Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Resumo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Resumo

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introdução

Células imunitárias inatas constituem uma proporção essencial das células dentro do microambiente do tumor e têm sido associados com a malignidade de tumores em pacientes e de modelos animais de cancro ^1. Recentemente, tornou-se mais amplamente apreciado que as respostas imunitárias crónicas desempenham papéis críticos na promoção da progressão do tumor, metástase e resistência às quimioterapias ^2. Os macrófagos são células imunes inatos importantes que foram mostrados para regular directamente a resposta das células de tumor à quimioterapia ^3,4. No entanto, o papel dos neutrófilos, os principais intervenientes no sistema imunitário inato, na regulação da resposta do tumor ao tratamento anti-cancro não é conhecido. Os objectivos destes protocolos são a utilização de um método rápido e credível para separar os neutrófilos a partir de amostras de sangue CLL do paciente e para diferenciar células HL60 ao longo da via granulocitica, a fim de estudar o seu papel na regulação da sensibilidade de células de linfoma de agentes anti-linfoma.

Os neutrófilos são o componente celular mais abundante do sistema imune inato no sangue ⁵ e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores ^6. Os neutrófilos têm um papel essencial no aumento de respostas imunes inatas eficazes para além das funções efectoras variáveis ​​em várias condições patológicas ^7. Por conseguinte, um método rápido e credível para isolar os neutrófilos a partir de outras células sanguíneas, tais como o método de separação por gradiente de densidade, é necessário para os estudos in vitro. Usando este método para isolamento de neutrófilos irá facilitar a investigação sobre as funções imunológicas mediadas por neutrófilos in vivo e ex vivo.

A capacidade de obter populações puras de neutrófilos é um primeiro passo importante para a investigação de pacientes com doenças imunológicas ^8. Densidade método de separação por gradiente é uma técnica ideal em que é obtido um elevado rendimento de células. o metod envolve a adição de uma solução de gradiente de densidade na parte inferior de um tubo contendo sangue humano diluído seguido por centrifugação a 300 g durante 35 min, sem ruptura. O anel de células mononucleares é exibida na interface e os neutrófilos residir por baixo da primeira. Este método tem vantagens significativas em relação a outros métodos disponíveis, tais como kits de isolamento de neutrófilos que são muito mais caros ^9. Além disso, o isolamento de neutrófilos do sangue humano por kits comerciais utilizando anticorpos dirigidos para um marcador de superfície específico para os neutrófilos humanos, aumentam o risco de activação ou diferenciação celular. Densidade método de separação por gradiente permite o isolamento de neutrófilos dentro de um curto período de tempo. Dentro do mesmo passo, as células mononucleares são também separados e recuperados. É uma técnica fundamental em que um elevado rendimento de células puras obtém-se, a fim de alcançar a integridade funcional.

A fim de imitar o tumor microenvironment, foram realizados experimentos em 3D. Dado a curta semi-vida dos neutrófilos in vitro, as experiências 3D com neutrófilos humanos frescos não são conclusivos. Por este motivo, as células promielocíticas (HL60) são induzidas a diferenciar-se em células de neutrófilos semelhante utilizando os indutores da diferenciação sulfóxido de dimetilo (DMSO) e ácido retinóico (RA). Usando células HL60 diferenciadas (HL60 diff) vai evitar ter diferentes respostas dos neutrófilos, devido ao isolamento de diferentes doadores.

Em 3D vitro modelos de cultura representam um estágio intermediário entre modelos in vitro 2D e modelos in vivo. Na cultura 2D, as células se espalhar sobre a superfície de plástico formando anexos não naturais de células a proteínas desnaturadas que são depositados sobre essa superfície sintética. Por outro lado, as células de cultura na forma 3D anexos célula-célula naturais, uma vez que as células e a matriz extracelular que são sintetizar o material natural ao qual eles estão ligados.Por esta razão, os modelos de co- cultura 3D, especialmente entre as células cancerosas e outros tipos de células, têm sido muito útil para indicar a sua contribuição para o crescimento do tumor, angiogénese e metástases. Como resultado, as culturas 3D fazer a cultura de células de imitar as condições fisiológicas que existem in vivo ^10.

Protocolo

1. neutrófilos Isolamento e Co-cultura com células leucémicas primárias

NOTA: Os procedimentos foram realizados sob a aprovação do comitê de Lyon Hospital Ética com todos os pacientes que assinaram o consentimento informado.

1. Isolamento de células leucémicas primárias e neutrófilos
   1. Recolhe tubos de sangue periférico em EDTA (1,8 mg de EDTA por mililitro de sangue) a partir de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crónica (CLL).
   2. Adicionar a cada 15 ml de sangue para um tubo estéril de 50 ml e dilui-se com 15 ml de RPMI (diluição 1: 1), em seguida, cuidadosamente e lentamente adicionar 15 ml de solução de gradiente de densidade para a parte inferior do tubo, sem misturar as fases. Certifique-se de que a solução do gradiente de densidade é à temperatura ambiente durante a preparação.
   3. Centrifugar a 300 xg durante 35 min à temperatura ambiente e sem travão. O sangue deve separar-se em quatro fases distintas, como mostrado na Figura 1A, de cima para baixo: plaquetas e plasma, as células mononucleares (Wanel hite), solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos.
   4. Recolhe-se o anel branco que representa as células leucémicas primárias, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um novo tubo de 50 ml.
      1. Encher o tubo com PBS (contém cálcio e de magnésio) até 50 ml no total e centrifugar a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente.
      2. Ressuspender o sedimento em 5 ml de PBS, em seguida, adiciona-se PBS a 50 ml, no total, e centrifugar a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente.
      3. Ressuspender o sedimento com meio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina) para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular.
   5. Aspirar as fases superiores deixando a fase de granulócitos e eritrócitos e adicionar PBS até 25 ml, em seguida, adicione 3% dextrano em 0,9% NaClup a 50 ml no total. Misturar os tubos 10 vezes e mantê-los durante 30 min à temperatura ambiente sem misturar.
   6. Recolher o RBC-pobres uma camada de neutrófilos superiord colocá-los em um tubo limpo estéril de 50 ml e centrifugar os tubos a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente. Ressuspender cada pellet com 5 ml de PBS, em seguida, adicionar tampão de lise dos glóbulos vermelhos até 50 ml no total.
   7. Manter os tubos no escuro durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida, centrifugar a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente. Lavam-se as peletes com PBS (PBS adicionar-se até 50 ml no total), em seguida, centrifugar a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente.
   8. Ressuspender as peletes com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular. Manter 3 x 10 ⁵ de cada tipo de célula em 50 ul de PBS-FBS (4%) em 5 ml de tubos de plástico para determinar a pureza do seu isolamento utilizando citometria de fluxo.
2. Analisar as aparências morfológicas das Populações de células isoladas
   1. Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10 ⁴ neutrófilos e 3 x 10 ⁴ células mononucleares em 150 ul de meio RPMI completo. Montar as lâminas de vidro, cartões de filtros e câmaras de amostras na centrífuga Cytospin, garantindo que tele centrifugar é bem equilibrado.
   2. Colocar cada tipo de célula para dentro da câmara da amostra e cito-centrifugadora a 750 xg durante 10 min à temperatura ambiente Remover as lâminas, placas de filtro, e as câmaras de amostra do centrifugador. Desmontar cuidadosamente, de modo a não danificar as células na lâmina. Descartar cartões de filtros e câmaras de amostras.
   3. Corar as células utilizando o kit de coloração de Giemsa e manter as lâminas durante 1 hora para secar. Examinar as células ao microscópio com uma ampliação de 100X.
3. Testar a pureza de células isoladas por FACS
   1. Marcar as células leucémicas primárias isoladas com anticorpo CD19 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 ⁶ células). Rotular os neutrófilos purificados com uma mistura de anticorpos anti-humanos listados na Tabela 1 (5? L / 10 ⁶ células). Incubar as células em escuro durante 30 minutos a 4 ^o C.
   2. Lavam-se as células com 500 ul de PBS-FBS (4%) a centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à TA.
   3. Ressuspender cada sedimento em 200 ul de PBS-FBS (4%).
   4. Analisar num citómetro de fluxo com a seguinte configuração óptica: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (BP 695/40 ), PE (BP 575/26); 633 nm do laser: APC (660/20 BP), a APC-Cy7 (780/60 BP). Garantir a compensação de cor.
4. Co-cultura de células leucêmicas preliminares com autólogo de neutrófilos
   1. Semente de 2 x 10 ⁵ células / ml de células leucémicas primárias, sozinho ou com neutrófilos autólogos na proporção de 1:10 em meio RPMI completo. Para fazer isso, ajustar o número de células por diluição de suspensões de células e adicionar 2 x 10 ⁵ células / ml de células leucémicas primárias para 2 X 10 ⁶ células / ml neutrófilos. Misture com cuidado.
   2. Adicionar 25 uM de inibidor de tirosina quinase de Bruton (Btk) (Ibrutinib) para as células. Incubar durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO _2.
5. Celular de colheita e análise de FACS
   1. Collect as células em 5 ml de tubos de plástico para análise FACS e os tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. Lavam-se as peletes com 1 ml de PBS-FBS (4%), em seguida, centrifugar a 300 g durante 5 min à TA.
   2. Ressuspender em peletes Anexina V e PI utilizando o kit comercial e incubar as células na obscuridade durante 10 min a RT. Analisar num citómetro de fluxo usando a estratégia de propagação da Figura 2A e a configuração óptica seguinte: laser de 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Garantir a compensação de cor.

2. Diferenciação de Células HL60 ao longo do Granulocítica Caminho e Sua Coculture com células RL linfoma B em modelo 3D

1. Diferenciação de promielocítica humana (HL60) Células em Células de neutrófilos semelhante
   1. Ajustar o número de células HL60 a 3 x 10 ⁵ células / ml, em seguida adicionar 1 uM de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO para induzir a diferenciação. Semente cada 3 x 10 ⁵ células HL60 por poço em placas de 48 poços depois incubar durante 48 horas a 37 ° C com 5% de CO _2.
   2. Mais tarde, recolher as células e centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender as células com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular.
   3. Depois dilui-se a suspensão de células em meio RPMI completo para ajustar o número de células HL60 a 3 x 10 ⁵ células / ml e induzir novamente a sua diferenciação pela adição de 1 ^ M de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO. Sementes em cada 3 x 10 ⁵ células HL60 por poço em placas de 48 poços e incuba-se durante mais 48 h a 37 ° C com 5% de CO _2.
2. Análise de diferenciação de HL60 (células HL60 diff)
   1. Recolher as células e centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular.
   2. Para analisar as mudanças na expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Coloque cada 3 x 10 ⁵ células indiferenciadas HL60 (a partir de cultura de células) e 3 x 10 ⁵ células HL60 diff em 5 mL de tubos de plástico para análise FACS e os tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA.
   3. Ressuspender as pelotas em 50 ul de PBS-FBS (4%). Rotular as células com anti-CD11b humano conjugados com AF700 ou CD38 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 ⁶ células). Incubar as células em escuro durante 30 minutos a 4 ^o C.
   4. Lava-se com 500 ul de PBS-FBS (4%), em seguida, centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender as pelotas em 200 ul de PBS-FBS (4%).
   5. Analise no citómetro de fluxo usando a estratégia de propagação da Figura 3A e a configuração óptica seguinte: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb); 633 nm do laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Para testar as alterações morfológicas no diff HL60, imobilizar as células em lâminas de vidro para exame microscópico.
      1. Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10 ^{4 células indiferenciadas HL60 (a partir de cultura de células) e 3 x 10 4 dif HL60 em 150 ul de meio completo RPMI. Montar as placas de vidro, placas de filtro, e as câmaras de amostra no centrifugador Cytospin, assegurando que a centrífuga é equilibrada.}
      2. Colocar cada tipo de célula para dentro da câmara da amostra e cito-centrífuga a 1500 rpm durante 10 min à temperatura ambiente. Remova os slides, cartões de filtros e câmaras de amostras da centrifugadora. Desmontar cuidadosamente, de modo a não danificar as células na lâmina. Descartar cartões de filtros e câmaras de amostras.
      3. Corar as células utilizando o kit de coloração de Giemsa e manter as lâminas durante 1 hora para secar. Examinar as células ao microscópio com uma ampliação de 100X.
3. 3-dimensional Cultura (3D)
   NOTA: Certifique-se de que os materiais utilizados nesta experiência são frios e o experimento está ocorrendo no gelo.
   1. Ressuspender cada 5 x 10 ⁴ células RL, quer sozinhos ou misturados com Diff HL60 Em relação RL: HL60 dif 1:10, com a matriz da membrana basal de 300 ul utilizando uma ponta de pipeta ml cortado com uma tesoura estéril, de modo a alargar a abertura de cerca de 2 a 3 mm. Evitar bolhas durante este passo.
   2. Sementes em cada 300 ul de suspensão de células / poço em placas de 24 poços. Evitar bolhas durante este passo. Incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C com 5% de CO _2, em seguida, adicionar 1 ml de meio completo RPMI a cada poço e incubar durante 7 dias a 37 ° C com 5% de CO _2. Mudar o meio de dois em dois dias. Adicionar 10 nM vincristina no dia 5.
4. Análise FACS
   1. Após 7 dias de cultura, Aspirar o meio e lava-se cada cavidade com 1 mL de PBS arrefecido em gelo, duas vezes. Adicionar 3 ml / poço de PBS gelado-EDTA (5 mM). Retire o gel a partir do fundo da cavidade por raspagem usando a parte inferior da ponta da pipeta de 200 uL. Agitar ligeiramente a placa em gelo durante 30 min.
   2. Transferir suspensão de células em estéril tubo de 15 ml e agitar os tubos suavemente sobre ice durante mais 30 min. Verifique se o aparecimento de suspensão celular homogênea. (Se não for o caso, em seguida, agitar as células durante mais tempo ou adicionar mais PBS-EDTA).
   3. Centrifugar os tubos a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Lavam-se as peletes com PBS, depois, centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   4. Ressuspender com PBS-FBS (4%) e rotular com anticorpo CD19 anti-humano conjugado com PE-Cy7 e anticorpo CD38 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 ⁶ células). Incubar no escuro durante 30 minutos a 4 ^o C.
   5. Lava-se com 500 ul de PBS-FBS (4%), em seguida, tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. Volte a suspender as células com anexina V e PI usando kit comercial.
   6. Analisar em citômetro de fluxo usando a estratégia de selecção de Figura 4A e a seguinte configuração óptica: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm do laser: APC (660/20 BP). Garantir a compensação de cor.

Resultados

Densidade método de separação por gradiente descrito aqui fornece as células leucémicas primárias e neutrófilos não estimulados isolados a partir do sangue de pacientes com LLC Figura 1A representa as diferentes camadas de sangue obtidas após centrifugação em gradiente de densidade (de cima para baixo:. Plaquetas e plasma, anel branco representam as células mononucleares, solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos). Figura 1B e ...

Discussão

Descrito aqui, um protocolo eficaz, simples, rápido e barato para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano com elevada pureza utilizando a abordagem de centrifugação em gradiente de densidade e nas mesmas células mononucleares passo também são separados e recuperados. As populações de células isoladas são ≥90% puro.

Vários métodos estão disponíveis para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano. Estes incluem métodos semelhantes utilizando gradie...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience