Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Resumen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Resumen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introducción

Células inmunes innatas constituyen una proporción esencial de las células dentro del microambiente del tumor y se han asociado con la malignidad del tumor en pacientes y modelos animales de cáncer ^1. Recientemente, se ha vuelto más ampliamente apreciado que las respuestas inmunes crónicas desempeñan papeles críticos en la promoción de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a quimioterapias ^2. Los macrófagos son importantes células inmunitarias innatas que se han demostrado para regular directamente la respuesta de las células tumorales a la quimioterapia ^3,4. Sin embargo, el papel de los neutrófilos, los actores clave en el sistema inmunitario innato, en la regulación de la respuesta del tumor al tratamiento contra el cáncer no se conoce. Los objetivos de estos protocolos son el uso de un método rápido y fiable para separar los neutrófilos de muestras de sangre CLL del paciente y para diferenciar las células HL60 a lo largo de la vía granulocítica con el fin de estudiar su papel en la regulación de la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes anti-linfoma.

Los neutrófilos son el componente celular más abundante del sistema inmune innato en la sangre ⁵ y actuar como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores ^6. Los neutrófilos tienen un papel esencial en el aumento de la respuesta inmune innata eficaces, además de las funciones efectoras variables en varias condiciones patológicas ^7. Por lo tanto, un método rápido y fiable para aislar los neutrófilos de otras células sanguíneas, tales como método de separación en gradiente de densidad, se requiere para los estudios in vitro. El uso de este método para el aislamiento de neutrófilos facilitará aún más la investigación sobre las funciones inmunológicas mediada por neutrófilos in vivo y ex vivo.

La capacidad de obtener poblaciones puras de los neutrófilos es un primer paso importante para la investigación de los pacientes con enfermedades inmunológicas ^8. método de separación en gradiente de densidad es una técnica ideal en el que se obtiene un alto rendimiento de las células. el method implica la adición de la solución de gradiente de densidad en la parte inferior de un tubo que contiene la sangre humana diluido seguido de centrifugación a 300 g durante 35 min sin descanso. El anillo de las células mononucleares aparece en la interfase y los neutrófilos residen por debajo de la primera. Este método tiene ventajas significativas con respecto a otros métodos disponibles, tales como kits de aislamiento de neutrófilos, que son mucho más caros ^9. Además, el aislamiento de los neutrófilos de sangre humana por kits comerciales que utilizan anticuerpos dirigidos a un marcador de superficie específico para los neutrófilos humanos, aumentar el riesgo de activación o diferenciación celular. método de separación en gradiente de densidad permite el aislamiento de neutrófilos dentro de un corto período de tiempo. Dentro del mismo paso, también se separan y se recuperan las células mononucleares. Es una técnica fundamental en la que se obtiene un alto rendimiento de células puras a fin de lograr la integridad funcional.

Con el fin de imitar la microenv tumorironment, se realizaron experimentos en 3D. Dada la corta vida media de los neutrófilos in vitro, los experimentos en 3D con los neutrófilos humanos frescos no son concluyentes. Por esta razón, se inducen las células HL60 promielocítica () para diferenciarse en células de neutrófilos como el uso de los inductores de la diferenciación dimetilsulfóxido (DMSO) y el ácido retinoico (RA). El uso de células HL60 diferenciadas (HL60) diff evitará tener diferentes respuestas de los neutrófilos debido al aislamiento de diferentes donantes.

En 3D vitro modelos de cultivo representan una etapa intermedia entre modelos 2D in vitro y en modelos in vivo. En la cultura 2D, las células se extienden sobre una superficie de plástico que forma los archivos adjuntos de células no naturales a las proteínas depositadas que se desnaturalizan en esta superficie sintética. Por el contrario, las células en forma de cultivo 3D adjuntos célula-célula natural, ya que las células y la matriz extracelular que sintetizan son el material natural a los que están unidos.Por esta razón, los modelos 3D de co-cultivo, especialmente entre las células cancerosas y otros tipos de células, han sido muy útiles para indicar su contribución al crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis. Como resultado, los cultivos 3D hacen que el cultivo de células de imitar las condiciones fisiológicas que existen in vivo ^10.

Protocolo

1. Aislamiento de neutrófilos y co-cultivo con células leucémicas primarias

NOTA: Los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Lyon con todos los pacientes que firman el consentimiento informado.

1. El aislamiento de las células leucémicas primarias y neutrófilos
   1. Recoger tubos de sangre periférica en EDTA (1,8 mg EDTA por mililitro de sangre) de los pacientes diagnosticados con leucemia linfocítica crónica (CLL).
   2. Añadir cada 15 ml de sangre a un tubo estéril de 50 ml y se diluye con 15 ml de RPMI (dilución 1: 1), luego, con cuidado y se añade lentamente 15 ml de una solución de gradiente de densidad para la parte inferior del tubo sin mezclar las fases. Asegúrese de que la solución de gradiente de densidad es a TA durante la preparación.
   3. Centrifugar a 300 xg durante 35 min a TA y sin freno. La sangre se debe separar en cuatro fases distintas, como se muestra en la Figura 1A, de arriba abajo: las plaquetas y el plasma, las células mononucleares (wanillo hite), solución de gradiente de densidad, los granulocitos y eritrocitos.
   4. Recuperar el anillo blanco que representa las células leucémicas primarias con una pipeta de plástico Pasteur y traslado a un nuevo tubo de 50 ml.
      1. Llenar el tubo con PBS (contiene calcio y magnesio) hasta 50 ml en total y se centrifuga a 300 g durante 10 min a TA.
      2. Resuspender el precipitado con 5 ml de PBS y luego añadir PBS hasta 50 ml en total y se centrifuga a 300 g durante 10 min a TA.
      3. Resuspender el precipitado con medio completo RPMI (RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) para contar usando un contador de la viabilidad celular.
   5. Aspirar las fases superiores que salen de la fase de granulocitos y eritrocitos y añadir PBS hasta 25 ml, añadir 3% de dextrano en el 0,9% NaClup a 50 ml en total. Mezclar los tubos 10 veces y conservar durante 30 min a TA sin mezclar.
   6. Recoger el RBC-pobres una capa superior de neutrófilosd colocarlos en un tubo estéril de 50 ml limpio y centrifugar los tubos a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspender cada sedimento con 5 ml de PBS a continuación, añadir tampón de lisis de glóbulos rojos de hasta 50 ml en total.
   7. Mantener los tubos en la oscuridad durante 15 min a RT y centrifugar a 500 g durante 10 min a TA. Lavar los pellets con PBS (PBS añadir hasta 50 ml en total) y centrifugar a 500 g durante 10 min a TA.
   8. Resuspender los pellets con medio RPMI completo para el recuento usando un contador de la viabilidad celular. Mantenga 3 x 10 ⁵ de cada tipo de células en 50 l de PBS-FBS (4%) en 5 ml de tubos de plástico para determinar la pureza de su aislamiento mediante citometría de flujo.
2. Analizar las apariencias morfológicas de las poblaciones de células aisladas
   1. Para ello, resuspender cada 3 x 10 ⁴ neutrófilos y 3 x 10 ⁴ células mononucleares en 150 l de medio completo RPMI. Montar las placas de vidrio, tarjetas de filtros y cámaras de muestra en la centrífuga cytospin, asegurando que tque centrifugar está bien equilibrado.
   2. Colocar cada tipo de células en la cámara de muestra y cito-centrifugar a 750 xg durante 10 min a TA Eliminar las diapositivas, tarjetas de filtro, y cámaras de muestra de la centrífuga. Desmontar con cuidado, para no dañar las células en el portaobjetos. Descartar cartas de filtro y cámaras de muestra.
   3. Teñir las células utilizando kit de tinción de Giemsa y mantener las diapositivas durante 1 hora para secar. Se examinan las células al microscopio con un aumento de 100X.
3. Prueba de la pureza de las células aisladas por FACS
   1. Identificar a las células leucémicas primarias aisladas con el anticuerpo CD19 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 ⁶ células). Etiquetar los neutrófilos purificados con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que se enumeran en la Tabla 1 (5 l / 10 ⁶ células). Se incuban las células en la oscuridad durante 30 min a 4 ^° C
   2. Se lavan las células con 500 l de PBS-FBS (4%) de la centrífuga los tubos a 300 g durante 5 min a TA.
   3. Resuspender cada sedimento en 200 l de PBS-FBS (4%).
   4. El análisis en un citómetro de flujo utilizando la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (BP 695/40 ), PE (BP 575/26); 633 nm láser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Garantizar la compensación de color.
4. Co-cultivo de las células leucémicas primarias con autólogo de neutrófilos
   1. Seed 2 x 10 ⁵ células / ml de células leucémicas primarias solo o con neutrófilos autólogas en relación 1:10 en medio completo RPMI. Para ello, puede ajustar el número de células por dilución de las suspensiones de células y añadir 2 x 10 ⁵ células / ml de células leucémicas primarias de 2 x 10 ⁶ células / ml neutrófilos. Mezclar con cuidado.
   2. Añadir 25 M de inhibidor de tirosina quinasa de Bruton (Btk) (ibrutinib) a las células. Incubar durante 24 horas a 37 ° C con 5% de _CO2.
5. Cell Cosecha y Análisis FACS
   1. Collect las células en tubos de plástico de 5 ml para análisis FACS y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. Lavar los pellets con 1 ml de PBS-FBS (4%) y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA.
   2. pellets de resuspender en Anexina V y PI utilizando kit comercial e incubar las células en oscuridad durante 10 min a TA. El análisis en un citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 2A y la siguiente configuración óptica: láser de 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Garantizar la compensación de color.

2. La diferenciación de células HL60 a lo largo del Camino granulocítica y su Coculture con RL linfoma de células B en modelo 3D

1. La diferenciación de promielocítica humana (HL60) células en células similares a los neutrófilos
   1. Ajustar el número de células HL60 a 3 x 10 ⁵ células / ml a continuación, añadir 1 M de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO para inducir su diferenciación. Semillas cada 3 x 10 ⁵ células HL60 por pocillo en placas de 48 pocillos a continuación se incuban durante 48 horas a 37 ° C con 5% de _CO2.
   2. Más tarde, recoger las células y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender las células con medio RPMI completo para el recuento usando un contador de la viabilidad celular.
   3. A continuación diluir la suspensión de células en medio RPMI completo para ajustar el número de células HL60 a 3 x 10 ⁵ células / ml y de nuevo inducir su diferenciación mediante la adición de 1 M de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO. Semillas cada 3 x 10 ⁵ HL60 células por pocillo en placa de 48 pocillos y se incuba durante otras 48 horas a 37 ° C con 5% de CO _2.
2. Análisis de la diferenciación de HL60 (HL60 diff)
   1. Recoger las células y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado con medio completo RPMI para el recuento usando un contador de la viabilidad celular.
   2. Para analizar los cambios en la expresión de marcadores de la superficie celular por citometría de flujo. Coloque cada 3 x 10 ⁵ células indiferenciadas HL60 (de cultivo celular) y 3 x 10 ⁵ células HL60 diff en tubos de plástico de 5 ml para análisis FACS y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA.
   3. Resuspender los sedimentos en 50 l de PBS-FBS (4%). Marcar las células con CD11b anti-humano conjugado con AF700 o CD38 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 ⁶ células). Se incuban las células en la oscuridad durante 30 min a 4 ^° C
   4. Lavar con 500 l de PBS-FBS (4%) y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender los sedimentos en 200 l de PBS-FBS (4%).
   5. Analizar el citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 3A y la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm láser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Para probar los cambios morfológicos en diff HL60, inmovilizar las células en portaobjetos de vidrio para el examen microscópico.
      1. Para ello, resuspender cada 3 x 10 ^{4 células indiferenciadas HL60 (de cultivo celular) y 3 x 10 4 HL60 diff en 150 l de medio completo RPMI. Montar las placas de vidrio, tarjetas de filtro, y cámaras de muestra en la centrífuga cytospin, asegurándose de que la centrífuga está equilibrado.}
      2. Colocar cada tipo de células en la cámara de muestra y cito-centrifugar a 1500 rpm durante 10 min a TA. Retire las transparencias, tarjetas de filtros y cámaras de muestras de la centrífuga. Desmontar con cuidado, para no dañar las células en el portaobjetos. Descartar cartas de filtro y cámaras de muestra.
      3. Teñir las células utilizando kit de tinción de Giemsa y mantener las diapositivas durante 1 hora para secar. Se examinan las células al microscopio con un aumento de 100X.
3. 3 dimensiones (3D) Cultura
   NOTA: Asegúrese de que los materiales utilizados en este experimento son fríos y el experimento se está llevando a cabo en el hielo.
   1. Resuspender cada 5 x 10 ⁴ células RL, ya sea solo o mezclado con diff HL60 En relación RL: HL60 diff 01:10, con 300 l de la matriz de la membrana basal usando punta de la pipeta 1 ml cortar con una tijera estéril con el fin de ensanchar la abertura a aproximadamente 2 a 3 mm. Evitar las burbujas durante este paso.
   2. Sembrar cada 300 l de suspensión de células / pocillo en placas de 24 pocillos. Evitar las burbujas durante este paso. Incubar la placa durante 30 min a 37 ° C con 5% de CO ₂ a continuación, añadir 1 ml de medio completo RPMI para cada pocillo e incubar durante 7 días a 37 ° C con 5% de CO _2. Cambiar el medio cada dos días. Añadir 10 nM vincristina en el día 5.
4. Análisis FACS
   1. Después de 7 días de cultivo, se aspira el medio y lavar cada pocillo con 1 ml de PBS enfriado con hielo dos veces. Añadir 3 ml / pocillo de PBS enfriado en hielo-EDTA (5 mM). Separar el gel de la parte inferior del pozo por raspado utilizando la parte inferior de la punta de pipeta 200 l. Agitar suavemente la placa sobre hielo durante 30 min.
   2. Transferir la suspensión celular en un tubo estéril de 15 ml y agitar los tubos suavemente sobre ice durante otros 30 min. Comprobar la aparición de suspensión celular homogénea. (Si no es el caso, entonces agitar las células durante más tiempo o añadir más PBS-EDTA).
   3. Centrifugar los tubos a 300 xg durante 10 min a TA. Se lavan los gránulos con PBS y centrifugar a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   4. Resuspender con PBS-FBS (4%) y la etiqueta con el anticuerpo CD19 anti-humano conjugado con PE-Cy7 y el anticuerpo CD38 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 ⁶ células). Incubar en oscuridad durante 30 min a 4 ^° C.
   5. Lavar con 500 l de PBS-FBS (4%), entonces los tubos de centrífuga a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender las células con anexina V y PI utilizando el kit comercial.
   6. Analizar el citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 4A y la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm láser: APC (660/20 BP). Garantizar la compensación de color.

Resultados

Método de separación en gradiente de densidad descrito aquí proporciona células leucémicas primarias y neutrófilos no estimulados aisladas de la sangre de pacientes con LLC Figura 1A representa las diferentes capas de la sangre obtenidos después de centrifugación en gradiente de densidad (de arriba a abajo:. Plaquetas y plasma, anillo blanco representa las células mononucleares, gradiente de densidad de la solución, granulocitos y eritrocitos). Figura 1...

Discusión

Se describe aquí, un protocolo eficaz, sencillo, rápido y de bajo costo para el aislamiento de los neutrófilos de la sangre humana con alta pureza utilizando el enfoque de la centrifugación en gradiente de densidad y dentro de las mismas células mononucleares de paso también se separan y se recupera. Las poblaciones de células aisladas son ≥90% de pureza.

Hay varios métodos disponibles para el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana. Estos incluyen métodos similares utiliz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience