Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Zusammenfassung

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Zusammenfassung

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Einleitung

Angeborene Immunzellen bilden einen wesentlichen Teil der Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung und wurden mit Tumor Malignität in Patienten und Tiermodellen von Krebs ¹ verbunden. Vor kurzem hat es sehr geschätzt werden , dass eine chronische Immunreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemotherapien ² spielen. Makrophagen sind wichtige angeborenen Immunzellen , die direkt gezeigt worden ist, um Tumorzellantwort auf Chemotherapie ^3,4 regulieren. Allerdings ist die Rolle der Neutrophilen, wichtige Akteure in der angeborenen Immunsystems, bei der Regulierung der Tumor Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung nicht bekannt. Die Ziele dieser Protokolle sind eine schnelle und glaubwürdige Methode zu verwenden Neutrophilen von CLL Patienten Blutproben zu trennen und HL60-Zellen entlang der granulocytic Weg, um ihre Rolle zu unterscheiden bei der Regulierung der Empfindlichkeit von Lymphomzellen zu Anti-Lymphom-Agenten zu studieren.

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende zelluläre Komponente des angeborenen Immunsystems im Blut ⁵ und wirken als erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen ⁶ eindringen. Neutrophile haben eine wesentliche Rolle ⁷ wirksam angeborenen Immunantwort zusätzlich zu den variablen Effektor - Funktionen in verschiedenen pathologischen Zuständen in steigenden. Daher ist eine schnelle und glaubwürdige Methode Neutrophile von anderen Blutzellen, wie Dichtegradient - Trennverfahren zu isolieren, ist für in vitro - Studien erforderlich. Unter Verwendung dieses Verfahrens zur Isolierung von Neutrophilen erleichtert die weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelten immunologischen Funktionen in vivo und ex vivo.

Die Fähigkeit , reine Populationen von Neutrophilen zu erhalten , ist ein wichtiger erster Schritt für die Untersuchung von Patienten mit immunologischen Erkrankungen ^8. Dichtegradienten-Trennungsverfahren ist ein ideales Verfahren, bei dem eine hohe Ausbeute an Zellen erhalten wird. Die method beinhaltet die Zugabe von Dichtegradient-Lösung in den Boden eines Röhrchens verdünnten Humanblut durch Zentrifugation für 35 min bei 300 g ohne Bruch enthält, gefolgt. Der Ring der einkernigen Zellen erscheint an der Schnittstelle und die Neutrophilen liegen unterhalb des ersteren. Diese Verfahren haben erhebliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Verfahren, wie Neutrophilen - Isolierungs - Kits , die ⁹ viel teurer sind. Zusätzlich Neutrophilen aus menschlichem Blut durch kommerzielle Kits unter Verwendung von Antikörpern, die an einen Oberflächenmarker spezifisch für humane Neutrophile, erhöhen das Risiko von Zell-Aktivierung oder Differenzierung zu isolieren. Dichtegradienten Trennungsverfahren erlaubt die Isolierung von neutrophilen Granulozyten innerhalb eines kurzen Zeitraums. Innerhalb der gleichen Schritt werden mononukleäre Zellen ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Es ist eine grundlegende Technik, bei dem eine hohe Ausbeute an reinen Zellen, um erhaltene funktionelle Integrität zu erzielen.

Um den Tumor microenv zu imitierenironment wurden 3D-Experimente durchgeführt. In Anbetracht der kurzen Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro, sind die 3D - Experimente mit frischen menschlichen Neutrophilen nicht schlüssig. Dimethylsulfoxid (DMSO) und Retinsäure (RA) mit Hilfe der Differenzierungsinduktoren Aus diesem Grund promyelocytic (HL60-Zellen) induziert in Neutrophilen-ähnliche Zellen zu differenzieren. Mit differenzierten HL60 - Zellen (HL60 diff) wird verhindert , dass unterschiedliche Reaktionen von Neutrophilen, die aufgrund Isolierung von verschiedenen Spendern.

In - vitro - 3D - Kulturmodelle stellen eine Zwischenstufe zwischen In - vitro - 2D - Modelle und in vivo Modellen. Im 2D-Kultur, breiteten sich die Zellen auf Kunststoff-Oberfläche unnatürliche Zelle Anhänge abgeschiedenen Proteine ​​bilden, die auf dieser synthetischen Oberfläche denaturiert werden. Umgekehrt können die Zellen in 3D-Kulturform natürliche Zell-Zell-Anlagen, da die Zellen und die extrazelluläre Matrix synthetisieren sie das natürliche Material, an dem sie angebracht sind.Aus diesem Grund 3D Kokultur Modellen, insbesondere zwischen Krebszellen und anderen Zelltypen, ist der Beitrag zu Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung sehr nützlich für die Anzeige. Als Ergebnis machen 3D - Kulturen die Zellkultur , die physiologischen Bedingungen nachahmen , die mit ¹⁰ in vivo existieren.

Protokoll

1. Neutrophilen-Isolierung und Co-Kultur mit primären leukämischen Zellen

HINWEIS: Die Verfahren wurden im Rahmen der Genehmigung von Lyon Krankenhaus Ethikkommission bei allen Patienten durchgeführt, informierte Zustimmung zu unterzeichnen.

1. Isolierung von primären leukämischen Zellen und Neutrophile
   1. Sammeln Sie Rohre aus dem peripheren Blut auf EDTA (1,8 mg EDTA pro Milliliter Blut) von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie diagnostiziert (CLL).
   2. Ist jeweils mit 15 ml Blut in einen sterilen 50 ml-Röhrchen und verdünnt mit 15 ml RPMI (Verdünnung 1: 1), dann vorsichtig und langsam 15 ml Dichtegradient-Lösung auf den Boden des Rohres, ohne die Phasen zu vermischen. Sicherzustellen, dass der Dichtegradient-Lösung bei RT für die Zubereitung ist.
   3. Zentrifuge bei 300 × g für 35 min bei RT ohne Bremse. Das Blut sollte in vier verschiedene Phasen trennen , wie in Figur 1A von oben nach unten gezeigt: Thrombozyten und Plasma, mononukleäre Zellen (white Ring), Dichtegradientenlösung, Granulozyten und Erythrozyten.
   4. Sammeln Sie den weißen Ring, der die primären leukämischen Zellen mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und an einem neuen 50-ml-Tube darstellt.
      1. Das Rohr wird mit PBS (enthält Calcium und Magnesium) bis zu 50 ml in total und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei RT.
      2. bis zu 50 ml in total und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei RT das Pellet mit 5 ml PBS dann PBS hinzu.
      3. Das Pellet mit komplettem RPMI-Medium (RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin) zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen-Zähler verwendet wird.
   5. Aspirieren die oberen Phasen der Granulozyten und Erythrozyten-Phase verlassen und PBS summieren sich zu 25 ml dann 3% Dextran in 0,9% NaClup in insgesamt 50 ml hinzu. Mischen Sie die Röhrchen 10 Mal und halten sie für 30 min bei RT ohne sich zu vermischen.
   6. Sammeln Sie die obere RBC-armen Neutrophilen Schicht eind sie in ein sauberes steriles 50 ml Röhrchen platzieren und die Röhrchen bei 300 g für 10 min bei RT zentrifugiert. bis zu 50 ml insgesamt resuspendieren jedes Pellet mit 5 ml PBS dann Puffer Lyse der Erythrozyten hinzufügen.
   7. Halten der Rohre in Dunkelheit für 15 min bei RT, dann bei 500 g für 10 min bei RT zentrifugiert. Waschen Sie die Pellets mit PBS (add PBS bis zu 50 ml insgesamt) bei 500 g zentrifugiert werden für 10 min bei RT.
   8. Resuspendieren der Pellets mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird. Halten Sie 3 x 10 ⁵ jeder Zelltyp in 50 ul PBS-FBS (4%) in 5 ml Kunststoffröhrchen , die Reinheit ihrer Isolation zu bestimmen , mittels Durchflusszytometrie.
2. Analysieren Sie die Morphologische Einsätze der isolierten Zellpopulationen
   1. Dazu resuspendieren je 3 x 10 ⁴ Neutrophilen und 3 x 10 ⁴ mononukleären Zellen in 150 & mgr; l komplettes RPMI Medium. Montieren Sie die Glasobjektträger, Filterkarten und Probenkammern in der Cytospin Zentrifuge, um sicherzustellen, dass ter Zentrifuge ist gut ausbalanciert.
   2. Platzieren Sie jede Zelltyp in die Probenkammer und Zyto-Zentrifuge bei 750 × g für 10 min bei RT Entfernen Sie die Folien, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Disassemblieren vorsichtig, um nicht die Zellen auf dem Objektträger zu beschädigen. Entsorgen Filterkarten und Probenkammern.
   3. Stain die Zellen mit Giemsa-Kit und halten Sie die Folien für 1 Stunde trocknen lassen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung.
3. Testen Sie die Reinheit der isolierten Zellen durch FACS
   1. Beschriften der isolierten primären leukämischen Zellen , die mit anti-human CD19 - Antikörper , konjugiert an APC (5 & mgr; l / 10 ⁶ Zellen). Beschriften der gereinigten Neutrophilen mit einer Mischung aus anti-human - Antikörper aufgelistet in Tabelle 1 (5 & mgr; l / 10 ⁶ Zellen). Inkubieren der Zellen in Dunkelheit für 30 min bei 4 ^o C.
   2. Waschen Sie die Zellen mit 500 ul PBS-FBS (4%) der Zentrifuge die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
   3. Resuspendieren jedes Pellet in 200 & mgr; l PBS-FBS (4%).
   4. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer, mit dem folgenden optischen Konfiguration: 488-nm-Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation.
4. Cokultur von primären leukämischen Zellen mit Autologe Neutrophile
   1. Seed 2 x 10 ⁵ Zellen / ml der primären leukämischen Zellen allein oder mit autologem Neutrophilen im Verhältnis 1:10 in komplettem RPMI - Medium. Dazu Zellzahlen durch Verdünnen von Zellsuspensionen einzustellen und mit 2 x 10 ⁵ Zellen / ml der primären leukämischen Zellen zu 2 x 10 ⁶ Zellen / ml Neutrophilen. Vorsichtig mischen.
   2. Zugeben von 25 & mgr; M Bruton-Tyrosinkinase (Btk) -Inhibitor (Ibrutinib) zu den Zellen. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.
5. Zellernte und FACS Analyse
   1. Collect die Zellen in 5 ml Kunststoffröhrchen für die FACS-Analyse und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT die Rohre. Waschen der Pellets mit 1 ml PBS-FBS (4%), dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugiert.
   2. Resuspendieren Pellets in Annexin V und PI kommerziellen Kits und die Zellen in Dunkelheit für 10 min bei RT inkubiert. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer die Gating - Strategie von 2A mit und der folgenden optischen Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation.

2. Differenzierung von HL60-Zellen entlang der Granulozytäre Pathway und ihre Cokultur mit RL-Lymphom B-Zellen in 3D-Modell

1. Differenzierung von humanen promyelocytic (HL60) Zellen in Neutrophilen-ähnliche Zellen
   1. Einstellen HL60 Zellzahl bis 3 x 10 ⁵ Zellen / ml fügen Sie dann 1 uM Retinsäure (RA) und 1,25% DMSO deren Differenzierung zu induzieren. Samen je 3 x 10 ⁵ HL 60 Zellen pro Vertiefung in 48-Well - Platte dann mit 5% CO ₂ bei 37 ° C für 48 Stunden inkubiert.
   2. Später wurden die Zellen und Zentrifuge bei 300 g für 5 min bei RT sammeln. Resuspendieren der Zellen mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird.
   3. Dann Zellsuspension in komplettem RPMI - Medium verdünnt auf HL60 Zellzahl bis 3 x 10 ⁵ Zellen / ml und induzieren wieder ihre Differenzierung durch Zugabe von 1 & mgr; M Retinsäure (RA) und 1,25% DMSO einzustellen. Samen je 3 x 10 ⁵ HL60 - Zellen pro Well in 48-Well - Platte und Inkubation für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.
2. Analyse von HL60 Differenzierung (HL60 diff)
   1. Sammeln Sie die Zellen und Zentrifugieren der Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Das Pellet mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird.
   2. Um die Änderungen in der Zelloberflächenmarker-Expression mittels Durchflusszytometrie analysiert. Legen Sie jedes 3 x 10 ⁵ undifferenzierte HL60 - Zellen (aus der Zellkultur) und 3 x 10 ⁵ Zellen HL60 diff in 5 ml Kunststoffröhrchen für die FACS - Analyse und zentrifugieren die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
   3. Resuspendieren der Pellets in 50 & mgr; l PBS-FBS (4%). Beschriften der Zellen mit anti-Mensch - CD11b konjugiert AF700 oder anti-human CD38 , konjugiert an APC (5 & mgr; l / 10 ⁶ Zellen). Inkubieren der Zellen in Dunkelheit für 30 min bei 4 ^o C.
   4. Waschen mit 500 ul PBS-FBS (4%), dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugiert. Resuspendieren der Pellets in 200 ul PBS-FBS (4%).
   5. Analysieren Sie auf Durchflusszytometer mit der Gating - Strategie von 3A und die folgende optische Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Um die morphologischen Veränderungen in HL60 diff zu testen, zu immobilisieren , die Zellen auf Glasobjektträger für die mikroskopische Untersuchung.
      1. Um dies zu tun, resuspendieren jedes 3 x 10 ^{4 undifferenzierte HL60 - Zellen (aus Zellkultur) und 3 x 10 4 HL60 diff in 150 ul komplettem RPMI Medium. Montieren Sie die Glasobjektträger, Filterkarten und Probenkammern in der Cytospin Zentrifuge, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausgeglichen ist.}
      2. Platzieren Sie jede Zelltyp in die Probenkammer und Zyto-Zentrifuge bei 1500 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei RT. Entfernen Sie die Folien, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Disassemblieren vorsichtig, um nicht die Zellen auf dem Objektträger zu beschädigen. Entsorgen Filterkarten und Probenkammern.
      3. Stain die Zellen mit Giemsa-Kit und halten Sie die Folien für 1 Stunde trocknen lassen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung.
3. 3-dimensionale (3D) Kultur
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Materialien, die in diesem Experiment verwendet werden, sind kalt und das Experiment auf Eis stattfindet.
   1. Resuspendieren je 5 x 10 ⁴ RL - Zellen, entweder allein oder mit HL60 diff gemischt Im Verhältnis RL: HL60 diff 1:10 mit 300 Matrix ul Basalmembran 1 ml Pipettenspitze mit einer sterilen Schere , um die Öffnung zu etwa 2 bis 3 mm zu erweitern geschnitten werden. Vermeiden Blasen während dieses Schritts.
   2. Samen je 300 ul Zellsuspension / Well in 24-Well-Platte. Vermeiden Blasen während dieses Schritts. Die Platte für 30 Minuten bei 37 ° C mit 5% CO ₂ dann 1 addieren ml RPMI - Medium für jede Vertiefung und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C mit 5% CO ₂ abzuschließen. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage. In 10 nM Vincristin am Tag 5.
4. FACS - Analyse
   1. Nach 7 Tagen Kultur absaugen Medium und waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal. 3 ml / Vertiefung von eiskaltem PBS-EDTA (5 mM). Nehmen Sie das Gel aus dem Boden des Bohrlochs durch Abkratzen der Unterseite von 200 ul Pipettenspitze. Schütteln Sie die Platte vorsichtig auf Eis für 30 min.
   2. Übertragen Zellsuspension in sterile 15-ml-Röhrchen und schütteln die Röhrchen sanft auf ice für weitere 30 min. Überprüfen Sie, ob das Auftreten von homogenen Zellsuspension. (Wenn es nicht der Fall ist, dann schütteln die Zellen für längere Zeit oder mehr hinzufügen PBS-EDTA).
   3. Zentrifugiere die Röhrchen bei 300 xg für 10 min bei RT. Waschen Sie die Pellets mit PBS dann bei 300 g für 10 min bei RT zentrifugiert werden.
   4. Resuspendieren mit PBS-FBS (4%) und Etikett mit anti-human - CD19 - Antikörper an PE-Cy7 konjugiert und Anti-Human - CD38 - Antikörper konjugiert an APC (5 & mgr; l / 10 ⁶ Zellen). In dunklen Inkubieren für 30 Minuten bei 4 ^° C.
   5. Waschen mit 500 ul PBS-FBS (4%), dann Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Resuspendieren der Zellen mit Annexin V und PI kommerziellen Kits.
   6. Analysieren Sie auf Durchflusszytometer mit der Gating - Strategie von 4A und die folgende optische Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation.

Ergebnisse

Dichtegradiententrennung hier beschriebenen Verfahren liefert primären leukämischen Zellen und unstimulierte aus dem Blut von CLL - Patienten isoliert Neutrophilen 1A die verschiedenen Blutschichten nach Dichtegradientenzentrifugation (von oben nach unten darstellt , die erhalten. Blutplättchen und Plasma, weißen Ring der einkernigen Zellen darstellt, Dichtegradientenlösung, Granulozyten und Erythrozyten). 1B und 1C zeigen die Unterschiede in den mo...

Diskussion

Hier beschrieben, eine wirksame, einfach, schnell und preiswert Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut mit hoher Reinheit Dichtegradientenzentrifugation Ansatzes und innerhalb der gleichen Schritt mononukleären Zellen werden ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Die isolierten Zellpopulationen sind ≥90% rein.

Es sind mehrere Verfahren für neutrophile Isolierung aus menschlichem Blut zur Verfügung. Diese umfassen ähnliche Verfahren unter Verwendung von diskontinuie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience