إعداد Thermoresponsive ذات البنية النانومترية السطوح للهندسة الأنسجة

Summary

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Abstract

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Introduction

وقد جذبت الأسطح ذات البنية النانومترية في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا نظرا لمختلف تطبيقاتها المحتملة، بما في ذلك الزخرفة، زراعة الخلايا، والتنظيف، وتحويل السطح. على سبيل المثال، الأسطح superhydrophobic مستوحاة من البنية النانوية لأوراق اللوتس والأسطح استجابة أخرى قادرة على الاستجابة للمؤثرات الخارجية ^1-4.

الفيلم انجميور هي واحدة من الطلاء البوليمر الأكثر دراسة على نطاق واسع. يتم تشكيل فيلم انجميور من خلال إسقاط جزيئات محبة للجهتين على واجهة بين الهواء والماء ^5-8. الفيلم يمكن بعد ذلك نقل على سطح صلب عن طريق الامتزاز الفيزيائي أو الكيميائي، والتشكل الجزيئي على سطح صلب يمكن السيطرة عليها باستخدام وسائل نقل الرأسي والأفقي ^9-12. كثافة الفيلم انجميور يمكن أن ينظم على وجه التحديد عن طريق ضغط واجهة بين الهواء والماء. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت هذه الطريقة فعالة أيضا لافتعال nanoscaled متطوره البحر جزيرةوفاق من خلال الاستفادة من بوليمرات كتلة محبة للجهتين. ويفترض أن النانو تتكون من مجموعة أساسية من شرائح مسعور وقذيفة من شرائح ماء ^13-17. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تم ضبط عدد من النانو على سطح عن طريق التحكم في المساحة لكل جزيء (A _م) من البوليمرات كتلة في الواجهة.

فقد ركزنا على الأصل، فريدة من نوعها نهج هندسة الأنسجة خالية من سقالة والهندسة ورقة خلية، وذلك باستخدام سطح ثقافة تستجيب للحرارة. وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا المتقدمة لعلاجات التجدد لمختلف الأجهزة ^18. كانت ملفقة سطح ثقافة تستجيب للحرارة عن طريق تطعيم بولي (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm)، وهو جزيء استجابة درجات الحرارة، على سطح ^19-27. PIPAAm وبوليمرات المعرض في درجة حرارة أقل حل الحرجة (LCST) في الأوساط المائية في درجات حرارة قريبة من 32 درجة مئوية. كما عرضت سطح ثقافة alternati استجابة درجات الحرارة على بين للا مائية وhydrophilicity. عند 37 درجة مئوية، وأصبح سطح المطعمة PIPAAm-مسعور، والخلايا تعلق بسهولة وانتشرت على سطح فضلا عن البوليسترين زراعة الأنسجة التقليدية. عندما تم تخفيض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية، وأصبح سطح ماء، وخلايا منفصلة بشكل عفوي من السطح. لذلك، يمكن أن تحصد خلايا متكدسة مثقف على السطح عبارة عن ورقة سليمة عن طريق تغيير درجة الحرارة. تم عرض هذه الخصائص التصاق الخلايا ومفرزة أيضا سطح ملفقة من قبل طلاء فيلم انجميور للتظاهر مختبر ^{26 و 27.} كانت ملفقة فيلم انجميور من بوليمرات كتلة تتكون من البوليسترين (P (القديس)) وPIPAAm (سانت IPAAm). الفيلم انجميور مع _وم معينة يمكن نقلها أفقيا إلى الركيزة الزجاج تعديل hydrophobically. وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم التصاق الخلايا على والابتعاد عن سطح استعداد ردا على درجات الحرارة.

_content "> هنا، نحن تصف بروتوكولات لصنع فيلم انجميور النانوية المؤلفة من بوليمرات كتلة محبة للجهتين الحرارية استجابة على ركيزة الزجاج. لدينا وسيلة يمكن أن توفر تقنية تصنيع فعالة لnanofilms العضوية في مختلف مجالات العلوم السطح ويمكن أن يسهل أكثر السيطرة الفعالة على التصاق الخلايا على ومفرزة عفوية من السطح.

Protocol

1. توليف Polystyrene- كتلة -poly (N -isopropylacrylamide) من خلال خطوتين عكسية إضافة-تجزئة سلسلة نقل (الطوافة) البلمرة الجذرية

1. حل الستايرين (153.6 ميلي مول)، 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) حمض sulfanylpentanoic (ECT؛ 0.2 ملمول)، و4،4'-Azobis (حمض 4-cyanovaleric) (ACVA، 0.04 ملمول) في 40 مل من 1 4-ديوكسان. تجميد الحل في النيتروجين السائل تحت فراغ لمدة 15-20 دقيقة لإزالة الأنواع المتفاعلة وتدريجيا ذوبان الجليد في RT. تأكد من أن الحل هو إذابة تماما ويكرر هذا التجميد مضخة ذوبان الجليد التفريغ دورة ثلاث مرات.
2. الحصول على البوليسترين (PST) (MW: 13،500) كعامل الطوافة الكلي عن طريق البلمرة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حمام الزيت.
3. راسب PST وكيل الطوافة الكلي مع 800 مل من الأثير، وجاف في الخلاء.
4. حل IPAAm مونومر (4.32 ملمول)، PST وكيل الطوافة الكلي (0.022 ملمول)، وACVA (0.004 ملمول) في 4 مل من 1،4-ديوكسان.
5. إزالةالأوكسجين في الحل عن طريق دورات التفريغ تجميد مضخة ذوبان الجليد كما ذكر في الخطوة 1.1.
6. إجراء البلمرة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حمام الزيت بعد التفريغ. الحصول على توليفها سانت IPAAm جزيء (MW: 32800) في نفس الطريقة كما في توقيت المحيط الهادي وكيل الطوافة الكلي.

2. إعداد Silanized مسعور تعديل ركائز الزجاج

1. غسل ركائز الزجاج (24 ملم × 50 ملم) مع وجود فائض من الأسيتون والإيثانول ويصوتن لمدة 5 دقائق لإزالة الملوثات السطحية.
2. تجفيف ركائز في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم استخدام البلازما الأكسجين (400 W، 3 دقيقة) لتنشيط السطوح من ركائز في RT.
3. تزج ركائز في التولوين التي تحتوي على 1٪ hexyltrimethoxysilane بين عشية وضحاها في RT لsilanize الركيزة.
4. غسل ركائز silanized في التولوين وتزج في الأسيتون لمدة 30 دقيقة لإزالة عوامل غير المتفاعل.
5. ركائز يصلب لمدة 2 ساعة على 110 درجة مئوية إلى شل بدقة الصورةوجهك.
6. قطع ركائز silanized من قطع الزجاج إلى 25 ملم × 24 ملم لتناسب أطباق زراعة الخلايا (طبق حجم: φ35 مم).

3. إعداد انجميور أفلام والسطحية نقل السينمائي

1. ضع أداة فيلم انجميور في مجلس الوزراء لمنع تراكم الغبار.
2. غسل حوض انجميور (الحجم: 580 مم × 145 مم) والحواجز مع الماء المقطر والايثانول لإزالة الملوثات.
3. تجفيف الحوض الصغير والحواجز عن طريق المسح بمنشفة lintless. ثم ملء الحوض مع حوالي 110 مل من الماء المقطر، ووضع حواجز على جانبي الحوض. لاحظ أن الماء المقطر ينبغي أن يضاف من دون إراقة في الخطوات التالية 3،5-3،13.
4. تسخين Wilhelmy لوحة البلاتين (محيط: 39.24 ملم) لرصد التوتر السطحي مع الموقد الغازي حتى يتحول لوحة حمراء ثم يغسل بالماء المقطر لإزالة الملوثات. تعليق لوحة Wilhelmy على سلك المرفقةصك أرض الضغط قياس.
5. صفر صك أرض الضغط قياس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضغط واجهة بين الهواء والماء في الحوض الصغير من قبل حواجز على جانبي الحوض الصغير حتى يصل إلى واجهة حوالي 50 سم ² من دون أي قطرات من البوليمر.
6. نضح الملوثات صغيرة حتى ضغط السطح ما يقرب من 0 م ن / م.
7. إعادة وضع الحواجز على كلا الجانبين، وإضافة الماء المقطر لتعويض النقص من الماء المقطر من الخطوة 3.6.
8. حل 5 ملغ من جزيء سانت IPAAm توليفها في 5 مل من محلول تطوير الكلوروفورم.
   ملاحظة: ثنائي كلورو ميثان أو يمكن أيضا التولوين أن تستخدم المذيبات.
9. إسقاط بلطف 27 ميكرولتر من سانت IPAAm يذوب في الكلوروفورم على الحوض باستخدام محقنة مكروية أو micropipette.
10. بعد انتظار لمدة 5 دقائق للسماح التبخر الكامل من كلوروفورم، نقل كل الحواجز أفقيا لضغط molecu سانت IPAAmلو في واجهة. الحفاظ على معدل ضغط من الحواجز عند 0.5 ملم / ثانية حتى المنطقة المستهدفة من 50 يتم التوصل سم ^2.
    ملاحظة: معدل ضغط السريع يسبب عيوب في الفيلم انجميور.
11. قياس ضغط سطح الأيسوثرم (π) -A _م مع لوحة Wilhelmy البلاتين تعلق على صك أرض الضغط قياس ضغط أثناء وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
12. بعد أن بلغ حجم المنطقة المستهدفة، والحفاظ على السطح لمدة 5 دقائق للسماح للجزيئات سانت IPAAm للاسترخاء. الجزيئات لا تصل إلى التوازن مباشرة بعد ضغط.
13. نقل الفيلم انجميور إلى الركيزة الزجاج تعديل hydrophobically باستخدام جهاز نقل لمدة 5 دقائق ليمتص بقوة الفيلم. إصلاح الركيزة الزجاج مسعور في نفس الوقت على الجهاز. وصل الجهاز إلى مرحلة التوافق والتحرك عموديا.
14. رفع الركيزة أفقيا مع جهاز نقل وجافة لمدة 1 يوم في desiccatoص.

4. زراعة الخلايا وتحسين التصاق الخلية ومفرزة على سطح انجميور الفيلم المحول

1. لإعداد تعليق خلية والثقافة البقري الشريان السباتي الخلايا البطانية (BAECs) لالتقاء الثلث عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ و 95٪ جوية على زراعة الأنسجة البوليسترين (برنامج التعاون الفني) مع Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ الجنين مصل بقري (FBS) و 100 U / البنسلين مل.
2. بعد الوصول إلى نقطة التقاء، علاج BAECs مع 3 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ و 95٪ الجوية.
3. تنشيط التربسين-EDTA بإضافة 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، وجمع تعليق خلية إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
4. أجهزة الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. إعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من DMEM.
5. وضع الأسطح سانت IPAAm تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على مقاعد البدلاء النظيفة للتعقيم لمدة 5 دقائق.
6. البذور وم استردLLS على سانت-IPAAm أسطح بتركيز 1.0 × 10 ⁴ خلية / سم ² تحصى من قبل عدادة الكريات يمكن التخلص منها ومراقبة الخلايا على الأسطح بواسطة المجهر مجهزة حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ و 95٪ الهواء.
   ملاحظة: تعقيم الأسطح سانت IPAAm بواسطة الأشعة فوق البنفسجية مجهزة على مقاعد البدلاء النظيفة.
7. الصور سجل الوقت الفاصل بين BAECs تمسكا ما يقرب من 24.5 ساعة على 37 درجة مئوية عن طريق المجهر المرحلة على النقيض مع التكبير 10x. بعد BAEC التصاق، سجل مفرزة من BAECs من سطح سانت IPAAm عند 20 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 3.5 ساعة.

5. خلية ورقة تلفيق على السطوح نقل الفيلم انجميور

1. BAECs الثقافة تستخدم بنفس الطريقة الموضحة في القسم 4.
2. البذور ما مجموعه 1.0 × 10 ⁵ خلية / سم ² على الأسطح سانت IPAAm واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2. متموجة BAECs فصل عفويا عند 20 درجة مئوية.

النتائج

تم توليفها بوليمرات كتلة تتكون من البوليسترين والبولي (N -isopropylacrylamide) (سانت IPAAms) مع الأوزان الجزيئية الخاصة التي الطوافة البلمرة الراديكالية. وقد أعد العلاج بالصدمات الكهربائية كعامل سلسلة نقل كما هو موضح في معاذ وآخرون. ^28. تم توليفها ...

Discussion

كانت ملفقة سطح تستجيب للحرارة من خلال طريقة انجميور-شايفر، وكان الأمثل لخصائص سطح لالتصاق الخلية / انفصال ورقة خلية الانتعاش. عند استخدام هذه الطريقة لتصنيع الأسطح، عدة خطوات حاسمة. في التركيب الجزيئي للجزيئات سانت IPAAm له تأثير كبير على البنية السطحية واستقرار السطح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide	Kohjin		No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid)	Wako Pure Chemicals	016-19332
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-trioxane	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-Dioxane	Wako Pure Chemicals	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	Nakarai	11482-15
Streptomycin	GIBCO BRL	15140-163
Penicillin	GIBCO BRL	15140-122
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
FBS	Japan Bioserum	JBS-11501
BAECs	Health Science Reserch Resources Bank	JCRB0099
Cover Glasses	Matsunami Glass Industry	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U	Nikon