הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

Summary

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Abstract

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Introduction

משטחי Nanostructured משכו תשומת לב רבה לאחרונה בשל היישומים הפוטנציאליים השונים שלהם, כוללים דפוסים, תרבית תאים, ניקוי, ומיתוג שטח. לדוגמא, משטחים הידרופובי בהשראת ננו-המבנה של עלה הלוטוס ומשטחי תגובה אחרים מסוגלים להגיב לגירויים חיצוניים ^1-4.

הסרט לאנגמיור הוא אחד פולימר ציפויים למד נרחב ביותר. סרט לאנגמיור נוצר על ידי הטלת מולקולות amphiphilic על ממשק אוויר-מים ^5-8. הסרט אז יכול להיות מועבר על גבי משטח מוצק על ידי ספיחה פיזית או כימי, ואת קונפורמציה המולקולרית על משטח מוצק ניתן לשלוט בשיטות העברה אנכיות ואופקיות ^9-12. הצפיפות של הסרט לאנגמיור ניתן לווסת בדיוק על ידי דחיסת ממשק מים-אוויר. לאחרונה, שיטה זו גם הוכחה כיעילה עבור בודת structur ים-האי nanoscaledes ידי ניצול קופולימרים לחסום amphiphilic. ננו הם הניחו מורכב מליבה של מגזרים הידרופובי פגז של מגזרים הידרופילי ^13-17. בנוסף, מספר ננו על משטח מוסדר על ידי שליטה על השטח לכל מולקולה (א _{מ ')} של קופולימר הבלוק על הממשק.

התמקדנו מקורית, גישת הנדסת רקמות פיגום ללא ייחודית, הנדסת תא גיליון, באמצעות משטח תרבות טמפרטורה-תגובה. הטכנולוגיה שפותחה יושמה לטיפולים ומבריאים איברים שונים ^18. משטח תרבות טמפרטורה המגיבה היה מפוברק על ידי השתלת פולי (-isopropylacrylamide N) (PIPAAm), מולקולת תגובה בטמפרטורה, על גבי משטח ^19-27. PIPAAm ולהציג קופולימרים שלה טמפרטורת פתרון קריטית נמוך (LCST) בתקשורת מימית בטמפרטורות ליד 32 מעלות צלזיוס. משטח התרבות גם הציג משתנ טמפרטורה המגיבים על בין הידרופוביות hydrophilicity. בגיל 37 ° C, פני השטח המורכבים PIPAAm הפכו הידרופובי, ותאים המצורפת בקלות התרבו על פני השטח כמו גם על קלקר בתרבית רקמה קונבנציונלי. כאשר הטמפרטורה ירדה ל -20 מעלות צלזיוס, פני השטח הפכו הידרופילי, ותאי מנותקים ספונטניים מפני השטח. לכן, תאים ומחוברות תרבותיים על פני השטח יכולים להיות בצור כמו גיליון שלם על ידי שינוי הטמפרטורה. תכונות הידבקות ניתוק התא אלה הוצגו גם על ידי משטח מפוברק על ידי ציפוי הסרט לאנגמיור להפגנה מעבדה ^{26, 27.} סרט לאנגמיור של קופולימרים לחסום מורכב פוליסטירן (P (St)) ו PIPAAm (St-IPAAm) היה מפוברק. הסרט לאנגמיור עם _{מ 'מסוים} ניתן להעביר אופקית כדי מצע זכוכית שונה hydrophobically. בנוסף, הידבקות תא על וניתוק מפני השטח המוכן בתגובת הטמפרטורה הוערכו.

_content "> כאן אנו מתארים פרוטוקולים עבור הייצור של סרט לאנגמיור nanostructured מורכב קופולימרים לחסום amphiphilic התרמו-תגובה על מצע זכוכית. השיטה שלנו עשויה לספק טכניקת ייצור יעילה nanofilms האורגני בתחומים שונים של מדע משטח עשוי להקל יותר שליטה אפקטיבית של הידבקות תא על וניתוק ספונטני ממשטח.

Protocol

1. סינתזה של -poly לחסום Polystyrene- (-isopropylacrylamide N) על ידי העברת שרשרת שני שלבים הפיך תוספת הפיצול (רפסודה) הרדיקלי פילמור

1. ממיסים סטירן (153.6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) חומצה sulfanylpentanoic (ECT; 0.2 מילימול), ו 4,4'-Azobis (חומצה 4-cyanovaleric) (ACVA; 0.04 מילימול) ב 40 מ"ל של 1, 4-dioxane. להקפיא את הפתרון בחנקן נוזלי תחת ואקום במשך 15-20 דקות להסיר את המינים תגובתי להפשיר בהדרגה ב RT. ודא כי הפתרון הוא מופשר לחלוטין וחזרו זה מחזור degassing להקפיא משאבת הפשרה שלוש פעמים.
2. השג את פוליסטירן (PST) (Mw: 13,500) כסוכן רפסודה מאקרו ידי פילמור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות באמבט שמן.
3. סוכן רפסודה מאקרו המשקע PST עם 800 מ"ל של אתר ויבש vacuo.
4. ממיסים מונומר IPAAm (4.32 מילימול), סוכן רפסודה מאקרו PST (0.022 mmol), ו ACVA (0.004 mmol) ב 4 מ"ל של 1,4-dioxane.
5. לְהַסִירחמצן הפתרון על ידי מחזורי degassing להקפיא משאבת הפשרה כאמור בשלב 1.1.
6. בצע פילמור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות באמבט שמן לאחר סילוק גזים. השג מולקולת St-IPAAm מסונתז (Mw: 32,800) באותו אופן כסוכן רפסודת מאקרו PST.

2. הכנת מצעי זכוכית השתנו silanized הידרופובי

1. מצעי זכוכית Wash (24 מ"מ x 50 מ"מ) עם עודף של אצטון ואתנול sonicate במשך 5 דקות כדי להסיר מזהמים על פני השטח.
2. ייבש את המצעים בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן השתמש פלזמה חמצן (400 W, 3 דקות) כדי להפעיל את פני השטח של מצעים ב RT.
3. לטבול את מצעי טולואן המכיל 1% hexyltrimethoxysilane הלילה ב RT כדי silanize המצע.
4. שטוף את מצעי silanized טולואן וטבלת אצטון במשך 30 דקות כדי להסיר סוכני unreacted.
5. מצעים לחשל עבור שעה 2 ב 110 ° C כדי לשתק את הים ביסודיותurface.
6. חותך את מצעי silanized ידי חתכי זכוכית 25 מ"מ x 24 מ"מ כדי להתאים את כלי תרבית תאים (גודל מנה: מ"מ φ35).

3. הכנה לאנגמיור סרטי Surface-הועבר סרטים

1. מניחים את המכשיר הסרט לאנגמיור בארון כדי למנוע הצטברות של אבק.
2. שטוף את השוקת לאנגמיור (גודל: 580 מ"מ x 145 מ"מ) ומחסומים עם מים ואתנול מזוקקים להסרת לכלוך.
3. ייבש את השוקת ומחסומים ידי ניגוב במגבת lintless. ואז למלא את השוקת עם כ 110 מ"ל מים מזוקקים, ולהגדיר את המחסומים משני צידי השוקת. שים לב מים מזוקקים יש להוסיף מבלי לשפוך בשלבים הבאים 3.5 כדי 3.13.
4. מחממי צלחת פלטינה Wilhelmy (היקף: 39.24 מ"מ) לניטור מתח הפנים עם מבער גז עד שההצלחה פונה אדומה ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים כדי להסיר מזהמים. להשעות את הצלחת Wilhelmy על חוט המחוברמכשיר משטח-מדידה בלחץ.
5. אפס מכשיר משטח-מדידה בלחץ על פי הפרוטוקול של היצרן. דחיסת ממשק מים-אוויר על השוקת על ידי מחסומים על שני הצדדים של שוקת עד בממשק ומגיע לכ 50 ס"מ ² ללא כל טיפות של פולימר.
6. מזהמים קטנים לשאוב עד שלחץ השטח הוא כמעט 0 MN / m.
7. מיקום מחדש את המחסומים משני הצדדים, ולהוסיף מים מזוקקים כדי לפצות על הירידה של מים מזוקקים משלב 3.6.
8. ממיסים 5 מ"ג של המולקולה St-IPAAm מסונתז 5 מ"ל של פתרון פיתוח של כלורופורם.
   הערה: dichloromethane או טולואן יכול לשמש גם הממס.
9. בעדינות טיפה 27 μl של סנט-IPAAm מומס כלורופורם על שוקת באמצעות microsyringe או micropipette.
10. אחרי המתנה של 5 דקות, כדי לאפשר אידוי מוחלט של כלורופורם, להזיז את שני המחסומים אופקיים כדי לדחוס את molecu St-IPAAmle על הממשק. לשמור דחיסה קצב המחסומים ברמה של 0.5 מ"מ / sec ועד לאיזור היעד של 50 ס"מ ² הוא הגיע.
    הערה: שיעור דחיסה מהיר גורם למומים בסרט לאנגמיור.
11. מדדו את הלחץ לפני השטח (π) -A איזותרמות _מ עם צלחת פלטינה Wilhelmy המצורפת למכשיר משטח-מדידה בלחץ במהלך הדחיסה על פי פרוטוקול של היצרן.
12. לאחר שהגיע לגודל אזור היעד, לשמור על פני השטח במשך 5 דקות, כדי לאפשר מולקולות St-IPAAm להירגע; מולקולות לא להגיע לשיווי משקל מיד לאחר דחיסה.
13. מעביר את הסרט לאנגמיור על מצע זכוכית שונה hydrophobically באמצעות מנגנון העברה למשך 5 דקות כדי לספוג את הסרט וחסון. תקן את מצע זכוכית הידרופובי במקביל במכשיר. חבר את ההתקן בשלב יישור ולעבור בניצב.
14. הרם את המצע אופקי עם מנגנון ההעברה ויבש עבור 1 יום בתוך desiccator.

4. Culturing תאים וביצוע אופטימיזציה הידבקות תא וניתוק על פני השטח המועבר לאנגמיור סרטים

1. כדי להכין השעיות תא, תאי האנדותל בעורק התרדמה שור תרבות (BAECs) כדי מפגש שליש ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ ו -95% אוויר על קלקר בתרבית רקמה (TCPS) עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% עוברית בסרום שור (FBS) ו -100 U / פניצילין מ"ל.
2. לאחר המפגש הוא הגיע, לטפל BAECs עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ ו -95% אוויר.
3. לבטל את טריפסין-EDTA על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS, לאסוף את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ"ל.
4. צנטריפוגה ב 120 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant. Re- להשעות את התאים עם 10 מ"ל של DMEM.
5. מניחים את משטחי St-IPAAm באור אולטרה סגול על ספסל נקי ומטהרים למשך 5 דקות.
6. זרעי לסה"נ התאוששהLLS על St-IPAAm משטחים בריכוז של 1.0 x 10 ⁴ תאים / ² סנטימטרים נספרו על ידי hemocytometer פנוי ולבחון את התאים על המשטחים ידי מיקרוסקופ המצויד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ ו -95% אוויר.
   הערה: לעקר משטחי St-IPAAm ידי אור אולטרה סגול מצויד ספסל נקי.
7. זמן לשגות תמונות שיא של BAECs החסיד כ 24.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד עם הגדלה 10X. לאחר הידבקות BAEC, ניתוק שיא של BAECs מפני השטח St-IPAAm בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך כ -3.5 שעות.

5. תא ייצור גיליון על משטחי קולנוע-הועבר לאנגמיור

1. BAECs תרבות המשמש באותו אופן שתואר בסעיף 4.
2. זרעים סך של 1.0 x 10 ⁵ תאים / ² ס"מ על משטחים St-IPAAm דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2. ומחוברות BAECs מנותקת באופן ספונטני על 20 מעלות צלזיוס.

תוצאות

קופולימרים בלוק מורכב פוליסטירן ו poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) עם משקל מולקולרי ספציפי היו מסונתז על ידי פילמור רדיקלי רפסודה. ECT הוכן כסוכן בשרשרת העברת כמתואר Moad et al. ^28. שני סנט-IPAAm מולקולות באורכים שרשרת PIPAAm שונים היו מסונתז, ואת פולימרים...

Discussion

משטח טמפרטורה המגיבה היה מפוברק בשיטה לאנגמיור-שייפר, ואת מאפייני פני השטח עבור הידבקות תא / ניתוק גיליון תא התאוששות היו אופטימיזציה. בעת השימוש בשיטה זו עבור הייצור של משטחים, כמה צעדים חיוניים. את ההרכב המולקולרי של מולקולות St-IPAAm יש השפעה רבה על מבנה השטח ואת היציב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon