Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Özet

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Özet

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Giriş

Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser ¹ hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler ² tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi ^3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokollerin amacı KLL hastanın kan örneklerinden nötrofil ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem kullanmak ve anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığını düzenleyen rollerini araştırmak için granülositik yol boyunca HL60 hücreleri ayırt etmek vardır.

Nötrofiller mikroorganizmaları ⁶ işgalci karşı ilk savunma hattı olarak kan ⁵ ve hareket doğuştan gelen bağışıklık sisteminin en bol hücresel bileşenidir. Nötrofiller, çeşitli patolojik şartlarda ⁷ değişken efektör fonksiyonlara ek olarak etkili bir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları artan önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gibi diğer kan hücreleri, nötrofillerin izole etmek için, hızlı ve güvenilir bir yöntem olup, in vitro çalışmalar için gereklidir. Nötrofil izolasyonu için, bu yöntem kullanılarak, in vivo ve ex vivo nötrofil aracılığıyla oluşturulan imünolojik fonksiyonları üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır.

Nötrofillerin saf popülasyonlarının elde etme yeteneği immünolojik hastalıkların ⁸ hastaların araştırılması için önemli bir ilk adımdır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi hücrelerin yüksek verim elde edildiği bir yere bir tekniktir. methoD ara vermeden 35 dakika boyunca 300 g'de santrifüje edilerek ve ardından seyreltilmiş insan kanı ihtiva eden bir tüpün alt yoğunluk gradyan çözeltisi ilave edilmesini kapsar. mononükleer hücrelerin halka arayüzü görünür ve nötrofiller eski aşağıda bulunur. Bu yöntem, çok daha ⁹ pahalı nötrofil izolasyon kiti gibi diğer mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahip. Buna ek olarak, insan nötrofillerinden için spesifik bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanılarak ticari kitler insan kanından nötrofilleri izole hücre aktivasyonunun veya farklılaşmasının riskini arttırır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kısa bir süre içinde, nötrofillerin izolasyonu sağlar. Aynı aşamada içinde, tek çekirdekli hücreler, ayrılmış ve geri kazanılır. Saf hücrelerin yüksek verimi fonksiyonel bütünlüğü elde etmek için elde edildiği bir temel teknik.

Tümör microenv taklit etmek içinironment 3D deneyler gerçekleştirilmiştir. In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü göz önüne alındığında, yeni insan nötrofil 3D deneyler kesin değildir. Bu nedenle, promiyelositik (HL60) hücreleri farklılaşma uyarıcılar dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) kullanılarak, nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmaları için indüklenir. Farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) kullanarak, farklı donörlerden izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip önleyecektir.

In vitro 3D kültür modelleri, in vitro 2D modelleri arasında ve in vivo modellerde bir ara evresini temsil eder. 2B kültüründe hücreler bu sentetik yüzey üzerinde denatüre edilir biriken proteinlere doğal olmayan hücre ekleri oluşturan plastik yüzeye yayılır. Bunun aksine, hücre ve hücre dışı matrisin sentezlenmesi için 3D kültürü da doğal hücre-hücre ek hücreler, bağlı oldukları doğal malzeme vardır.Bu nedenle, özellikle de, kanser hücreleri ve diğer hücre tipleri arasında 3D ko-kültür modelleri, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastazın katkıları gösteren için yararlı olmuştur. Bunun bir sonucu olarak, 3D kültürleri, hücre kültürü, in vivo ¹⁰ mevcut fizyolojik koşulları taklit etmek.

Protokol

Primer lösemik hücreler ile 1. Nötrofil İzolasyon ve Co-kültür

NOT: Prosedürler bilgilendirilmiş onam imzalanması tüm hastalarda Lyon Hastane Etik kurul onayı altında gerçekleştirilmiştir.

1. Birincil lösemik hücreler ve nötrofillerin izolasyonu
   1. Kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı hastaların EDTA (kan mililitrede 1.8 mg EDTA) periferik kan tüpleri toplamak.
   2. Bir steril 50 ml tüp kan her biri 15 ml ilave edilir ve 15 ml RPMI seyreltin (seyreltme 1: 1), daha sonra dikkatli bir şekilde yavaş yavaş fazlar karıştırılmadan tüpün dibine yoğunluk gradyan çözeltisi 15 ml ilave ediniz. yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlanması için oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
   3. Oda sıcaklığında ve frensiz 35 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj. Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru gösterildiği gibi kan dört farklı aşamadan ayırmak gerekir: trombosit ve plazma, mononükleer hücreleri (white halkası), yoğunluk gradyan çözümü, granülositler ve eritrositler.
   4. Yeni 50 ml tüp plastik Pasteur pipeti ve transferi ile birincil lösemik hücreleri temsil beyaz halka toplayın.
      1. PBS ile tüp içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml'ye kadar (kalsiyum ve magnezyum içerir) doldurun.
      2. 5 PBS daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml'ye kadar PBS ilave mL pelletini.
      3. tam RPMI ortamı ile pelletini (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 100 U ile takviye / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin), hücre canlılığı sayacını kullanarak sayım için.
   5. Aspire Üst fazlar granülosit eritrosit faz ayrılıp 25 ml'ye kadar PBS ekleyin toplam 50 ml% 0.9 NaClup içinde% 3 dekstran ekleyin. boruları 10 kez karıştırın ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca muhafaza edin.
   6. Üst RBC-fakir nötrofil katman toplayıntemiz ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri d. PBS sonra toplam 50 ml kadar kırmızı hücre parçalama tampon ekleyin ml 5 ile her pelletini.
   7. RT daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüj 15 dakika süreyle karanlıkta tüpler tutun. PBS ile pelet (toplam 50 ml'ye kadar PBS ekleyin), daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüj yıkayın.
   8. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi kullanılarak izolasyon saflığını belirlemek için 5 ml'lik plastik tüplere 50 ul PBS-FBS (% 4), her hücre türü için 3 x 10 ⁵ tutun.
2. İzole hücre popülasyonlarının Morfolojik Görüntüle'ye analiz
   1. Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 ⁴ Nötrofiller ve 150 ul tam RPMI ortamında 3 x 10 ⁴ mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Bu t sağlanması, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirinO santrifüj iyi dengelenmiş.
   2. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odalarında çıkarın oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 750 x g'de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın.
   3. Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin.
3. FACS İzole Hücrelerin Saflık test
   1. APC konjüge anti-insan CD19 antikoru (5 ul / 10 ⁶ hücre) ile izole edilmiş, birincil lösemi hücreleri etiketlemek. Tablo 1 (5 ul / 10 ⁶ hücre) listelenen anti-insan antikorlarının karışımı ile saflaştırılmış nötrofilleri etiketleyin. 4 ^O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri
   2. 500 ul PBS-FBS (% 4), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri hücreleri yıkayın.
   3. 200 ul PBS-FBS (% 4), her pelletini.
   4. , SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP FSC-A (488 nM): 488 nm lazer: Aşağıdaki optik yapılandırmayı kullanarak bir akış sitometresinde analiz ), PE (BP 575/26); 633 nm lazer: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Renk karşılanmasını sağlamak.
4. Otolog Nötrofiller ile İlköğretim lösemik hücrelerinin Coculture
   1. Tohum, birincil lösemi hücrelerinin tek başına ya da tam RPMI ortamı içinde oranı 1:10 otolog nötrofiller 2 x 10 ⁵ hücre / ml olmuştur. Bunu yapmak için, seyreltilmesi hücre süspansiyonları, hücre sayıları ayarlayın ve 2 x 10 ⁶ hücre / mL nötrofil birincil lösemi hücre 2 x 10 ⁵ hücre / ml ekleyin. dikkatlice karıştırın.
   2. hücrelere Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (İbrutinib) 25 uM ekleyin. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 24 saat süreyle inkübe edilir.
5. Hücre Hasat ve FACS analizi
   1. collECT, FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da tüpler 5 ml'lik plastik tüplere hücreleri. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj 1 ml PBS-FBS (% 4) ile granül yıkayın.
   2. ticari kit kullanılarak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe hücreleri süspanse Annexin V ve PI peletler. (FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI 610: 488 nm lazer: Şekil 2A yolluk stratejisi kullanarak bir akış sitometresinde ve aşağıdaki optik yapılandırmasına analiz / 20 BP). Renk karşılanmasını sağlamak.

Granulositik Pathway ve 3D Model RL Lenfoma B Hücreleri ile Bunların kokültürü boyunca HL60 Hücre 2. Farklılaşma

1. Nötrofil benzeri Hücreleri içine insan promiyelositik (HL60) Hücre Farklılaşma
   1. / Ml daha sonra değişimi etkilemek için 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave 3 x 10 ⁵ hücre HL60 hücre sayısını ayarlar. Her 3 x 10 ⁵ Tohum de 48 oyuklu plaka başına HL60 hücreleri daha sonra% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edilir.
   2. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g hücreleri ve santrifüj toplar. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri.
   3. Sonra bu çözeltiye, 3 x 10 ⁵ hücre / HL60 hücre sayısını ayarlamak ve 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave edilerek kendi değişimini etkileme tam RPMI ortamı içinde hücre süspansiyonu seyreltin. Oyuk başına 48 oyuklu plaka içerisinde her biri 3 x 10 ⁵ HL60 hücreleri, tohum ve% 5 _CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta bir 48 saat daha inkübe edilir.
2. HL60 farklılaşma Analizi (HL60 fark)
   1. hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin.
   2. flow sitometri ile hücre-yüzey belirteçleri ifade değişikliklerini analiz etmek. Her 3 x 10 ⁵ koyun ayrışmamış (hücre kültüründen) HL60 hücrelerinin ve FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da tüpler 5 ml'lik plastik tüplere, 3 x 10 ⁵ HL60 fark hücreleri.
   3. 50 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. AF700 veya APC konjüge anti-insan CD38 (5 ul / 10 ⁶ hücre) konjüge edilmiş bir anti-insan CD11b hücreleri etiketleyin. 4 ^O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri
   4. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj 500 ul PBS-FBS (% 4) ile yıkayınız. 200 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin.
   5. 488 nm lazer: Şekil 3A yolluk stratejisi ve aşağıdaki optik yapılandırma kullanarak akış sitometresinde analiz FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (BP 730/45).
   6. HL60 fark morfolojik değişiklikleri test etmek için, mikroskobik inceleme için cam slaytlar üzerine hücreleri hareketsiz.
      1. Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 tekrar süspansiyon 4 farklılaşmamış HL60 hücrelerinin 150 ul komple RPMI ortamı içinde 3 x 10 ⁴ HL60 fark. santrifüj dengeli olmasını sağlamak, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirin.
      2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm'de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları çıkarın. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın.
      3. Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin.
3. 3 boyutlu (3D) Kültür
   NOT: Bu deneyde kullanılan malzemeler soğuk ve deney buz üzerinde gerçekleşiyor emin olun.
   1. Tek başına veya HL60 fark ile karıştırılır ya her 5 x 10 ⁴ RL hücreleri tekrar süspansiyon Oranı RL: HL60 fark 1:10 yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril makasla kesme, 1 ml bir pipet kullanarak 300 ul bazal membran matris ile karıştırılması. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının.
   2. 24 oyuklu bir plaka içerisinde de / hücre süspansiyonu her biri 300 ul tohumu. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. Daha sonra her bir RPMI ortamı doldurun ve% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 7 gün süre ile inkübe ml 1 ekleyin% 5 _CO2 ile 37 ° C' de 30 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. iki günde orta değiştirin. günde 5 10 nM vinkristin ekleyin.
4. FACS analizi
   1. 7 günlük bir kültürden sonra ortam aspire ve iki kez 1 ml buz gibi soğuk PBS ile her bir yıkama. 3 ml / buz gibi soğuk PBS-EDTA (5 mM) da ekleyin. 200 ul pipet ucu alt kullanılarak kazıyarak Kuyunun dibinden jel ayırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe plakayı sallayın.
   2. steril 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın ve ic yavaşça tüpler sallayın30 dakika daha örn. homojen hücre süspansiyonu görünüm için kontrol edin. (Bu durumda değilse, o zaman daha uzun süre hücreleri sallamak ya da daha fazla PBS-EDTA ekleyin).
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin tüpler. PBS ile peletler daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yıkayın.
   4. PBS-FBS (% 4) ile yeniden süspanse edin ve PE-Cy7 ve APC konjüge anti-insan CD38 antikoru (5 ul / 10 ⁶ hücre) bağlı anti-insan CD19 antikoru ile etiket. 4 ^O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g sonra 500 ul PBS-FBS (% 4) santrifüj tüplerine ile yıkayınız. ticari kit kullanılarak Annexin V ve PI ile hücreleri tekrar süspansiyon.
   6. Şekil 4A yolluk strateji kullanarak akış sitometresinde analiz ve aşağıdaki optik yapılandırma: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm lazer: APC (BP 660/20). Renk karşılanmasını sağlamak.

Sonuçlar

, Beyaz bir halka tek-çekirdekli hücreleri temsil eder, trombositler ve plazma. Burada tarif edilen yoğunluk gradyan ayırma yöntemi CLL hasta kanından izole primer lösemik hücreler ve uyarılmamış nötrofiller Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru (yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemi sonrasında elde edilen farklı kan katmanları temsil içerir yoğunluk gradyan çözeltisi, granülositler ve eritrositler). Şekil 1B ve 1C, sırasıyla n...

Tartışmalar

yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır.

Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar ^11,12 kullanarak veya nötrofiller i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience