호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

요약

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

초록

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

서문

선천성 면역 세포는 종양 미세 환경 내에서 세포의 중요한 비율을 구성하는 환자, 암 ^(1)의 동물 모델에서 종양의 암과 연관되어왔다. 최근에,보다 널리 만성 면역 반응은 화학 요법에 대한 ^종양이 진행, 전이 저항 증진에 중요한 역할을하는 것으로 인식되고있다. 식세포 직접 화학 요법에 ^3,4- 종양 세포 반응을 조절하는 것으로 나타났다 중요한 선천성 면역 세포이다. 그러나 항암 치료에 대한 종양 반응을 조절하는 호중구의 선천 면역 키 선수의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 프로토콜의 목적은 CLL 환자의 혈액 샘플로부터의 호중구를 분리하는 빠르고 신뢰할만한 방법을 사용하여 안티 림프종 에이전트 림프종 세포의 민감도를 조절하는 역할을 연구하기 위하여 과립 통로 따라 HL60 세포를 구별한다.

호중구는 미생물 ^{6 침입에} 대한 방어의 첫 번째 줄 혈액 ⁽⁵⁾ 행동의 선천성 면역 시스템의 가장 풍부한 세포의 구성 요소입니다. 호중구 여러 병리 적 상태 ^(7)에 가변 이펙터 기능 이외에 유효 선천성 면역 반응을 상승에 필수적인 역할을한다. 따라서, 이러한 농도 구배 분리법과 같은 다른 혈액 세포에서 호중구를 분리하는 빠르고 신뢰할만한 방법은 시험 관내 연구에 필요하다. 호중구 격리를 위해이 방법을 사용하면 생체 내 및 생체에서 호중구 매개 면역 기능에 대한 추가 연구를 촉진 할 것이다.

호중구 순수한 집단을 수득하는 능력은 면역 학적 질환 환자의 ^팔 조사 중요한 첫 단계이다. 밀도 구배 분리 방법은 세포의 높은 수율을 수득하는 이상적인 방법이다. 운전 방식D는 쉬지 않고 35 분 동안 300g으로 원심 분리 한 다음 희석 된 인간 혈액을 함유하는 튜브의 바닥에서 밀도 구배 용액의 첨가를 포함한다. 단핵 세포의 링 인터페이스에 표시하고, 호중구 전 이하 상주. 이 방법은 훨씬 더 ⁹ 비싼 호중구 분리 키트로 사용 가능한 다른 방법에 대한 상당한 이점이있다. 또한, 인간의 호중구에 대한 특정 표면 마커에 관한 항체를 사용하여 상업용 키트에 의해 인간 혈액으로부터 분리 호중구 세포 활성화 또는 분화의 위험을 증가시킨다. 밀도 구배 분리 방법은 단시간 호중구의 분리를 허용한다. 동일 단계 내에서 단핵 세포는 분리 회수된다. 순수한 세포의 높은 수율 무결성 기능을 달성하기 위해 수득되는 기본 기술이다.

종양 microenv을 모방하기 위해ironment, 3 차원 실험을 수행 하였다. 체외에서 호중구의 짧은 반감기를 고려할 때, 신선한 인간의 호중구와 3D 실험은 결정적인 없습니다. 이런 이유로, 전 골수성 (HL60) 세포 분화 유도제 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 및 레티노 산 (RA)를 사용하여 호중구와 같은 세포로 분화 유도된다. 차별화 된 HL60 세포 (HL60은 diff)를 사용하여 인해 다른 기증자로부터 격리에 호중구의 다른 응답을 갖는 것을 방지 할 수 있습니다.

체외 차원에서 문화 모델은 체외 2D 모델 사이의 생체 내 모델에서 중간 단계를 나타냅니다. 2D 문화에서, 세포는이 합성 표면에 변성되어 퇴적 단백질에 자연스러운 세포의 첨부 파일을 형성하는 플라스틱 표면에 확산. 반대로, 세포가 세포 외 기질의 합성 보낸 3D 배양 형태 천연 세포 - 세포 부착에 세포는 이들이 결합되어있는 천연 물질이다.이러한 이유로, 특히 암 세포 및 다른 세포 유형 간의 3D 공동 배양 모델은 종양 성장, 혈관 신생 및 전이에 대한 기여를 나타내는 매우 유용한왔다. 결과적으로, 3 차원 배양은 세포 배양 물이 생체 내 ^(10)에 존재하는 생리적 조건을 모방 할.

프로토콜

기본 백혈병 세포 1. 호중구의 분리 및 공동 문화

참고 : 절차는 동의서에 서명 모든 환자와 리옹 병원 윤리위원회의 승인하에 실시 하였다.

1. 기본 백혈병 세포 및 호중구의 분리
   1. 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)으로 진단 된 환자에서 EDTA (혈액의 밀리리터 당 1.8 mg을 EDTA)에 말초 혈액의 튜브를 수집합니다.
   2. 멸균 50 ㎖ 튜브에 혈액을 각각 15 ㎖에 첨가하고 15 ml의 RPMI로 희석 하였다 (희석 1 : 1)로 조심스럽게 천천히 위상 혼합없이 상기 튜브의 하단에 밀도 구배 용액의 15 mL로 추가한다. 밀도 구배 용액을 제조 RT에있을 수 있도록한다.
   3. RT에서 브레이크없이 35 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 그림 1A, 위에서 아래와 같이 피가 네 가지 단계로 구분한다 : 혈소판과 혈장, 단핵 세포 (w하이트 링) 밀도 구배 용액 과립구 및 적혈구.
   4. 새로운 50 ML 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전송에 기본 백혈병 세포를 나타내는 흰색 반지를 수집합니다.
      1. PBS로 튜브를 실온에서 10 분 동안 300g에 총과 원심 분리기에 50 ㎖까지 (칼슘과 마그네슘을 포함)를 입력합니다.
      2. 5 PBS 후 RT에서 10 분 동안 300g로 원심 분리하고 총 50 ㎖의 PBS까지 추가 ml로 펠렛을 재현 탁.
      3. 완전한 RPMI 배지로 펠렛을 재현 탁 (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 글루타민, 100 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신) 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트.
   5. 대기음는 상위 단계 과립구와 적혈구 위상을 떠나 25 ml의 최대 PBS를 추가는 총 50ml로 0.9 % NaClup에 3 % 덱스 트란을 추가합니다. 튜브 10 번을 혼합하고 혼합하지 않고 실온에서 30 분 동안 보관하십시오.
   6. 상단 RBC 부족한 호중구 층를 수집깨끗한 멸균 50 ㎖ 튜브로 배치하고 RT에서 10 분 동안 300g로 원심 분리 튜브 거라고. PBS 후 총 50 ㎖까지 적혈구 용해 완충액을 추가 5 ㎖ 각 펠렛을 재현 탁.
   7. RT 후 RT에서 10 분 동안 500g으로 원심 분리기에서 15 분 동안 어두운 데에서 튜브를 유지한다. PBS로 알약을 (총 50 ㎖까지 PBS를 추가) 다음 실온에서 10 분간 500 g에서 원심 분리 세척 할 것.
   8. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지 펠렛을 재현 탁. 유세포 사용하여 분리의 순도를 결정하기 위해 5 ㎖ 플라스틱 튜브에 50 ㎕의 PBS-FBS (4 %)에서 각 세포 유형의 3 × ^105을 유지한다.
2. 분리 된 세포 집단의 형태 학적 출연 분석
   1. 이를 위해, 각각 3 × ¹⁰⁴ 호중구 150 μL 완전 RPMI 배지에서 3 × ¹⁰⁴ 단핵 세포를 재현 탁. 즉 t을 보장 cytospin 원심 분리기에서 유리 슬라이드 필터 카드 및 샘플 챔버를 조립그는 원심 분리기는 균형이다.
   2. 원심 분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 실을 제거 실온에서 10 분 동안 750 XG에서 샘플 챔버 및 사이토 원심 분리기로 각 셀 유형을 놓습니다. 슬라이드의 세포를 손상시키지 않도록 신중하게 분해한다. 필터 카드 및 샘플 챔버를 폐기하십시오.
   3. 김사 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 1 시간 건조 할 슬라이드를 유지합니다. 100X 배율 현미경으로 세포를 검사합니다.
3. FACS에 의해 고립 된 세포의 순도 테스트
   1. APC에 접합 된 항 - 인간 CD19 항체 (5 μL / 10 ⁶ 세포)와 격리 된 차 백혈병 세포를 레이블. 표 1 (5 μL / 10 ⁶ 세포)에 나열된 항 인간 항체의 혼합물로 정제 된 호중구 레이블. 4 ^O ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 세포를 부화
   2. 500 ㎕의 PBS-FBS (4 %) RT에서 5 분 동안 300g의 튜브를 원심 분리기로 세포를 씻으십시오.
   3. 200 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 각 펠렛을 재현 탁.
   4. , SSC-A (488 /이 10bp), FITC (BP 530/30)를 PerCP-Cy5.5 (40분의 695 BP FSC-A (488 nm의) : 488 nm의 레이저 : 다음 광학 구성을 사용하여 사이토 흐름 분석 ), PE (BP를 575/26); 633 nm의 레이저 : APC (BP를 660/20), APC-Cy7 (BP를 780/60). 색 보정을 확인합니다.
4. 자가 호중구와 차 백혈병 세포의 공 배양
   1. 시드 차 백혈병 세포 단독으로 또는 완전 RPMI 배지에서 비 1:10자가 호중구로 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ml. 이렇게 희석하여 세포 현탁액을 세포 수를 조절하고 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml로 호중구 주 백혈병 세포를 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ㎖를 추가한다. 조심스럽게 섞는다.
   2. 세포에의 Bruton의 티로신 키나제 (BTK) 억제제 (ibrutinib)의 25 μM을 추가합니다. 5 % CO _2와 37 ° C에서 24 시간 동안 품어.
5. 세포 수확 및 FACS 분석
   1. 콜요법 FACS 분석 및 원심 분리기 RT에서 5 분 동안 300g의 튜브 5 ML의 플라스틱 튜브에 세포. 다음 실온에서 5 분간 300 g에서 원심 분리기 1 ml의 PBS-FBS (4 %)와 펠렛을 씻으십시오.
   2. 상업 키트를 사용하여 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 세포를 배양 재현 탁의 넥신 V의 펠렛 및 PI. (FSC-A (488 ㎚), SSC-A (488 /이 10bp), FITC는 (BP 530/30), PI 610 : 488 nm의 레이저 :도 2A의 게이트 전략을 사용하여 유세포과 같은 광학 구성에 분석 / 20 BP). 색 보정을 확인합니다.

과립 통로 및 3D 모델에서 RL 림프종 B 세포와의 공동 배양을 따라 HL60 세포의 분화 (2)

1. 호중구와 같은 세포로 인간 전 골수성 (HL60) 세포의 분화
   1. / ㎖가 그들의 분화를 유도하기 위해 1 μm의 레티노 산 (RA) 및 1.25 %의 DMSO를 추가 3 × 10 ⁵ 세포에 HL60 세포 수를 조정합니다. 각 3 × 10 ^{5 종자} 도 48 웰 플레이트 당 HL60 세포는 5 % CO _2, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다.
   2. 그 후, 실온에서 5 분 300g에 세포와 원심 분리기를 수집합니다. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지로 세포를 재현 탁.
   3. 이어서 용액 3 × ¹⁰⁵ 세포 /으로 HL60 세포의 수를 조정하고 1 μM 레티노 산 (RA) 및 1.25 % DMSO를 첨가하여 다시 분화를 유도하는 완전 RPMI 배지에서 세포 현탁액을 희석. 당 잘 48 웰 플레이트에 각 3 × 10 ⁵ HL60 세포를 종자와 5 % CO _2와 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 배양한다.
2. HL60 분화 분석 (HL60의 차이)
   1. 세포를 수집하고 RT에서 5 분 동안 300g로 원심 분리 튜브. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지 펠렛을 재현 탁.
   2. 유동 세포 계측법에 의한 세포 표면 마커의 발현에서의 변화를 분석. 각 3 × 10 ^(5)를 배치 미분화 (세포 배양에서) HL60 세포와 FACS 분석 및 원심 분리기 RT에서 5 분 동안 300g의 튜브 5 ML의 플라스틱 튜브에 3 × 10 ⁵ HL60은 diff 세포.
   3. 50 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 펠렛을 재현 탁. AF700 또는 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38 (5 μL / 10 ⁶ 세포)에 접합 된 항 - 인간 CD11b를 가진 세포를 레이블. 4 ^O ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 세포를 부화
   4. 다음 실온에서 5 분 300g에 원심 분리기 500 μl의 PBS-FBS (4 %)로 세척. 200 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 펠렛을 재현 탁.
   5. 488 nm의 레이저 :도 3A의 게이팅 전략과 같은 광학 구성을 이용하여 유동 세포 계측기에 분석 FSC-A (488 나노 미터), SSC-A (488 /이 10bp); 633 nm의 레이저 : APC (660/20 BP), 알렉사 플 루어 700 (BP를 730/45).
   6. HL60은 diff의 형태 학적 변화를 테스트하려면, 현미경 검사 용 유리 슬라이드에 세포를 고정.
      1. 이렇게하려면 각 3 × 10을 재현 탁 4 미분화 HL60 세포 150 μl를 완전 RPMI 배지에서 3 × 10 ⁴ HL60은 diff. 원심 균형 것을 보장 cytospin 원심 분리기에서 유리 슬라이드 필터 카드 및 샘플 챔버를 조립한다.
      2. 실온에서 10 분 동안 1,500 rpm으로 샘플 챔버 및 사이토 원심 분리기로 각 셀 유형을 놓습니다. 원심 분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 실을 제거합니다. 슬라이드의 세포를 손상시키지 않도록 신중하게 분해한다. 필터 카드 및 샘플 챔버를 폐기하십시오.
      3. 김사 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 1 시간 건조 할 슬라이드를 유지합니다. 100X 배율 현미경으로 세포를 검사합니다.
3. 3 차원 (3D) 문화
   주 :이 실험에 사용 된 물질은 저온이며 실험 얼음 일어나고 있는지 확인.
   1. 단독으로 또는 HL60은 diff와 혼합하거나, 각 5 × 10 ⁴ RL 세포를 재현 탁 비 RL에서 : HL60의 DIFF 1:10 약 2 내지 3 mm의 개구부를 넓게하기 위해 멸균 가위로 절단 한 ml의 피펫 팁을 사용하여 300 ㎕의 기저막 매트릭스. 이 단계에서 거품을 피하십시오.
   2. 24 웰 플레이트에 잘 / 세포 현탁액 각각 300 μl를 시드. 이 단계에서 거품을 피하십시오. 그 다음 각 웰에 대해 RPMI 배지를 완료하고, 5 % CO _2, 37 ℃에서 7 일간 배양한다 ㎖로 1을 추가 5 % CO _2, 37 ℃에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다. 매 2 일 매체를 변경합니다. 하루 5에서 10 나노 빈 크리스틴을 추가합니다.
4. FACS 분석
   1. 문화 7 일 후, 매체를 대기음 두 번 1 ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 웰을 씻는다. 3 ㎖ / 얼음처럼 차가운 PBS-EDTA (5 mM)을 잘을 추가합니다. 200 μL 피펫 팁의 바닥을 이용하여 긁어 웰의 바닥에서 겔을 분리. 30 분 동안 얼음에 부드럽게 판을 흔들어.
   2. 멸균 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 IC에 부드럽게 튜브를 흔들또 다른 30 ​​분 동안 전자. 균일 한 세포 현탁액의 모양을 확인합니다. (이 경우가 아니라면, 다음 긴 시간 동안 세포를 흔들 이상의 PBS-EDTA 추가).
   3. RT에서 10 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리기. PBS로 펠릿 후 RT에서 10 분 동안 300 × g으로 원심 분리로 세척 하였다.
   4. PBS-FBS (4 %)으로 재현 탁 및 PE Cy7하고 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38 항체 (5 μL / 10 ¹⁰⁶ 세포)를 접합 항 - 인간 CD19 항체 레이블. 4 ^오 ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 품어
   5. 실온에서 5 분 동안 300g에 500 ㎕의 PBS-FBS (4 %) 원심 분리기 튜브로 씻으십시오. 상업용 키트를 사용하여 아 넥신 V 및 PI로 세포를 재현 탁.
   6. 도 4a의 게이팅 전략을 사용 사이토 흐름을 분석하고 다음 광학 구성 : 488 nm의 레이저 : FSC-A (488 ㎚), SSC-A (488 /이 10bp), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm의 레이저 : APC (BP를 660/20). 색 보정을 확인합니다.

결과

흰색 환 단핵 세포이고, 혈소판 혈장 :. 여기에 설명 된 농도 구배 분리법은 CLL 환자의 혈액에서 분리 된 일차 백혈병 세포 및 자극되지 호중구도 1a는 위에서 아래로 (밀도 구배 원심 분리 후의 다른 혈액 층을 나타낸다 제공 밀도 구배 용액, 과립구 및 적혈구).도 1b 및 1c는 각각 호중구 (멀티 로브 핵 세포)와 단핵 세포의 형태 학적 외관의 차이를 ?...

토론

밀도 구배 원심 분리 방법을 이용하여 고순도의 인간 혈액 호중구의 분리를 위해 동일한 단계 단핵 세포 내에서, 여기에 효과적인 간단한 빠르고 저렴 프로토콜 설명도 분리 회수된다. 분리 된 세포 집단은 ≥90 % 순수 있습니다.

여러 가지 방법 인간의 혈액에서 호중구의 분리에 사용할 수 있습니다. 이러한 불연속 그라디언트 ^{(11, 12)를} 사용하거나 호중구는 면역 자?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience