Préparation de thermosensible surfaces nanostructurées pour l'ingénierie tissulaire

Résumé

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Résumé

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Introduction

surfaces nanostructurées ont récemment attiré une attention considérable en raison de leurs diverses applications potentielles, y compris les motifs, la culture cellulaire, le nettoyage et la commutation de surface. Par exemple, les surfaces superhydrophobes inspirées par la nanostructure de la feuille de lotus et d' autres surfaces sensibles sont capables de réagir à des stimuli externes ^1-4.

Le film de Langmuir est l'un des revêtements les polymères les plus étudiés. Un film de Langmuir est formé en déposant des molécules amphiphiles sur une interface air-eau ^8/5. Le film peut alors être transféré sur une surface solide par adsorption physique ou chimique, et la conformation moléculaire sur une surface solide peut être contrôlée en utilisant des procédés de transfert vertical et horizontal ^9-12. La masse volumique du film de Langmuir peut être régulée avec précision par compression de l'interface air-eau. Récemment, cette méthode est également avéré efficace pour la fabrication nanométriques structur mer-îlees en utilisant des copolymères à blocs amphiphiles. Les nanostructures sont supposés consister en un noyau de segments hydrophobes et une enveloppe de segments hydrophiles ^13-17. En outre, le nombre de nanostructures sur une surface est régulée par le contrôle de la surface par molécule (A _m) du copolymère séquencé à l'interface.

Nous nous sommes concentrés sur un original, d'un tissu approche unique d'ingénierie sans échafaudage, l'ingénierie de la feuille cellulaire, en utilisant une surface de culture sensible à la température. La technologie développée a été appliquée à des thérapies régénératrices pour divers organes ^18. Une surface de culture sensible à la température a été fabriquée par greffage de poly (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), une molécule sensible à la température, sur une surface ^{de 19 à 27.} PIPAAm et ses copolymères présentent une température de solution critique inférieure (LCST) en milieu aqueux à des températures proches de 32 ° C. La surface de culture a également présenté une alternati sensible à la température entre le caractère hydrophobe et le caractère hydrophile. À 37 ° C, la surface PIPAAm greffée est devenu hydrophobe, et des cellules facilement attaché et prolifèrent sur la surface, ainsi que sur le polystyrène classique de culture tissulaire. Lorsque la température a été abaissée à 20 ° C, la surface devient hydrophile, et les cellules spontanément détaché de la surface. Par conséquent, les cellules confluentes cultivées sur la surface peuvent être récoltées comme une feuille intacte en changeant la température. Ces propriétés d'adhérence cellulaire et de détachement sont également affichées par une surface fabriquée par Langmuir revêtement de film pour le laboratoire de démonstration ^{26, 27.} Un film de Langmuir de copolymères à blocs constitués de polystyrène (P (St)) et PIPAAm (St-IPAAm) a été fabriqué. Le film de Langmuir avec spécifique A _m peut être transféré horizontalement sur ​​un substrat en verre modifié hydrophobiquement. En outre, l'adhésion cellulaire sur et le détachement de la surface préparée en réponse à la température ont été évalués.

_content "> Ici, nous décrivons les protocoles pour la fabrication d'un film de Langmuir nanostructuré composé de copolymères à blocs amphiphiles thermo-réactif sur un substrat de verre. Notre méthode peut fournir une technique de fabrication efficace pour nanofilms organiques dans divers domaines de la science des surfaces et peut faciliter plus un contrôle efficace de l'adhérence cellulaire et sur le détachement spontané d'une surface.

Protocole

1. Synthèse du bloc polystyrène- -poly (N -isopropylacrylamide) par deux étapes réversible transfert de chaîne Addition-fragmentation (RAFT) Radical Polymerization

1. Dissoudre le styrène (153,6 mmol), de 4- cyano-4 (ethylsulfanylthiocarbonyl) d'acide sulfanylpentanoic (TCE, 0,2 mmol) et de 4,4'-azobis (acide 4-cyanovalérique) (ACVA; 0,04 mmol) dans 40 ml de 1, 4-dioxane. Congeler la solution dans de l'azote liquide sous vide pendant 15-20 min pour éliminer les espèces réactives et progressivement décongeler à la température ambiante. Assurez-vous que la solution est complètement décongelé et répéter ce cycle de dégazage gel-pompe-décongélation trois fois.
2. Obtenir le polystyrène (PST) (PM: 13 500) en tant qu'agent de macro RAFT par polymérisation à 70 ° C pendant 15 heures dans un bain d'huile.
3. Précipité PSt agent de macro RAFT avec 800 ml d'éther et sèche sous vide.
4. IPAAm dissoudre le monomère (4,32 mmol), de PSt macro agent RAFT (0,022 mmol) et de ACVA (0,004 mmol) dans 4 ml de 1,4-dioxane.
5. Retirerl'oxygène dans la solution par les cycles de dégazage par congélation-décongélation pompe comme indiqué à l'étape 1.1.
6. Effectuer une polymérisation à 70 ° C pendant 15 heures dans un bain d'huile après dégazage. Obtenir la molécule St-IPAAm synthétisé (Mw: 32800) de la même manière que l'agent de PSt macro RAFT.

2. Préparation des substrats en verre Silanized Hydrophobe modifiés

1. des substrats en verre lavage (24 mm x 50 mm) avec un excès d'acétone et d'éthanol et de traitement par ultrasons pendant 5 minutes pour éliminer les contaminants de surface.
2. Sécher les substrats dans un four à 65 ° C pendant 30 min. Ensuite, en utilisant un plasma d'oxygène (400 W, 3 min) pour activer les surfaces des substrats à température ambiante.
3. Immerger les substrats dans le toluène contenant 1% hexyltriméthoxysilane nuit à TA silaniser le substrat.
4. Laver les substrats silanisées dans le toluène et le plonger dans de l'acétone pendant 30 min pour éliminer les agents ayant pas réagi.
5. recuire les substrats pendant 2 heures à 110 ° C pour immobiliser complètement le sta tête.
6. Couper les substrats silanisées par un coupe-verre à 25 mm x 24 mm pour adapter les boîtes de culture cellulaire (taille de plat: φ35 mm).

3. Préparation de Langmuir Films et Film transféré Surface

1. Placer l'instrument de Langmuir dans une enceinte pour empêcher l'accumulation de poussière.
2. Laver la cuvette de Langmuir (taille: 580 mm x 145 mm) et les barrières à l'eau distillée et de l'éthanol pour éliminer les contaminants.
3. Sécher le creux et les barrières en essuyant avec une serviette non pelucheux. Ensuite, remplissez le bac avec environ 110 ml d'eau distillée, et définir les barrières des deux côtés de l'auge. Notez que l'eau distillée doit être ajoutée sans répandre dans les étapes suivantes de 3,5 à 3,13.
4. Chauffer une plaque Wilhelmy de platine (périmètre: 39.24 mm) pour surveiller la tension de surface avec un brûleur à gaz jusqu'à ce que la plaque devient rouge, puis laver avec de l'eau distillée pour éliminer les contaminants. Suspendre la plaque Wilhelmy sur un fil attaché àl'instrument surface de mesure de pression.
5. L'instrument à zéro surface de mesure de pression selon le protocole du fabricant. Comprimer l'interface air-eau sur la goulotte par les barrières sur les deux côtés de la cuvette jusqu'à ce que l'interface atteint environ 50 cm ² sans gouttes de polymère.
6. Aspirer petits contaminants jusqu'à ce que la pression de surface est presque 0 mN / m.
7. Repositionner les barrières des deux côtés, et ajouter de l'eau distillée pour compenser la diminution de l'eau distillée à l'étape 3.6.
8. Dissoudre 5 mg de la molécule synthétisée St-IPAAm dans 5 ml d'une solution de développement de chloroforme.
   Remarque: dichlorométhane ou le toluène peuvent également être utilisés comme solvant.
9. Laissez tomber doucement 27 pi de St-IPAAm dissous dans du chloroforme sur la cuve à l'aide d'une microseringue ou micropipette.
10. Après avoir attendu pendant 5 min pour permettre l'évaporation complète du chloroforme, déplacer les deux barrières horizontalement pour comprimer le molécu St-IPAAmle à l'interface. Maintenir le taux des obstacles à 0,5 mm / sec jusqu'à ce que la zone cible de 50 cm ² est atteint compression.
    Remarque: Un taux de compression rapide provoque des défauts dans le film de Langmuir.
11. Mesurer la pression de surface (π) -A _m isothermes avec le platine Wilhelmy plaque fixée à l'instrument surface de mesure de pression pendant la compression selon le protocole du fabricant.
12. Après avoir atteint la taille de la zone cible, maintenir la surface pendant 5 minutes pour permettre aux molécules de St-IPAAM de se détendre; les molécules ne parviennent pas à l'équilibre immédiatement après compression.
13. Transférer le film de Langmuir à un substrat de verre modifié hydrophobiquement en utilisant un appareil de transfert pendant 5 min à adsorber solidement le film. Fixer le substrat de verre hydrophobe en parallèle sur le dispositif. Connectez l'appareil à un stade d'alignement et se déplacer perpendiculairement.
14. Soulever le substrat horizontalement du dispositif de transfert et sec pendant 1 jour dans un desiccator.

4. La culture de cellules et optimisation Cell Adhesion et détachement sur la surface Transférés Langmuir Film

1. Pour préparer des suspensions cellulaires, des cellules endothéliales de culture bovine de l' artère carotide (CEAB) à un tiers de confluence à 37 ° C dans 5% de _CO2 et 95% d' air sur la culture tissulaire en polystyrène (EPTC) avec du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) contenant 10% de fœtus sérum bovin (FBS) et 100 U / ml de pénicilline.
2. Après la confluence est atteinte, le traitement CEAB avec 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA pendant 3 min à 37 ° C dans 5% de _CO2 et 95% d' air.
3. Désactiver la trypsine-EDTA par addition de 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS, et récupérer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml.
4. Centrifuger à 120 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de DMEM.
5. Placez les surfaces St-IPAAM sous la lumière ultraviolette sur un banc propre pour la stérilisation pendant 5 min.
6. Seed CE récupéréIIs sur le Saint-IPAAm surfaces à une concentration de 1,0 x 10 ⁴ cellules / cm ² comptées par un hémocytomètre jetable et d' observer les cellules sur les surfaces d'un microscope équipé d'un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ et 95% air.
   Note: Stériliser les surfaces St-IPAAM par la lumière ultraviolette équipée d'un banc propre.
7. images enregistrement time-lapse de CEAB adhérentes pour environ 24,5 heures à 37 ° C par un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 10X. Après BAEC adhérence, le détachement d'enregistrement des CEAB de la surface St-IPAAm à 20 ° C pendant environ 3,5 heures.

Fiche 5. Cellule de fabrication sur les surfaces Langmuir Film-transférés

1. CEAB de culture utilisés de la même manière décrite à la section 4.
2. Ensemencer un total de 1,0 x 10 ⁵ cellules / cm ² sur des surfaces de St-IPAAM et incuber pendant 3 jours à 37 ° C dans 5% de _CO2. Confluent CEAB spontanément détaché à 20 ° C.

Résultats

Les copolymères à blocs composés de polystyrène et de poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) avec des poids moléculaires spécifiques ont été synthétisés par polymérisation radicalaire RAFT. TCE a été préparée en tant qu'agent de transfert de chaîne tel que décrit dans Moad et al. , ^28. Deux molécules St-IPAAM de différentes longueurs de chaîne ont été synthétisés PIPAAm et les polymères à blocs obtenus sont caractérisés par ...

Discussion

Une surface sensible à la température a été fabriquée par le procédé de Langmuir-Schaefer et les propriétés de surface pour l'adhérence cellulaire / détachement et une feuille de recouvrement cellulaire ont été optimisées. Lors de l'utilisation de cette méthode pour la fabrication de surfaces, plusieurs étapes sont critiques. La composition moléculaire des molécules St-IPAAM a un effet important sur la structure de la surface et la stabilité de la surface, et par extension, sur l'adhérenc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon