con aproximadamente 110 ml de agua destilada, y establecer las barreras a ambos lados de la artesa. Tenga en cuenta que el agua destilada se debe añadir sin derramar en los siguientes pasos 3,5-3,13.
4. Calentar una placa de Wilhelmy de platino (perímetro: 39.24 mm) para el control de la tensión superficial con un quemador de gas hasta que la placa se vuelve rojo y luego lavar con agua destilada para eliminar los contaminantes. Suspender la placa de Wilhelmy en un cable conectado ael instrumento superficie de presión-medición.
5. Poner a cero el instrumento superficie de presión de medición de acuerdo con el protocolo del fabricante. Comprimir la interfase aire-agua en la cubeta por las barreras en ambos lados de la cubeta hasta que la interfaz alcanza aproximadamente 50 cm ² sin ningún tipo de gotas de polímero.
6. Aspirar los contaminantes pequeños hasta que la presión en la superficie es casi 0 mN / m.
7. Volver a colocar las barreras en ambos lados, y añadir agua destilada para compensar la disminución de agua destilada desde el paso 3.6.
8. Disolver 5 mg de la molécula de St-IPAAm sintetizado en 5 ml de una solución de desarrollo de cloroformo.
   Nota: diclorometano o tolueno también se puede utilizar como disolvente.
9. deje caer suavemente 27 l de St-IPAAm disueltos en cloroformo en la cubeta usando una microjeringa o micropipeta.
10. Después de esperar 5 min para permitir la evaporación completa de cloroformo, mover ambas barreras horizontalmente para comprimir el molecu St-IPAAmLe en la interfase. Mantener la tasa de compresión de las barreras a 0.5 mm / seg hasta que el área objetivo de 50 cm ² se alcanza.
    Nota: Una tasa de compresión rápida provoca defectos en la película de Langmuir.
11. Medir la presión superficial (π) -A _m isotermas con la placa de Wilhelmy de platino unida a la superficie de presión del instrumento de medición de durante la compresión de acuerdo con el protocolo del fabricante.
12. Después de alcanzar el tamaño del área objetivo, mantener la superficie durante 5 min para permitir que las moléculas de St-IPAAM se relajen; las moléculas no alcanzan el equilibrio inmediatamente después de la compresión.
13. La transferencia de la película de Langmuir a un sustrato de vidrio modificado hidrófobamente usando un aparato de transferencia durante 5 min para adsorber fuertemente la película. Fijar el sustrato de vidrio hidrófobo en paralelo en el dispositivo. Conectar el dispositivo a una etapa de alineación y se mueven perpendicularmente.
14. Levante el sustrato horizontalmente con el aparato de transferencia y seco durante 1 día en un desiccator.

4. Optimización de cultivo de células y la adhesión celular y Desprendimiento en la Superficie de Langmuir película transferida

1. Para preparar las suspensiones de células, células endoteliales cultura bovina de la arteria carótida (BAECs) para tercera confluencia a 37 ° C en 5% de _CO2 y 95% de aire en el cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% fetal de suero bovino (FBS) y 100 U / ml de penicilina.
2. Después de alcanzar la confluencia, el tratamiento de BAECs con 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C en 5% de _CO2 y 95% de aire.
3. Desactive la tripsina-EDTA mediante la adición de 10 ml de DMEM que contenía el 10% de FBS, y recoger la suspensión de células a un tubo cónico de 50 ml.
4. Centrifugar a 120 xg durante 5 min, y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células con 10 ml de DMEM.
5. Coloque las superficies St-Ipaam bajo luz ultravioleta sobre un banco limpio para esterilizar durante 5 min.
6. Sembrar el ce recuperadoLLS en el St-IPAAm superficies a una concentración de 1,0 x 10 ⁴ células / cm ² contados por un hemocitómetro desechable y observar las células en las superficies por un microscopio equipado con una incubadora a 37 ° C con 5% de _CO2 y 95% aire.
   Nota: Esterilizar las superficies St-Ipaam por la luz ultravioleta equipado con una mesa de trabajo limpia.
7. Registra imágenes con lapso de tiempo de BAECs adherentes de aproximadamente 24,5 horas a 37 ° C mediante un microscopio de contraste de fases con un aumento de 10X. Después de BAEC adhesión, ficha desprendimiento de las BAECs de la superficie St-IPAAm a 20 ° C durante aproximadamente 3,5 hr.

5. Hoja de la célula de fabricación en las superficies transferidas con película de Langmuir

1. BAECs de cultivo utilizados en la misma forma descrita en la Sección 4.
2. Sembrar un total de 1,0 x 10 ⁵ células / cm ² en superficies St-IPAAM y se incuba durante 3 días a 37 ° C en 5% de CO _2. Confluentes BAECs separa espontáneamente a 20 ° C.

Resultados

Los copolímeros de bloques compuestos de poliestireno y poli (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) con pesos moleculares específicos se sintetizaron por polimerización por radicales balsa. ECT se preparó como un agente de transferencia de cadena como se describe en Moad et al. ^28. Dos moléculas St-IPAAm de diferentes longitudes de cadena PIPAAm se sintetizaron, y los polímeros de bloques obtenidos se caracterizan por ¹ H resonancia magnética ...

Discusión

Una superficie sensible a la temperatura fue fabricado por el método de Langmuir-Schaefer, y las propiedades de la superficie para la recuperación de la adhesión celular / desprendimiento y lámina de células se optimizaron. Cuando se utiliza este método para la fabricación de superficies, varios pasos son críticos. La composición molecular de las moléculas de St-IPAAM tiene un gran efecto sobre la estructura de la superficie y la estabilidad de la superficie, y por extensión, sobre la adhesión celular y desp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon