中性粒细胞分离和分析，以确定他们的淋巴瘤细胞的敏感性对治疗药物的作用

摘要

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

摘要

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

引言

先天免疫细胞构成的细胞的肿瘤微环境内的重要比例，并已与患者和癌症¹动物模型中的肿瘤恶性相关。最近，已变得更加广泛地理解，慢性免疫应答中促进肿瘤进展，转移和耐化学疗法²发挥关键作用。巨噬细胞是已被证明直接调节对化疗^3,4-肿瘤细胞应答重要的先天免疫细胞。然而，中性粒细胞，在先天免疫系统的主要参与者的作用，在调节肿瘤响应于抗癌治疗是不知道。这些协议的目的是使用快速和可靠的方法来分离来自CLL患者的血液样本的中性粒细胞和分化的HL60细胞沿粒细胞途径，以研究在调节淋巴瘤细胞抗淋巴瘤剂的敏感性的作用。

中性粒细胞是针对入侵微生物⁶在血液^5，并作为防御的第一道防线是先天免疫系统的最丰富的细胞成分。嗜中性粒细胞有几种病理条件⁷上升除了可变效应子功能有效先天免疫反应中起重要作用。因此，以分离从其它血细胞，如密度梯度分离法中性粒细胞的快速和可靠的方法，需要在体外研究。使用这种方法的中性粒细胞隔离将有利于在体内和体外中性粒细胞介导的免疫功能进一步研究。

以获得嗜中性粒细胞的纯群体的能力对于患者的调查与免疫疾病⁸的重要的第一步。密度梯度分离方法是在其中获得的细胞高产率的理想的技术。该方法具ð涉及在含有稀释的人血，然后离心以300g为无休息35分钟试管底部加入密度梯度溶液中。的单核细胞的环出现在界面和嗜中性粒细胞驻留低于前者。这种方法具有相对于其他可用的方法显著优点，如嗜中性粒细胞分离试剂盒这是更昂贵的^9。此外，通过使用针对特异于人嗜中性粒细胞的表面标志物的抗体的商品试剂盒中分离人血液嗜中性粒细胞，增强细胞活化或分化的风险。密度梯度分离方法允许嗜中性粒细胞的一个短的时间周期内的隔离。在同一步骤，单核细胞也分离和回收。它是在其中，以实现功能完整性得到纯的细胞的高收率的基本技术。

为了模仿肿瘤microenvironment，进行3D实验。定体外中性粒细胞的半衰期很短，用新鲜的人中性粒细胞的3D实验不是决定性的。出于这个原因，早幼粒细胞（HL60）细胞被诱导分化成使用分化诱导剂二甲基亚砜（DMSO）和视黄酸（RA）嗜中性粒细胞样细胞。用分化的HL60细胞（HL60 差异 ）将防止有中性粒细胞，由于来自不同供体隔离不同的反应。

体外三维培养模型代表在体外 2D模型之间和体内模型中的中间阶段。在二维培养，细胞扩散塑料表面上形成不自然的细胞附件被这个合成表面沉积变性的蛋白质。相反，在由于细胞和它们合成的细胞外基质的3D培养形式自然细胞 - 细胞附件细胞对它们所连接的天然材料。出于这个原因，3D共培养模型，尤其是癌症细胞和其他细胞类型之间，已经指示他们的肿瘤的生长，血管生成和转移的贡献非常有用的。其结果是，3D培养使细胞培养模仿存在于体内 ¹⁰的生理条件。

研究方案

1.中性粒细胞分离共培养原发性白血病细胞

注:过程是里昂医院伦理委员会与签署知情同意所有患者同意下进行的。

1. 原代白血病细胞和中性粒细胞的分离
   1. 从确诊为慢性淋巴细胞白血病（CLL）的患者收集EDTA（每毫升血液1.8毫克EDTA）外周血管。
   2. 各15毫升的血液添加到无菌的50ml管中，并用15毫升的RPMI稀释（稀释1:1），然后小心地慢慢加入溶于15毫升的密度梯度溶液到管的底部不混合各相。确保该密度梯度的溶液是在室温下的制备。
   3. 离心机300 XG 35分钟，在室温和不带刹车。血液应该分成四个不同的阶段， 如图1A所示 ，从上到下依次为:血小板和血浆，单核细胞（重量海特环），密度梯度液，粒细胞和红细胞。
   4. 收集其表示原代白血病细胞中，用塑料巴斯德吸管，并转移到一个新的50ml管中的白圈。
      1. 填用PBS管（包含钙和镁）至总体积为50ml，并离心以300g在室温10分钟。
      2. 重悬沉淀用5毫升的PBS再向上总和离心机以300g添加的PBS至50ml在室温10分钟。
      3. 用完全RPMI培养基重悬沉淀（RPMI 1640补充有10％胎牛血清（FBS），2mM谷氨酰胺，100U / ml青霉素和100mg / ml链霉素），用于使用细胞生存力计数器计数。
   5. 抽吸上部相离开粒细胞和红细胞相和加起来的PBS至25ml，然后在0.9％NaClup添加3％葡聚糖至总体积为50ml。混合管10次，并在室温保持他们30分钟没有混合。
   6. 收集上RBC贫中性粒细胞层的d将它们放入一个干净的无菌50ml管中，并以300g离心管在室温下10分钟。重悬每片用5毫升的PBS然后总加起来红细胞裂解液至50ml。
   7. 保持管在黑暗中进行15分钟，在室温，然后在500g下离心在RT 10分钟。用PBS洗粒料（加起来PBS中至总体积为50ml），然后在500g下离心在RT 10分钟。
   8. 悬浮用完全RPMI培养基中的小球用于使用细胞生存力计数器计数。保持每个细胞类型的3×10 ⁵ 5毫升塑料管50微升的PBS-FBS（4％），以确定使用流式细胞术其隔离的纯度。
2. 分析分离细胞种群形态外观
   1. 这样做，重新悬浮每3×10 ^4个嗜中性粒细胞，并在150微升完全RPMI培养基3×10 ^4个单核细胞。组装载玻片，滤波器卡，并在细胞离心涂片离心机样品室，确保吨他离心机是很好的平衡。
   2. 将不同的细胞类型到样品室和CYTO-离心在室温750 XG 10分钟从离心机中取出的幻灯片，过滤器卡和样品室。仔细拆解，以免损坏幻灯片上的细胞。丢弃过滤器卡和样品室。
   3. 染色使用吉姆萨染色试剂盒的细胞和保持载玻片1小时干燥。通过用放大100倍的显微镜检查细胞。
3. 测试用流式细胞仪分离的细胞纯度
   1. 标记的分离的原代白血病细胞用缀合APC的抗人CD19抗体（5微升/ 10 ^6个细胞）。与表1（5微升/ 10 ^6个细胞）中列出的抗人抗体的混合物标记纯化的中性粒细胞。孵育在黑暗细胞30分钟，在^4℃
   2. 清洗细胞用500μl的PBS-FBS（4％）离心机以300g在室温5分钟的管中。
   3. 重悬在200μl的PBS-FBS（4％）每个粒料。
   4. 488纳米激光:FSC-A（488纳米），SSC-A（488 / 10BP），FITC（530/30 BP），PerCP-经Cy5.5（40分之695BP流式细胞仪上使用下面的光学结构流分析），PE（575/26 BP）; 633纳米激光:APC（660/20 BP），APC-Cy7的（780/60 BP）。确保色彩补偿。
4. 自体原发性中性粒细胞白血病细胞共培养
   1. 种子2×10 ^5个细胞/ ml单独使用或与在完全RPMI培养基中1:10自体的中性粒细胞初级白血病细胞。这样做，通过稀释细胞悬浮液调整细胞数和2×10 ^5个细胞/ ml初级白血病细胞添加到2×10 ^6个细胞/ ml的中性粒细胞。仔细混合。
   2. 添加布鲁顿的酪氨酸激酶（BTK）抑制剂（ibrutinib）为25μm到细胞中。用5％的CO ₂下孵育24小时，在37℃。
5. 细胞收集和分析FACS
   1. 科尔等将细胞在5ml塑料管用于FACS分析和离心机以300g在室温5分钟的管中。用1ml的PBS-FBS（4％）洗涤粒料然后以300g离心在RT 5分钟。
   2. 在膜联蛋白V重悬粒料和PI使用商业试剂盒和孵化在黑暗中的细胞在室温10分钟。 488纳米激光:上仪使用图2A的门控策略的流程和以下光学结构分析的FSC-A（488纳米），SSC-A（488 / 10BP），FITC（530/30 BP）的PI（610 / 20 BP）。确保色彩补偿。

2.沿粒途径及其与三维模型RL淋巴瘤B细胞共培养HL60细胞分化

1. 人早幼粒（HL60）细胞分化为中性粒细胞样细胞
   1. 调整HL60细胞数至3×10 ^5个细胞/ ml，然后添加1μM的视黄酸（RA）和1.25％DMSO中，诱导其分化。种子每3×10 ^5个 每孔在48孔板HL60细胞，然后在37℃用5％CO ₂孵育48小时。
   2. 后，收集细胞并离心以300g在室温5分钟。悬浮用完全RPMI培养基中的细胞，使用细胞生存力计数器计数。
   3. 然后稀释细胞悬浮在完全RPMI培养基中以调节HL60细胞数至3×10 ^5个细胞/ ml，并通过加入1μM的视黄酸（RA）和1.25％DMSO的再次诱导其分化。种子每3×10 ⁵ HL60细胞每孔在48孔板中并在37℃用5％CO ₂孵育另外48小时。
2. HL60分化分析（HL60 差异 ）
   1. 收集细胞，并以300g离心管在RT 5分钟。重悬完全RPMI培养基颗粒使用细胞活力计数器计数。
   2. 分析通过流式细胞术在细胞表面标志物的表达的变化。将每个3×10 ^5个 未分化的HL60细胞（来自细胞培养物）并在5ml塑料管用于FACS分析和离心机以300g在室温5分钟管3×10 ⁵ HL60 差异细胞。
   3. 重悬在50μl的PBS-FBS（4％）的粒料。标签用抗人CD11b的缀合AF700或缀合APC的抗人CD38（5微升/ 10 ^6个细胞）的细胞。孵育在黑暗细胞30分钟，在^4℃
   4. 用500μl的PBS-FBS（4％）洗涤，然后以300g离心在RT 5分钟。重悬在200μl的PBS-FBS（4％）的粒料。
   5. 对流动分析仪使用图3A的门控策略及以下的光学配置:488 nm激光:FSC-A（488纳米），SSC-A（488 / 10BP）; 633纳米激光:APC（660/20 BP）的Alexa Fluor 700（730/45 BP）。
   6. 为了测试在HL60 差异的形态变化，细胞固相化到玻片上进行显微镜检查。
      1. 这样做，重新悬浮每3×10 ^{4未分化的HL60细胞（来自细胞培养物）和3×10 4的HL60 差异在150微升完全RPMI培养基。组装载玻片，滤波器卡，以及样品室中的细胞离心涂片离心机，确保离心机是平衡的。}
      2. 将每个细胞类型到样品室和CYTO-离心机以1,500rpm在室温10分钟。取出幻灯片，滤波器卡，并从离心机样品室。仔细拆解，以免损坏幻灯片上的细胞。丢弃过滤器卡和样品室。
      3. 染色使用吉姆萨染色试剂盒的细胞和保持载玻片1小时干燥。通过用放大100倍的显微镜检查细胞。
3. 三维（3D）培养
   注:确保在本实验中所用的材料是冷和实验正在发生在冰上。
   1. 悬浮每5×10 ⁴的RL细胞，单独或与HL60 差异混合在比RL:HL60 差异 1:10使用，以扩大所述开口至约2至3毫米的无菌剪刀切1毫升枪头300μl的基底膜基质。在此步骤期间避免气泡。
   2. 种子各300微升细胞悬浮液/孔在24孔板中。在此步骤期间避免气泡。温育30分钟的板在37℃，5％的CO ₂然后加入1ml完全RPMI培养基每个孔，并在37℃用5％CO ₂孵育7天。改变介质每两天。在第5天加10纳米长春新碱。
4. FACS分析
   1. 经过7天培养的，吸出培养基并用1ml冰冷的PBS洗每个孔两次。加3毫升/冰冷的PBS-EDTA（5毫米）的井。通过使用200微升枪头的底部刮分离从井的底部的凝胶。轻轻摇动板在冰上30分钟。
   2. 转移细胞悬液到无菌15ml试管并轻轻摇晃在IC管E对于30分钟。检查同质细胞悬浮液的外观。 （如果不是的话，那么摇晃细胞较长时间或添加更多的PBS-EDTA）。
   3. 离心管，在300×g离心在RT 10分钟。用PBS洗粒料然后在300 xg离心离心在RT 10分钟。
   4. 用PBS-FBS（4％）重悬，并与缀合PE-Cy7的和缀合APC的抗人CD38抗体（5微升/ 10 ^6个细胞）的抗人CD19抗体标记。孵育在黑暗的30分钟，在^4℃
   5. 用500μl的PBS-FBS（4％），然后离心管洗以300g在室温5分钟。重悬以膜联蛋白V和PI使用商业试剂盒的细胞。
   6. 对流动分析仪使用图4A的门控策略和下述光学配置:488纳米激光:FSC-A（488纳米），SSC-A（488 / 10BP），FITC（530/30 BP）的PI（610 / 20 BP），PE-Cy7的（780/60 BP）; 633纳米激光:APC（660/20 BP）。确保色彩补偿。

结果

这里所描述的密度梯度分离方法提供了从CLL患者的血液中分离的原代白血病细胞和未刺激的嗜中性粒细胞图1A表示密度梯度离心后获得的不同血液层（从上到下:血小板和血浆，白圈表示的单核细胞，密度梯度溶液，粒细胞和红细胞）。 图1B和1C分别示出嗜中性粒细胞（多叶形核细胞）和单核细胞之间的形态出现的差异。

讨论

这里所描述的，有效的，简单，快速和廉价的协议为嗜中性粒细胞的人血液中分离，使用密度梯度离心的方法的高纯度和相同的步骤的单核细胞内也分离和回收。所述分离的细胞群是≥90％的纯度。

有几种方法可用于从人血液嗜中性粒细胞的隔离。这些包括类似的方法使用连续梯度^11,12，或使用嗜中性粒细胞分离试剂盒由阳性免疫磁性选择期间的中性粒细胞是免疫磁?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience