Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

Resumo

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Resumo

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Introdução

superfícies nanoestruturados têm atraído recentemente a atenção substancial devido às suas várias aplicações potenciais, incluindo padronização, cultura de células, limpeza, e comutação de superfície. Por exemplo, as superfícies hidrofóbicas inspirados na nanoestrutura da folha de lótus e outras superfícies sensíveis são capazes de reagir a estímulos externos ^1-4.

O filme de Langmuir é um dos revestimentos de polímero mais amplamente estudados. Um filme de Langmuir é formada por moléculas anfifílicas deixando cair sobre uma interface ar-água ^08/05. A película pode então ser transferida para uma superfície sólida por adsorção física ou química, e a conformação molecular sobre uma superfície sólida pode ser controlada usando métodos de transferência verticais e horizontais ^9-12. A densidade do filme de Langmuir podem ser regulados com precisão por compressão da interface ar-água. Recentemente, este método também tem se mostrado eficaz para a fabricação nanométricos structur-ilha do marES, utilizando copolímeros de bloco anfifílicos. As nanoestruturas são considerados para consistir de um núcleo de segmentos hidrófobos e uma concha de segmentos hidrofílicos ^13-17. Além disso, o número de nanoestruturas sobre uma superfície é regulada, controlando a área por molécula de (A _m) do copolímero de bloco na interface.

Nós nos concentramos em um original, abordagem de engenharia de tecido sem andaime única, engenharia camada de células, usando uma superfície de cultura termicamente reativo. A tecnologia desenvolvida foi aplicada a terapias de regeneração para vários órgãos ^18. Uma superfície de cultura de temperatura-sensível foi fabricado por enxerto de poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), uma molécula de temperatura-sensível, para uma superfície de ^19-27. PIPAAm e seus copolímeros exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), em meio aquoso, a temperaturas próximas de 32 ° C. A superfície da cultura também exibiu uma temperatura alternati-responsivo em entre hidrofobicidade e hidrofilicidade. A 37 ° C, a superfície tornou-se PIPAAm-enxertado hidrofóbico, e as células proliferaram rapidamente ligados e sobre a superfície, bem como sobre poliestireno de cultura de tecidos convencional. Quando a temperatura foi baixada para 20 ° C, a superfície tornou-se hidrófila, e células espontaneamente isolada a partir da superfície. Portanto, células confluentes cultivadas na superfície poderia ser colhida como uma folha intacta, alterando a temperatura. Estas propriedades de adesão celular e descolamento também foram exibidos por uma superfície fabricada por revestimento de película Langmuir para o laboratório de demonstração ^{26, 27.} Um filme de Langmuir de copolímeros em bloco composto por poliestireno (P (St)) e PIPAAm (St-IPAAM) foi fabricada. O filme de Langmuir com uma específica Um _m poderia ser horizontalmente transferidos para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado. Além disso, foram avaliadas a adesão celular ligado e desprendimento da superfície preparada em resposta à temperatura.

_content "> Aqui, nós descrevemos protocolos para a fabricação de uma película de Langmuir nanoestruturada composto de copolímeros em bloco anfifílicos termo-sensível sobre um substrato de vidro. O método pode fornecer uma técnica de fabricação eficaz para nanofilmes orgânicos em vários campos da ciência superfície e podem facilitar mais controlo eficaz da adesão celular e descolamento em espontânea a partir de uma superfície.

Protocolo

1. Síntese de poli bloco Polystyrene- (N -isopropylacrylamide) por duas etapas reversível adição-fragmentação cadeia de transferência (RAFT) polimerização por radicais

1. Dissolve-se estireno (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) ácido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmol), e 4,4'-azobis (ácido 4-cianovalérico) (ACVA; 0,04 mmol) em 40 ml de 1, 4-dioxano. Congelar a solução em azoto líquido sob vácuo durante 15-20 min para remover as espécies reactivas e gradualmente descongelar à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução é completamente descongelado e repetir este freeze-bomba de degelo ciclo de desgaseificação três vezes.
2. Obter o poliestireno (PSt) (PM: 13.500) como um agente RAFT macro de polimerização a 70 ° C durante 15 h num banho de óleo.
3. Precipitado PSt agente macro balsa com 800 ml de éter e seco em vácuo.
4. Dissolver IPAAM monómero (4,32 mmol), PSt agente RAFT macro (0,022 mmol), e ACVA (0,004 mmol) em 4 ml de 1,4-dioxano.
5. Removero oxigénio na solução pelos ciclos de desgaseificação congelamento-descongelamento-bomba tal como mencionado no passo 1.1.
6. Executar uma polimerização a 70 ° C durante 15 h num banho de óleo depois de desgaseificação. Obter molécula sintetizada St-IPAAM (PM: 32.800), da mesma maneira como o agente de macro RAFT PST.

2. Preparação de substratos de vidro silanada hidrofóbica Modificados

1. Lavar substratos de vidro (24 mm x 50 mm) com um excesso de acetona e etanol e sonicado durante 5 min para remover os contaminantes da superfície.
2. Secam-se os substratos num forno a 65 ° C durante 30 min. Em seguida, usar plasma de oxigénio (400 W, 3 minutos) para activar as superfícies dos substratos à TA.
3. Mergulhar os substratos em tolueno contendo 1% hexyltrimethoxysilane durante a noite a RT para silanizar o substrato.
4. Lavar os substratos silanizadas em tolueno e mergulhe em acetona durante 30 min para remover os agentes que não reagiram.
5. substratos recozimento durante 2 horas a 110 ° C para imobilizar completamente o Sseu rosto.
6. Corte os substratos silanizadas por um cortador de vidro de 25 mm x 24 mm para caber os pratos de cultura de células (tamanho prato: φ35 mm).

3. Preparação de Langmuir Films ea superfície transferida-Film

1. Colocar o aparelho de Langmuir película num gabinete para evitar a acumulação de poeiras.
2. Lava-se a calha de Langmuir (tamanho: 580 milímetros x 145 mm) e as barreiras com água destilada e etanol, para remover contaminantes.
3. Seque o cocho e barreiras, limpando com uma toalha sem fiapos. Em seguida, preencher a calha com aproximadamente 110 ml de água destilada, e ajustar as barreiras de ambos os lados da calha. Note-se que a água destilada devem ser adicionados sem que se prolonga nos seguintes passos 3,5-3,13.
4. Aquece-se uma placa de Wilhelmy platina (perímetro: 39,24 milímetros) para a monitorização da tensão de superfície com um queimador de gás até que a placa torna-se vermelha e, em seguida, lava-se com água destilada para remover os contaminantes. Suspender a placa de Wilhelmy em um fio ligado ao instrumento da superfície à pressão medida.
5. Zerar o instrumento-surface-medição de pressão de acordo com o protocolo do fabricante. Comprimir a interface ar-água na calha por as barreiras em ambos os lados da calha até que a interface atinge cerca de 50 cm ^2, sem quaisquer gotas de polímero.
6. Aspirar pequenos contaminantes até que a pressão de superfície é cerca de 0 mN / m.
7. Reposicionar as barreiras de ambos os lados, e adicionar água destilada para compensar a diminuição de água destilada a partir do passo 3.6.
8. Dissolve-se 5 mg de a molécula de St-IPAAM sintetizado em 5 ml de uma solução de desenvolvimento de clorofórmio.
   Nota: diclorometano ou tolueno, também podem ser usados ​​como o solvente.
9. Gentilmente queda de 27 ul de St-IPAAM dissolvidos em clorofórmio para a calha utilizando uma micro ou micropipeta.
10. Após uma espera de 5 minutos para permitir a evaporação completa de clorofórmio, mover as duas barreiras horizontalmente para comprimir o molecu St-IPAAMle na interface. Manter a taxa de compressão das barreiras a 0,5 mm / seg, até a área de alvo de 50 cm ² é alcançado.
    Nota: A taxa de compressão rápida provoca defeitos no filme de Langmuir.
11. Medir a pressão de superfície (π) -A _m isotérmicas com a platina placa de Wilhelmy anexada ao instrumento-surface-medição de pressão durante a compressão de acordo com o protocolo do fabricante.
12. Depois de atingir o tamanho da área de alvo, manter a superfície durante 5 min para permitir que as moléculas de St-IPAAM para relaxar; as moléculas não atingem o equilíbrio imediatamente após a compressão.
13. Transferir o filme de Langmuir para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado usando um aparelho de transferência durante 5 minutos para adsorver robustamente o filme. Fixar o substrato de vidro hidrofóbicas em paralelo no dispositivo. Conecte o dispositivo a uma fase de alinhamento e mover-se perpendicularmente.
14. Levantar o substrato horizontalmente com o aparelho de transferência e seco durante 1 dia num desiccator.

4. a cultura de células e Otimização de adesão celular e destacamento na superfície Transferido Langmuir Film

1. Para preparar as suspensões de células, células endoteliais de cultura bovina da artéria carótida (BAECs) a um terço confluência a 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% de ar em polistireno para cultura de tecidos (TCPS), com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo 10% de fetal de soro de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina.
2. Após confluência é atingido, tratar BAECs com 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% de ar.
3. Desactivar a tripsina-EDTA, adicionando 10 ml de DMEM contendo FBS a 10%, e recolher a suspensão de células para um tubo de 50 ml.
4. Centrifugar a 120 xg durante 5 min, e o sobrenadante aspirado. Re-suspender as células com 10 ml de DMEM.
5. Coloque as superfícies St-IPAAM sob luz ultravioleta sobre uma bancada limpa para esterilizar por 5 min.
6. Semear o ce recuperadolls sobre o St-IPAAM superfícies a uma concentração de 1,0 x 10 ⁴ células / ^cm2 contados por um hemocitómetro descartável e observar as células sobre as superfícies de um microscópio equipado com uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ e 95% ar.
   Nota: Esterilizar as superfícies St-IPAAM por luz ultravioleta equipado para uma bancada limpa.
7. Gravação de imagens de lapso de tempo de BAECs aderentes para cerca de 24,5 horas a 37 ° C por um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x. Após BAEC adesão, ficha descolamento das BAECs da superfície de St-IPAAM a 20 ° C durante cerca de 3,5 h.

Fabricação de chapas 5. celular nas superfícies Langmuir Film-transferidos

1. BAECs cultura utilizados da mesma maneira descrita na Secção 4.
2. Semente um total de 1,0 x 10 ⁵ células / ^cm2 em superfícies St-IPAAM e incubar durante 3 dias a 37 ° C em 5% de CO _2. Confluente BAECs espontaneamente isolada a 20 ° C.

Resultados

Os copolímeros em bloco compostos por poliestireno e poli (-isopropylacrylamide N) (St-IPAAms) com pesos moleculares específicos foram sintetizados por polimerização de radicais TRAF. ECT foi preparado como um agente de transferência de cadeia como descrito no Moad et ai. ^28. Duas moléculas de St-IPAAM de diferentes comprimentos de cadeia PIPAAm foram sintetizados, e os polímeros em bloco obtidos foram caracterizados por ^1H ressonância magn...

Discussão

Uma superfície termicamente reativo foi fabricado pelo método de Langmuir-Schaefer, e as propriedades de superfície para adesão celular / descolamento e a folha de célula de recuperação foram optimizados. Ao utilizar este método para a fabricação de superfícies, vários passos são críticos. A composição molecular das moléculas de St-IPAAM tem um grande efeito sobre a estrutura da superfície e a estabilidade da superfície, e, por extensão, a adesão celular e descolamento. Em particular, as moléculas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon