Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Zusammenfassung

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Zusammenfassung

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Einleitung

Nanostrukturierte Oberflächen haben in jüngster Zeit erhebliche Aufmerksamkeit aufgrund ihrer verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich Strukturierung, Zellkultur, Reinigung und Oberflächenumschaltung. Zum Beispiel superhydrophoben Oberflächen , die durch die Nanostruktur des Lotusblattes inspiriert und andere ansprechende Oberflächen sind in der Lage ^1-4 auf äußere Reize reagieren.

Die Langmuir-Film ist eine der am häufigsten untersuchten Polymerbeschichtungen. Ein Langmuir - Film wird durch Eintropfen amphiphilen Molekülen auf einem Luft-Wasser - Grenzfläche ^5-8 gebildet. Der Film kann dann durch physikalische oder chemische Adsorption und die molekulare Konformation auf einer festen Oberfläche auf einer festen Oberfläche übertragen werden kann unter Verwendung von vertikalen und horizontalen Übertragungsmethoden ^9-12 gesteuert werden. Die Dichte des Langmuir-Film kann präzise durch Komprimieren der Luft-Wasser-Grenzfläche zu regeln. In jüngster Zeit hat dieses Verfahren auch zur Herstellung von nanoskaligen sea-island Structur bewährtes durch amphiphile Blockcopolymere verwendet. Die Nanostrukturen angenommen eines Kerns aus hydrophoben Segmenten bestehen und eine Schale aus hydrophilen Segmente ^13-17. Darüber hinaus wird die Anzahl von Nanostrukturen auf einer Oberfläche durch Steuern der Fläche pro Molekül (A _m) des Blockcopolymers an der Grenzfläche geregelt.

Wir haben auf einem ursprünglichen, einzigartigen, gerüstfreie Gewebe-Engineering-Ansatz, Zellrasen Technik fokussiert, eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche verwenden. Die entwickelte Technologie wurde für verschiedene Organe ¹⁸ auf regenerative Therapien angewandt. Eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche wurde durch Pfropfen von Poly (N Isopropylacrylamid) (PIPAAm), eine temperaturempfindliche Molekül, auf eine Oberfläche ^19-27 hergestellt. PIPAAm und seine Copolymere weisen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in wässrigem Medium bei Temperaturen nahe 32 ° C. Die Kulturfläche zeigte auch eine temperaturempfindliche Alterna auf zwischen Hydrophobie und Hydrophilie. Bei 37 ° C, die PIPAAm gepfropfte Oberfläche wurde hydrophob, und die Zellen leicht angebracht und proliferierten auf der Oberfläche als auch auf konventionelle Gewebskultur-Polystyrol. Wenn die Temperatur auf 20 ° C gesenkt wurde, wurde die Oberfläche hydrophil, und die Zellen von der Oberfläche spontan löst. Daher kultiviert konfluenten Zellen auf der Oberfläche konnte durch Änderung der Temperatur als intaktes Blatt geerntet werden. Diese Zell - Adhäsion und Ablösung Eigenschaften wurden auch von einer Oberfläche hergestellt durch Langmuir Filmbeschichtung für Labordemonstration ^{26 angezeigt, 27.} Ein Langmuir - Film von Blockcopolymeren , bestehend aus Polystyrol (P (St)) und PIPAAm (St-IPAAm) wurde hergestellt. Die Langmuir - Film mit einem spezifischen A _m könnte horizontal zu einer hydrophob modifizierten Glassubstrat übertragen werden. Zusätzlich Zelladhäsion auf und Ablösung von der vorbereiteten Oberfläche in Reaktion auf Temperatur wurden bewertet.

_content "> Hier beschreiben wir Protokolle für die Herstellung eines Films aus thermo-responsive amphiphile Blockcopolymere auf einem Glassubstrat besteht Langmuir nanostrukturiert. Unser Verfahren in verschiedenen Bereichen der Oberflächenwissenschaft eine effektive Herstellungstechnik für organische Nanofilme bereitstellen kann und erleichtern eine wirksame Kontrolle der Zelladhäsion auf und spontane Ablösung von einer Oberfläche.

Protokoll

1. Synthese von Polystyrol- Block -Poly (N Isopropylacrylamid) durch die zwei-Stufen - Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (RAFT) radikalische Polymerisation

1. Auflösen Styrol (153,6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic Säure (ECT; 0,2 mmol) und 4,4'-Azobis (4-cyanovaleriansäure) (ACVA; 0,04 mmol) in 40 ml 1, 4-Dioxan. Frieren Sie die Lösung in flüssigem Stickstoff unter Vakuum für 15-20 min, die reaktiven Spezies zu entfernen und allmählich auftauen bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig aufgetaut ist und wiederholen Sie diese Gefrier-Pump-Auftau-Entgasung Zyklus dreimal.
2. Erhalten, die Polystyrol (PSt) (Mw: 13.500) als Makro RAFT Mittel durch Polymerisation bei 70 ° C für 15 Stunden in einem Ölbad.
3. Precipitate PSt Makro RAFT Mittel mit 800 ml Ether und im Vakuum getrocknet.
4. Auflösen IPAAm Monomer (4,32 mmol), PSt Makro RAFT Mittel (0,022 mmol) und ACVA (0,004 mmol) in 4 ml 1,4-Dioxan.
5. Entfernender Sauerstoff in der Lösung durch die Gefrier-Pump-Auftau-Zyklen Entgasung wie in Schritt 1.1 erwähnt.
6. Durchführen einer Polymerisation bei 70 ° C für 15 Stunden in einem Ölbad nach dem Entgasen. Erhalten Sie synthetisierten St-IPAAm Molekül (Mw: 32,800) auf die gleiche Weise wie bei der PSt Makro RAFT Mittel.

2. Herstellung von Silanized Hydrophobe Modified Glassubstrate

1. Waschglassubstrate (24 mm x 50 mm) mit einem Überschuß an Aceton und Ethanol und mit Ultraschall 5 min Oberflächenverunreinigungen zu entfernen.
2. Trocknen der Substrate in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min. Dann Sauerstoffplasma verwenden (400 W, 3 min), um die Oberflächen der Substrate bei RT zu aktivieren.
3. Tauchen der Substrate in Toluol, das 1% Hexyltrimethoxysilan über Nacht bei RT, das Substrat zu silanisieren.
4. Waschen Sie die silanisierte Substrate in Toluol und tauchen für 30 min in Aceton nicht umgesetztes Mittel zu entfernen.
5. Anneal Substrate für 2 Stunden bei 110 ° C, um gründlich die s immobilisierenDein Gesicht.
6. Schneiden Sie die silanisierte Substrate durch ein Glasschneider bis 25 mm x 24 mm, die Zellkulturschalen (Schale Größe: φ35 mm) passen.

3. Herstellung von Langmuir-Filme und Film-Oberfläche übertragen

1. Legen Sie das Langmuir-Film Instrument in einem Schrank die Ansammlung von Staub zu verhindern.
2. Waschen Sie die Langmuir-Trog (Größe: 580 mm x 145 mm) und Barrieren mit destilliertem Wasser und Ethanol zu entfernen Verunreinigungen.
3. Trocknen Sie die Wanne und Barrieren, die durch mit einem fusselfreien Tuch abwischen. Dann füllen die Wanne mit etwa 110 ml destilliertem Wasser, und stellen Sie die Hindernisse auf beiden Seiten der Mulde. Man beachte, dass destilliertes Wasser sollte ohne Verschütten in den folgenden Schritten von 3,5 bis 3,13 zugegeben werden.
4. Erhitzen Sie eine Platin Wilhelmy-Platte (Umfang: 39,24 mm) zur Überwachung der Oberflächenspannung mit einem Gasbrenner, bis die Platte rot wird und dann mit destilliertem Wasser waschen Verunreinigungen zu entfernen. Hängen Sie die Wilhelmy-Platte auf einem Draht befestigtdie Oberflächendruck-Messinstrument.
5. Null, um die Oberflächendruck-Messgerät nach dem Protokoll des Herstellers. Komprimieren der Luft-Wasser - Grenzfläche auf dem Trog durch die Barrieren an den beiden Seiten der Rinne , bis die Schnittstelle ohne Tropfen Polymer etwa 50 cm ² erreicht.
6. Aspirat kleine Verunreinigungen, bis der Oberflächendruck ist nahezu 0 mN / m.
7. Positionieren Sie die Hindernisse auf beiden Seiten, und destilliertes Wasser für die Abnahme von destilliertem Wasser aus Schritt 3.6 zu kompensieren.
8. Man löst 5 mg des synthetisierten St-IPAAm Molekül in 5 ml einer Entwicklungslösung aus Chloroform.
   Hinweis: Dichlormethan oder Toluol, können auch als Lösungsmittel verwendet werden.
9. fallen sanft 27 & mgr; l von St-IPAAm in Chloroform auf den Trog gelöst, um eine Mikrospritze oder Mikropipette.
10. Nach einer Wartezeit für 5 Minuten eine vollständige Verdampfung von Chloroform zu ermöglichen, beide Barrieren bewegen horizontal, um die St-IPAAm Moleku zu komprimierenle an der Grenzfläche. Aufrechterhaltung Komprimierungsrate der Barrieren bei 0,5 mm / sec , bis der Zielfläche von 50 cm ² erreicht ist.
    Hinweis: Eine schnelle Kompressionsrate Defekte in der Langmuir-Film verursacht.
11. Messen der Oberflächendruck (π) -A _m Isothermen mit dem Platin Wilhelmy - Platte an der Oberfläche Druck-Messinstrument während der Kompression nach dem Protokoll des Herstellers.
12. Nachdem das Zielgebiet Größe erreichen, halten die Oberfläche für 5 min die St-IPAAm Moleküle zu ermöglichen, sich zu entspannen; die Moleküle Gleichgewicht nicht unmittelbar nach der Kompression erreichen.
13. Übertragen Sie die Langmuir-Film auf eine hydrophob modifizierte Glassubstrat mit einer Transfervorrichtung für 5 Minuten unter Verwendung zu robust den Film adsorbieren. Befestigen Sie das hydrophobe Glassubstrat parallel auf dem Gerät. Schließen Sie das Gerät an eine Ausrichtungsstufe und senkrecht bewegen.
14. Heben Sie das Substrat horizontal mit der Transfervorrichtung und trocken für 1 Tag in einem desiccator.

4. Kultivierung von Zellen und Optimierung von Zelladhäsion und Detachment auf dem Langmuir Film übertragen Oberflächen

1. Zur Herstellung von Zellsuspensionen, die Kultur bovine Arteria carotis Endothelzellen (BAECs) zu einem Drittel Konfluenz bei 37 ° C in 5% CO ₂ und 95% Luft auf Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) mit Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin.
2. Nach Erreichen der Konfluenz, behandeln BAECs mit 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA 3 min bei 37 ° C in 5% CO ₂ und 95% Luft.
3. Deaktivieren des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 10 ml DMEM-10% FBS enthält, und sammeln zu einer 50 ml konischen Röhrchen die Zellsuspension.
4. Zentrifuge bei 120 xg für 5 min, und den Überstand aspirieren. Re-suspend die Zellen mit 10 ml DMEM.
5. Legen Sie die St-IPAAm Oberflächen unter UV-Licht auf eine saubere Bank für 5 min zu sterilisieren.
6. Samen des wiedergewonnenen cells auf der St-IPAAm Flächen in einer Konzentration von 1,0 x 10 ⁴ Zellen / cm ² durch eine Einweg - Hämozytometer gezählt und die Zellen auf den Oberflächen mit einem Mikroskop mit einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ und 95% ausgestattet beobachten Luft.
   Hinweis: Sterilisieren Sie die St-IPAAm Oberflächen durch UV-Licht auf eine saubere Bank ausgestattet.
7. Nehmen Sie Zeitrafferbilder von adhärenten BAECs für etwa 24,5 Stunden bei 37 ° C mit einem Phasenkontrast-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Nach BAEC- Haftung, Rekord Ablösung der BAECs von der St-IPAAm Oberfläche bei 20 ° C für etwa 3,5 Stunden.

5. Zellrasen Herstellung auf den Langmuir Film-Oberflächen übertragen

1. Kultur BAECs in der gleichen Weise verwendet, in Abschnitt 4 beschrieben.
2. Seed insgesamt 1,0 x 10 ⁵ Zellen / cm ² auf St-IPAAm Oberflächen und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C in 5% CO _2. Confluent BAECs spontan bei 20 ° C abgelöst.

Ergebnisse

Blockcopolymere , bestehend aus Polystyrol und Poly (N Isopropylacrylamid) (St-IPAAms) mit spezifischen Molekulargewichten wurden durch RAFT Radikalpolymerisation synthetisiert. ECT wurde als Kettenübertragungsmittel hergestellt , wie es in Moad et al. ^28. Zwei St-IPAAm Molekülen verschiedener PIPAAm Kettenlängen synthetisiert wurden, und die erhaltenen Blockpolymere wurden durch ¹ H - kernmagnetische Resonanz (NMR) und Gelpermeationschromatogra...

Diskussion

Eine temperaturempfindliche Oberfläche wurde durch das Langmuir-Schäfer-Methode hergestellt, und die Oberflächeneigenschaften für die Zelladhäsion / Ablösung und Zellrasen Rückgewinnung optimiert. Wenn für die Herstellung von Oberflächen unter Verwendung dieses Verfahrens sind mehrere Schritte kritisch. Die molekulare Zusammensetzung der St-IPAAm Moleküle hat eine große Wirkung auf die Oberflächenstruktur und die Stabilität der Oberfläche und durch die Erweiterung, auf die Zelladhäsion und Ablösung. Insb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon