Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Résumé

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Résumé

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introduction

Les cellules immunitaires innées constituent une partie essentielle des cellules dans le microenvironnement de la tumeur et ont été associés à une tumeur maligne chez les patients et les modèles animaux de cancer ^1. Récemment, il est devenu plus largement apprécié que les réponses immunitaires chroniques jouent un rôle crucial dans la promotion de la progression tumorale, les métastases et la résistance aux chimiothérapies ^2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées importantes qui ont été montrés pour réguler directement la réponse des cellules tumorales à la chimiothérapie ^3,4. Cependant, le rôle des neutrophiles, des acteurs clés dans le système immunitaire inné, dans la régulation de la réponse tumorale au traitement anti-cancéreux est inconnue. Les objectifs de ces protocoles sont d'utiliser une méthode rapide et crédible pour séparer les neutrophiles provenant des échantillons de sang CLL du patient et de différencier les cellules HL60 le long de la voie granulocytaire afin d'étudier leur rôle dans la régulation de la sensibilité des cellules de lymphome à des agents anti-lymphome.

Les neutrophiles sont le composant cellulaire le plus abondant du système immunitaire inné dans le sang ⁵ et agir comme une première ligne de défense contre les micro - organismes envahisseurs ^6. Les neutrophiles ont un rôle essentiel dans la hausse des réponses immunitaires innées efficaces en plus de fonctions effectrices variables dans plusieurs états pathologiques ^7. Par conséquent, un procédé rapide et fiable pour isoler neutrophiles à partir d' autres cellules sanguines, telles que la méthode de séparation par gradient de densité, est nécessaire pour des études in vitro. L' utilisation de cette méthode pour l' isolement des cellules neutrophiles facilitera de nouvelles recherches sur les fonctions immunologiques à médiation par les neutrophiles in vivo et ex vivo.

La capacité d'obtenir des populations pures de neutrophiles est une première étape importante pour l'étude des patients atteints de maladies immunologiques ^8. Densité procédé de séparation par gradient est une technique idéale dans laquelle un rendement élevé de cellules est obtenue. La méthod comprend l'ajout d'une solution à gradient de densité dans le fond d'un tube contenant du sang humain dilué suivi par une centrifugation à 300 g pendant 35 min sans pause. L'anneau des cellules mononucléaires apparaît à l'interface et les neutrophiles réside en dessous de la première. Cette méthode possède des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes disponibles tels que des kits d'isolement neutrophiles qui sont beaucoup plus chers ^9. En outre, l'isolement des neutrophiles du sang humain par des kits commerciaux utilisant des anticorps dirigés contre un marqueur de surface spécifique pour les neutrophiles humains, augmentent le risque d'une activation ou la différenciation cellulaire. Densité procédé de séparation par gradient permet l'isolement des neutrophiles dans un court laps de temps. Dans le même temps, les cellules mononucléaires sont également séparés et récupérés. C'est une technique fondamentale dans laquelle un rendement élevé de cellules pur est obtenu afin d'obtenir l'intégrité fonctionnelle.

Afin d'imiter le microenv tumoralironnement, des expériences 3D ont été réalisées. Compte tenu de la courte demi-vie des neutrophiles in vitro, les expériences en 3D avec des neutrophiles humains fraîches ne sont pas concluants. Pour cette raison, promyélocytaire (HL60), les cellules sont amenées à se différencier en cellules neutrophiles-like en utilisant les inducteurs de différenciation diméthylsulfoxyde (DMSO) et de l'acide rétinoïque (RA). En utilisant des cellules HL60 différenciées (HL60 diff) permettra d' éviter d' avoir des réponses différentes de neutrophiles en raison de l' isolement de différents donateurs.

En 3D vitro des modèles de culture représentent une étape intermédiaire entre les modèles 2D in vitro et dans des modèles in vivo. Dans la culture 2D, les cellules réparties sur une surface plastique formant des pièces jointes de cellules anormales aux protéines déposées qui sont dénaturées sur cette surface synthétique. A l'inverse, les cellules en forme de culture 3D cellule-cellule naturelle jointes depuis les cellules et la matrice extracellulaire sont elles synthétisent le matériau naturel auquel ils sont attachés.Pour cette raison, les modèles de co-culture en 3D, en particulier entre les cellules cancéreuses et d'autres types de cellules, ont été très utiles pour indiquer leur contribution à la croissance tumorale, l'angiogenèse et les métastases. Par conséquent, les cultures 3D rendent la culture cellulaire miment les conditions physiologiques qui existent in vivo ^10.

Protocole

1. neutrophiles isolement et co-culture avec des cellules leucémiques primaires

NOTE: Les procédures ont été menées sous l'approbation du comité d'éthique de l'Hôpital Lyon avec tous les patients signent un consentement éclairé.

1. Isolement des cellules leucémiques primaires et neutrophiles
   1. Collecter des tubes de sang périphérique sur EDTA (1,8 mg EDTA par millilitre de sang) provenant de patients diagnostiqués avec la leucémie lymphocytaire chronique (CLL).
   2. Ajouter chaque 15 ml de sang dans un tube stérile de 50 ml et on dilue avec 15 ml de RPMI (dilution 1: 1), puis avec précaution et ajouter lentement 15 ml d'une solution à gradient de densité au fond du tube, sans mélanger les phases. Faire en sorte que la solution à gradient de densité à température ambiante pendant la préparation.
   3. Centrifuger à 300 xg pendant 35 min à température ambiante et sans frein. Le sang doit se séparer en quatre étapes distinctes comme représenté sur la figure 1A, de haut en bas: des plaquettes et du plasma, des cellules mononucléaires (white ring), solution de gradient de densité, granulocytes et érythrocytes.
   4. Collecter l'anneau blanc qui représente les cellules leucémiques primaires avec une pipette en plastique de Pasteur et le transfert à un nouveau tube de 50 ml.
      1. Remplir le tube avec du PBS (contenant du calcium et de magnésium) à 50 ml au total et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
      2. Remettre en suspension le culot avec 5 ml de PBS, puis ajouter du PBS à 50 ml au total et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
      3. Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine) pour compter en utilisant la viabilité cellulaire compteur.
   5. Aspirer les phases supérieures laissant le granulocytes et érythrocytes phase et ajouter PBS jusqu'à 25 ml puis ajouter 3% dextran dans 0,9% NaClup à 50 ml au total. Mélanger les tubes 10 fois et les garder pendant 30 min à température ambiante sans mélange.
   6. Collecter la partie supérieure RBC-couche pauvre de neutrophiles uneD les placer dans un tube de ml stérile 50 propre et centrifuger les tubes à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension chaque culot avec 5 ml de PBS, puis ajouter un tampon de lyse des globules rouges à 50 ml au total.
   7. Gardez les tubes dans l'obscurité pendant 15 min à température ambiante puis centrifuger à 500 g pendant 10 min à température ambiante. Laver les pastilles avec du PBS (PBS ajouter jusqu'à 50 ml au total) puis centrifuger à 500 g pendant 10 min à température ambiante.
   8. Resuspendre les pastilles avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre. Conserver 3 x 10 ⁵ de chaque type de cellule dans 50 ul de PBS-FBS (4%) dans des tubes de 5 ml en matière plastique pour déterminer la pureté de leur isolement par cytométrie de flux.
2. Analyser les apparences morphologiques des populations de cellules isolées
   1. Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10 ⁴ neutrophiles et 3 x 10 ⁴ cellules mononucléaires dans 150 pi de milieu RPMI complet. Assembler les lames de verre, les cartes de filtrage et de chambres d'échantillons dans la centrifugeuse Cytospin, assurant que til centrifuger est bien équilibrée.
   2. Placer chaque type de cellule dans la chambre d'échantillon et cyto-centrifugation à 750 g pendant 10 min à température ambiante Retirer les lames, les cartes de filtrage et de chambres d'échantillons de la centrifugeuse. Démonter avec soin, afin de ne pas endommager les cellules sur la lame. Jeter les cartes de filtre et chambres d'échantillon.
   3. Colorer les cellules en utilisant le kit de coloration Giemsa et de garder les lames pendant 1 heure à sécher. Examiner les cellules au microscope avec un grossissement de 100X.
3. Testez la pureté des cellules isolées par FACS
   1. Etiqueter les cellules leucémiques primaires isolées avec un anticorps anti-CD19 humain conjugué à APC (5 pi / 10 ⁶ cellules). Etiqueter les neutrophiles purifiés avec un mélange d'anticorps anti-humains énumérés dans le tableau 1 (5 pi / 10 ⁶ cellules). Incuber les cellules dans le noir pendant 30 min à 4 ^° C
   2. Laver les cellules avec 500 ul de PBS-FBS (4%) de la centrifugeuse les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Remettre en suspension chaque culot dans 200 pl de PBS-FBS (4%).
   4. Analyser un cytomètre de flux en utilisant la configuration optique suivante: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Veiller à la compensation de couleur.
4. Coculture de cellules leucémiques primaires avec autologue neutrophiles
   1. Semences 2 x 10 ⁵ cellules / ml de cellules leucémiques primaires seuls ou avec des neutrophiles autologues à 1:10 dans du milieu RPMI complet. Pour ce faire, d' ajuster le nombre de cellules par dilution de suspensions cellulaires et ajouter 2 x 10 ⁵ cellules / ml de cellules leucémiques primaires à 2 x 10 ⁶ cellules / ml neutrophiles. Mélanger soigneusement.
   2. Ajouter 25 pM de tyrosine-kinase (Btk) l'inhibiteur de Bruton (Ibrutinib) aux cellules. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
5. Cellule de récolte et d' analyse FACS
   1. Collect les cellules dans des tubes en plastique de 5 ml pour l'analyse FACS et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Laver les pellets avec 1 ml de PBS-FBS (4%) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
   2. pellets Resuspendre dans Annexin V et PI en utilisant le kit commercial et incuber les cellules dans le noir pendant 10 min à température ambiante. Analyser sur un cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 2A et la configuration optique suivant: laser 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Veiller à la compensation de couleur.

2. Différenciation des cellules HL60 le long de la granulocytaire Pathway et leur coculture avec des cellules RL lymphome B dans le modèle 3D

1. Différenciation des promyélocytaire humaine (HL60) cellules en cellules neutrophiles-like
   1. Ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10 ⁵ cellules / ml , puis ajouter 1 uM d' acide rétinoïque (RA) et 1,25% de DMSO pour induire leur différenciation. Seed chaque 3 x 10 ⁵ cellules HL60 par puits dans une plaque de 48 puits incuber ensuite pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   2. Ensuite, recueillir les cellules et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre.
   3. Diluer la suspension cellulaire dans un milieu RPMI complet pour ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10 ⁵ cellules / ml et induire leur différenciation à nouveau par addition de 1 uM d' acide rétinoïque (RA) et 1,25% de DMSO. Seed chaque 3 x 10 ⁵ HL60 cellules par puits dans une plaque de 48 puits et incuber pendant encore 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
2. Analyse de la différenciation des HL60 (HL60 diff)
   1. Recueillir les cellules et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Reprendre le culot avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre.
   2. Pour analyser les variations des marqueurs de surface cellulaire d'expression par cytométrie de flux. Placez chaque 3 x 10 ⁵ cellules non différenciées HL60 ( à partir de la culture cellulaire) et 3 x 10 ⁵ cellules HL60 diff dans des tubes en plastique de 5 ml pour l' analyse FACS et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Remettre en suspension les culots dans 50 ul de PBS-FBS (4%). Etiqueter les cellules avec CD11b anti-humain conjugué à AF700 ou CD38 anti-humain conjugué à APC (5 pi / 10 ⁶ cellules). Incuber les cellules dans le noir pendant 30 min à 4 ^° C
   4. Laver avec 500 pi de PBS-FBS (4%) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les granulés dans 200 ul de PBS-FBS (4%).
   5. Analyser le cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 3A et la configuration optique suivant: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Pour tester les changements morphologiques dans HL60 diff, immobiliser les cellules sur des lames de verre pour l' examen microscopique.
      1. Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10 ^{4 cellules non différenciées HL60 ( à partir de la culture cellulaire) et 3 x 10 4 HL60 diff dans 150 ul de milieu RPMI complet. Assembler les lames de verre, les cartes de filtrage et de chambres d'échantillons dans la centrifugeuse Cytospin, en veillant à ce que la centrifugeuse est équilibrée.}
      2. Placer chaque type de cellule dans la chambre d'échantillon et cyto-centrifugation à 1500 tpm pendant 10 min à température ambiante. Retirez les diapositives, cartes de filtre et chambres d'échantillons de la centrifugeuse. Démonter avec soin, afin de ne pas endommager les cellules sur la lame. Jeter les cartes de filtre et chambres d'échantillon.
      3. Colorer les cellules en utilisant le kit de coloration Giemsa et de garder les lames pendant 1 heure à sécher. Examiner les cellules au microscope avec un grossissement de 100X.
3. 3 dimensions (3D) Culture
   REMARQUE: Veiller à ce que les matériaux utilisés dans cette expérience sont froids et l'expérience se déroule sur la glace.
   1. Resuspendre chaque 5 x 10 ⁴ cellules RL, que ce soit seul ou mélangé avec HL60 diff Au rapport RL: HL60 diff 01h10, avec 300 ul matrice de membrane basale en utilisant 1 ml pointe de pipette coupé avec des ciseaux stériles afin d'élargir l'ouverture à environ 2 à 3 mm. Éviter les bulles lors de cette étape.
   2. Graine chaque 300 pi de suspension de cellules / puits dans une plaque de 24 puits. Éviter les bulles lors de cette étape. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C avec 5% de CO ₂ , puis ajouter 1 ml de milieu RPMI à chaque puits et laisser incuber pendant 7 jours à 37 ° C avec 5% de CO _2. Changer le milieu tous les deux jours. Ajouter 10 nM vincristine au jour 5.
4. Analyse FACS
   1. Après 7 jours de culture, aspirer le milieu et laver chaque puits avec 1 ml PBS glacé deux fois. Ajouter 3 ml / puits de PBS glacé-EDTA (5 mM). Détacher le gel à partir du fond du puits par grattage en utilisant la partie inférieure de la pointe de pipette de 200 pi. Agiter doucement la plaque sur la glace pendant 30 min.
   2. Transfert suspension cellulaire dans le tube de 15 ml stérile et agiter les tubes doucement sur ice pendant encore 30 min. Vérifiez l'apparence de la suspension cellulaire homogène. (Si ce n'est pas le cas, alors secouer les cellules pour plus de temps ou ajouter plus de PBS-EDTA).
   3. Centrifuger les tubes à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Laver les pastilles avec PBS puis centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
   4. Remettre en suspension avec du PBS-FBS (4%) et l' étiquette avec l' anticorps CD19 anti-humain conjugué à la PE-Cy7 , et un anticorps anti-CD38 humain conjugué à APC (5 pl / 10 ⁶ cellules). Incuber dans l' obscurité pendant 30 min à 4 ^° C
   5. Laver avec 500 pi de PBS-FBS (4%), puis Tubes centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules avec Annexin V et PI en utilisant un kit commercial.
   6. Analyser le cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 4A et la configuration optique suivant: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Veiller à la compensation de couleur.

Résultats

Densité procédé de séparation par gradient décrite ici fournit des cellules leucémiques primaires et des neutrophiles non stimulés isolés à partir du sang des patients atteints de LLC La figure 1A représente les différentes couches de sang obtenus après gradient de densité de centrifugation (de haut en bas. Plaquettes et de plasma, cercle blanc représente les cellules mononucléaires, solution à gradient de densité, les granulocytes et les globules rouges...

Discussion

Décrite ici, un protocole efficace, simple, rapide et peu coûteux pour l'isolement des neutrophiles du sang humain avec une grande pureté en utilisant un gradient de densité approche de centrifugation et dans les mêmes cellules étape mononucléaires sont également séparés et valorisés. Les populations de cellules isolées sont ≥90% pur.

Plusieurs méthodes sont disponibles pour l'isolement des cellules neutrophiles du sang humain. Ceux - ci comprennent des procédés simi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience