JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Аннотация

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Введение

Наноструктурированные поверхности в последнее время привлекли значительное внимание из-за их различных потенциальных применений, в том числе структурирование, культуры клеток, очистки и переключения поверхности. Например, сверхгидрофобные поверхности вдохновленные наноструктуры листа лотоса и других чувствительных поверхностей способны реагировать на внешние раздражители 1-4.

Пленка Ленгмюра является одним из наиболее широко изученных полимерных покрытий. Пленка Ленгмюра формируется путем сбрасывания амфифильных молекул на интерфейс воздух-вода 5-8. Затем пленка может быть передана на твердую поверхность с помощью физической или химической адсорбции, и конформации молекулы на твердой поверхности , можно контролировать с помощью вертикальных и горизонтальных методы переноса 9-12. Плотность пленки Ленгмюра можно точно регулировать путем сжатия раздела воздух-вода. В последнее время этот метод также доказал свою эффективность для изготовления наноразмерных море остров СтруктурЕ. С. за счет использования амфифильных полиэфирных блок-сополимеров. Наноструктуры предполагаются состоят из ядра гидрофобных сегментов и оболочкой из гидрофильных сегментов 13-17. Кроме того, количество наноструктуры на поверхности регулируется путем регулирования площади на молекулу (м) блок - сополимера на границе раздела фаз.

Мы сосредоточились на оригинальной, уникальной каркасного свободной ткани инженерный подход, сотовый листовой инженерии, с помощью температуры реагирующих поверхности культуры. Разработанная технология была применена для регенеративной терапии для различных органов 18. Температура поверхности реагирующих культура была изготовлена ​​прививкой поли (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), молекула температуры реагирующих, на поверхность 19-27. PIPAAm и его сополимеры демонстрируют более низкую критическую температуру раствора (НКТР) в водной среде при температуре около 32 ° C. Поверхность культуры также выставлены температуры реагирующих alternati на между гидрофобности и гидрофильности. При 37 ° С, PIPAAm привитым поверхность становилась гидрофобной, и клетки легко присоединены и пролиферируют на поверхности, а также на обычной тканевой культуры, полистирола. При понижении температуры до 20 ° С, поверхность стали гидрофильными, и клетки спонтанно отделяться от поверхности. Таким образом, культивированные сливные клетки на поверхности может быть собран в виде интактного листа путем изменения температуры. Эти клеточной адгезии и отслойка свойства также отображаются на поверхности сфабриковано пленочным покрытием Ленгмюра для лабораторной демонстрации 26, 27. Ленгмюра пленка блок - сополимеров , состоящих из полистирола (P (St)) и PIPAAm (St-IPAAm) был изготовлен. Пленка Ленгмюра с конкретнее м может быть горизонтально переданы гидрофобно модифицированной стеклянной подложке. Кроме того, оценивали клеточную адгезию на отрыв и от подготовленной поверхности в ответ на температуру.

_content "> Здесь мы описываем протоколы для изготовления наноструктурированного Ленгмюра пленки, состоящей из термореактивных отзывчивым амфифильные блок-сополимеры на стеклянной подложке. Наш метод может обеспечить эффективный метод изготовления для органических нанопленками в различных областях науки о поверхности и может способствовать более эффективный контроль клеточной адгезии на спонтанный и отрыв от поверхности.

протокол

1. Синтез Polystyrene- блока -poly (N -isopropylacrylamide) двухступенчатым Реверсивный Сложение фрагментации цепи передачи (RAFT) радикальной полимеризации

  1. Растворите стирол (153,6 ммоль), 4-циано-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic кислоты (ЕСТ; 0,2 ммоль), и 4,4'-азобис (4-cyanovaleric кислота) (ACVA; 0,04 ммоль) в 40 мл 1, 4-диоксана. Замораживание раствора в жидком азоте в вакууме в течение 15-20 мин, чтобы удалить реакционноспособные частицы и постепенно оттаивают при комнатной температуре. Убедитесь, что раствор полностью оттаяли и повторите эту сублимационной насос-оттаивания дегазацией три раза.
  2. Получение полистирола (ПСТ) (молекулярная масса: 13500) в качестве макро RAFT агента путем полимеризации при 70 ° С в течение 15 часов на масляной бане.
  3. Выпавший PSt макро ПЛОТА агент 800 мл эфира и сушат в вакууме.
  4. Растворите IPAAm мономер (4,32 ммоль), ПСТ макросъемки RAFT агент (0,022 ммоль) и ACVA (0,004 ммоль) в 4 мл 1,4-диоксана.
  5. Удалитькислород в растворе циклами дегазации сублимационной насос-оттаивание, как указано в пункте 1.1.
  6. Провести полимеризацию при 70 ° С в течение 15 часов на масляной бане после дегазации. Получить синтезированную молекулу Санкт-IPAAm (Mw: 32800) в том же порядке, что и макро RAFT агента ПСТ.

2. Приготовление силанизированы Гидрофобный модифицированными стеклянных подложках

  1. Wash стеклянные подложки (24 мм х 50 мм) с избытком ацетона и этанола и разрушать ультразвуком в течение 5 мин для удаления поверхностных загрязнений.
  2. Сухие субстраты в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 30 мин. Затем с помощью кислородной плазмы (400 Вт, 3 мин) для активации поверхности подложек при комнатной температуре.
  3. Погружают субстратов в толуоле, содержащем 1% гексилтриметоксисилан в течение ночи при комнатной температуре, чтобы silanize субстрат.
  4. Промыть силанизированы субстратов в толуоле и погружают в ацетоне в течение 30 мин для удаления непрореагировавших веществ.
  5. Отжигать субстраты в течение 2 ч при 110 ° С, чтобы полностью иммобилизации Sтвое лицо.
  6. Нарезать силанизированы подложек с помощью резака стекла до 25 мм х 24 мм, чтобы соответствовать посуду культуры клеток (размер блюдо: φ35 мм).

3. Получение пленок Ленгмюра и кинопрессы перенесенную поверхности

  1. Поместите прибор пленки Ленгмюра в шкафу, чтобы предотвратить накопление пыли.
  2. Промойте желоб Ленгмюра (размер: 580 мм х 145 мм) и барьеры с дистиллированной водой и этанолом для удаления загрязняющих веществ.
  3. Сушат корыто и барьеры, протерев lintless полотенцем. Затем заполнить корыто с приблизительно 110 мл дистиллированной воды, а также установить барьеры на обеих сторонах желоба. Обратите внимание, что дистиллированная вода должна быть добавлена ​​без просачивания в следующих шагах от 3.5 до 3.13.
  4. Тепло платины Вильгельми пластины (по периметру: 39,24 мм) для контроля поверхностного натяжения с газовой горелкой, пока пластина не становится красным, а затем промывают дистиллированной водой для удаления загрязнений. Приостановка пластину Вильгельми на проводе, прикрепленной кповерхность-измерения давления прибор.
  5. Обнулить поверхностного давления-измерительный прибор в соответствии с протоколом производителя. Сжать раздела воздух-вода на желобе с помощью барьеров на обеих сторонах желоба , пока интерфейс не достигнет приблизительно 50 см 2 без каких - либо капель полимера.
  6. Аспирируйте мелкие примеси, пока давление поверхности почти 0 мН / м.
  7. Переставьте барьеры с обеих сторон, и добавить дистиллированную воду, чтобы компенсировать уменьшение дистиллированной воды со стадии 3.6.
  8. Растворяют 5 мг синтезированной молекулы Санкт-IPAAm в 5 мл раствора развития хлороформа.
    Примечание: дихлорметан или толуол, также могут быть использованы в качестве растворителя.
  9. Аккуратно уронить 27 мкл St-IPAAm растворенные в хлороформе на желобе с помощью микрошприца или микропипетки.
  10. После ожидания в течение 5 мин, чтобы обеспечить полное испарение хлороформа, переместить обе барьеры в горизонтальном направлении, чтобы сжать molecu Сент-IPAAmле на границе раздела. Поддерживать степень сжатия барьеров на 0,5 мм / сек , пока целевой области 50 см 2 достигается.
    Примечание: Быстрая скорость сжатия вызывает дефекты в пленке Ленгмюра.
  11. Измерьте давление на поверхности (π) -A м изотермы с платиновой Вильгельми пластиной , прикрепленной к поверхности измерения давления инструмента во время сжатия в соответствии с протоколом производителя.
  12. После достижения размера целевой области, поддержания поверхности в течение 5 мин, чтобы позволить молекулы Сент-IPAAm отдохнуть; молекулы не достигают равновесия сразу после сжатия.
  13. Перенести пленка Ленгмюра к гидрофобно модифицированного стеклянной подложке с использованием передачи аппарата в течение 5 мин, чтобы робастно адсорбировать пленку. Закрепить гидрофобную стеклянную подложку параллельно на устройстве. Подключите устройство к стадии выравнивания и двигаться перпендикулярно.
  14. Поднимите подложку горизонтально с устройством передачи и высохнуть в течение 1 дня в desiccatoр.

4. Культивирование клеток и оптимизации клеточной адгезии и отрешенности на Ленгмюра передаваемую поверхности пленки

  1. Для приготовления суспензии клеток, культуры бычьей сонной артерии эндотелиальных клеток (BAECs) до одной трети впадения при 37 ° С в 5% СО 2 и 95% воздуха на тканевой культуры , полистирола (ТКТ) с Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , содержащей 10% фетальной бычий сывороточный (ФБС) и 100 ед / мл пенициллина.
  2. После слияния достигается, лечить BAECs с 3 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 3 мин при температуре 37 ° С в 5% СО 2 и 95% воздуха.
  3. Деактивировать трипсин-ЭДТА, добавив 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS, и собирают суспензию клеток в 50 мл коническую пробирку.
  4. Центрифуга при 120 х г в течение 5 мин, и аспирата супернатант. Повторное приостановить клетки с 10 мл DMEM.
  5. Поместите поверхности St-IPAAm под ультрафиолетовым светом на чистом столе для стерилизовать в течение 5 мин.
  6. Семенной восстановленную CELLS на St-IPAAm поверхности при концентрации от 1,0 × 10 4 клеток / см 2 , подсчитанных с помощью одноразового использования гемоцитометра и наблюдать клетки на поверхности с помощью микроскопа , снабженного термостате при температуре 37 ° С с 5% CO 2 и 95% воздух.
    Примечание: Стерилизовать поверхности St-IPAAm ультрафиолетовым светом оборудованный для чистой скамейке.
  7. Время записи покадровой образы прилипших BAECs в течение приблизительно 24,5 часов при 37 ° С с помощью фазового контрастного микроскопа с 10-кратным увеличением. После того, как BAEC адгезии, запись отряда BAECs с поверхности Санкт-IPAAm при 20 ° С в течение приблизительно 3,5 ч.

5. Сотовый лист Изготовление на Ленгмюра пленочным переданных поверхностей

  1. Культура BAECs, используемые в той же способом, описанным в разделе 4.
  2. Семенной в общей сложности 1,0 × 10 5 клеток / см 2 на Сент-IPAAm поверхностей и инкубировать в течение 3 -х дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2. Сливной BAECs спонтанно отдельностоящий при 20 ° C.

Результаты

Блок - сополимеры , состоящие из полистирола и поли (N -isopropylacrylamide) (Сент-IPAAms) с конкретными молекулярными массами были синтезированы на плоту радикальной полимеризации. ЕСТ была подготовлена ​​в качестве агента переноса цепи , как описано в Moad и др. 28. Бы?...

Обсуждение

Температура реагирующих поверхность была изготовлена ​​методом Ленгмюра-Шеффера, и свойства поверхности для адгезии клеток / отсоединени и клеток листа восстановления были оптимизированы. При использовании этого метода для изготовления поверхностей, несколько шагов, которые имеют...

Раскрытие информации

All authors contributed equally to writing the manuscript and have approved the final version. The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This study was financially supported by the Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program's Project for Developing Innovation Systems "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
N-isopropylacrylamideKohjinNo catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)Wako Pure Chemicals016-19332
StyreneSigma-AldrichS4972
1,3,5-trioxaneSigma-AldrichT81108
1,4-DioxaneWako Pure Chemicals045-24491
DMEMSigma D6429
PBSNakarai11482-15
StreptomycinGIBCO BRL15140-163
PenicillinGIBCO BRL15140-122
Trypsin-EDTASigmaT4174
FBSJapan BioserumJBS-11501
BAECsHealth Science Reserch Resources BankJCRB0099
Cover GlassesMatsunami Glass IndustryC024501
AFM NanoScope VVeeco
1H NMR INOVA 400Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPCTosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs KSV InstrumentsKN 2002KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-UNikon

Ссылки

  1. Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
  2. Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
  3. Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
  4. Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
  5. Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
  6. Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
  7. Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
  8. Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
  9. Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
  10. Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
  11. Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
  12. Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
  13. Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
  14. Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
  15. Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
  16. Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
  17. Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
  18. Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering. Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).
  19. Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
  20. Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
  21. Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
  22. Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
  23. Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
  24. Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
  25. Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
  26. Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
  27. Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
  28. Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
  29. Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  30. Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
  31. Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

109thermoresponsive

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены