结合光遗传学和冷冻断裂免疫标记副本研究在老鼠杏仁核谷氨酸受体的特定投入安排

摘要

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

摘要

冷冻断裂电子显微镜已在超微结构研究的重大技术超过40年。然而，由于缺乏有效的手段来研究膜的分子组成产生了它的使用显著下跌。近来，出现了在冷冻断裂电子显微镜得益于通过免疫标记以显示完整的膜蛋白的有效方法的发展的一个主要的复兴。这些方法之一被称为洗涤剂溶解的冷冻断裂副本免疫标记（FRIL）。

与光遗传学的FRIL技术的组合允许中央突触的结构和功能特性的一个相关的分析。使用这种方法，可以鉴定和由它们各自的一个标记channelrhodopsin的表达和特定的分子标志物表征前和突触后神经元。 glutamat的突触后膜专业化的独特的外观GABA能突触进一步允许，当离子型谷氨酸受体的标记，来量化和分析这些受体的intrasynaptic分布。在这里，我们给的准备配对副本和如何immunolabel它们所需的程序一步一步的说明。我们也将讨论FRIL技术的警告和限制，特别是与潜在的采样偏见有关的。的FRIL技术的高再现性和通用性，当与光遗传学相结合，提供了用于在大脑识别的神经元微电路突触传递的不同方面表征一个非常强大的方法。

在这里，我们提供了一个例子这种方法是如何用在鼠标杏仁核的细胞插群众的神经元洞察兴奋性突触的结构与功能的关系。特别是，我们已经调查离子型谷氨酸受体的表达在确定的输入或从丘脑后部板内核和内侧膝​​状核iginated。这些突触被证明传递感觉信息有关的恐惧学习和对恐惧条件经受塑性变化。

引言

生物膜在纳米尺度的功能结构的定义已经由许多适于透射电镜免疫标记技术的发展，近年来挑战。然而，这些技术， 例如，前和后包埋免疫，有一些重要的限制，其中包括检测差抗原和/或膜结合蛋白的有限定量的评估。这些限制成为在神经系统中，其特点是具有高度细胞多样性和突触异质性的精细结构的调查尤为关键。这种异质性的结果从由前和突触后的元素和由差异表达，富集，或信号蛋白，如受体，转运，和效应分子的相互作用所决定的结构和功能的多样性。

直接immunolabe的新方法在洗涤剂溶解的冷冻断裂副本（FRIL）积分或交联的膜蛋白的灵最初是由藤本介绍二十年前^1。这种原始的方法有，然而，一些限制， 即，复制品，这阻碍了在复杂的组织分别映射细胞如脑标记分子的有意义的相关性的严重碎裂。大约10年前，茂 ​​源和深泽逐步提高技术^2。这是通过从另一组在科罗拉多州立大学的博尔德实验室，谁也显著提高的技术中，特别是用于间隙连接³的研究科学家努力平行。

在冷冻压裂协议和机器的改进，以及引入快速冷冻的（在高压下），现在允许调查者产生的相对大的尺寸和标本不间断复制品喜大多数细胞成分的GH品质的图像，而不限制和强大的化学生产的注视文物。

的FRIL技术提供一个高度定量的很大的优点，在映射组织学一种或多种蛋白质（同时）和细胞学鉴定细胞复合组织内，如大脑的原位鉴别，与前和突触后的平面视图的额外的优点在一个单一的复制品的元件。因此，FRIL技术，尽管它的许多技术难题，适用于一些非常显著科学突破的承诺，尤其是对个别突触的结构和功能特性的相关性。在过去的几十年里，已获得的大量信息的结构，分子组成，与突触的生理功能;但突触在形态和分子高度多样化取决于前和突触后PA租金神经元^4。仅适用于突触类型的少数人结构与功能的研究，到目前为止^5-7完成。这主要是由于该防止前和突触后元件的性质的精确识别技术约束。

超微结构分析提供了关键见解跨越不同突触联系两个突触大小和内容方面突触后膜特化在神经递质受体⁶的可变性，这对突触传递的强度和可塑性很大的影响。此外，大量的研究表明，在不同类型的突触表达离子型谷氨酸受体的数量在afferent-和目标依赖的方式^7-10调节。

这里，一个方法概述允许突触后膜特化的结构和受体组成的分析与限定ð突触前元件和功能。这种方法需要最近开发的光敏感藻蛋白，如channelrhodopsin2（的ChR2）的突触前表达的优点，并且FRIL技术来分析的α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑突触后表达的图案酸（AMPA-RS）和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA-RS）谷氨酸受体。这表现在从后丘脑，内侧膝状核（PIN / MGN）始发到杏仁核（ITC）的插层细胞群众的神经元轴突形成突触。 ITC神经元是在围绕基底外侧杏仁络合物^{（BLA）11,12}簇组织小刺的GABA能细胞。ITC神经元已知从BLA主要神经元接收兴奋性输入和定位的中央核（CEA），从而作为抑制栅极运作对信息的BLA和CEA ^12-15之间流动。

最近，我们证明了IT位于BLA和CEA之间的内-背集群用C神经元也收到来自感官丘脑及颞皮层区域，这是在巴甫洛夫的听觉恐惧条件¹⁶期间学习的恐惧直接修改和收敛的兴奋性投入。恐惧空调是联想学习的大脑机制方面的最好理解的形式之一。在恐惧条件，最初的中性条件刺激（CS， 例如，一个音）是搭配厌恶非条件刺激（US， 例如，一个温和的脚震动）造成了CS-美国协会和空调的恐惧反应^17，18。兴奋来自丘脑和新皮质区，其中携带表示CS和美国信息输入，分别被称为会聚到杏仁核（LA）的外侧核的锥体神经元和经受塑性^19。我们以前的工作表明，感觉输入的信息也传达给ITC的神经元并行 16。

作为对个体感觉输入的一种机械的分子分析的第一步突触到ITC神经元，我们使用腺伴随病毒（AAV）来表达的ChR2标记与黄色荧光蛋白（YFP）。所述AAV注入PIN / MGN和轴突终端被他们的ChR2-YFP的表达鉴定。我们所使用的FRIL技术生成两个面，以评估在与ITC神经元的PIN / MGN轴突终末形成突触的突触后AMPA-R和NMDA-Rs的密度。

研究方案

涉及动物主题手续已经批准Regierungspraesidium蒂宾​​根，巴登 - 符腾堡州，德国国家元首和由奥地利动物实验伦理委员会，并分别按照在研究中使用动物的欧盟指令。

1，AAV-Channelrhodopsin2-YFP的立体定向注射

注:立体定向注射是根据以前发表的协议²⁰进行。

1. 通过在180ºC它们加热1.5小时制备无菌的工具。
2. 拉尖锐（〜直径50微米）玻璃吸管用于使用水平微电极拉出器具有以下参数设定注射:热=斜坡值 - 20，拉= 0，速度= 100，时间= 200，压力= 200。
   注:斜坡的价值需要根据由微量拉马制造商提供的说明，每批购买的玻璃吸管来确定。
3. 预混物的病毒溶液1微升和0.2微升的0.1％快速绿色溶液（在玻璃吸管将溶液的更好的可视性）在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS; 25mM的，0.9％氯化钠，pH值7.4）。通过使用10微升吸管和凝胶-FIL提示填充玻璃吸管。对于病毒构建，使用腺相关病毒hSyn-的ChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）。
4. 用小动物麻醉设备（氧气诱导3％异氟烷）麻醉鼠标。使用。在这项研究中，使用年龄〜6周3野生型小鼠。
5. 耳朵和眼睛之间剃头和带碘伏基于溶液消毒。
6. 应用眼药膏，以防止在麻醉过程中眼睛干燥。皮下注入小鼠具有止痛（美洛昔康为主，0.1毫升5毫克/毫升溶液）。
7. 将鼠标在立体框架，并通过气体麻醉设备（氧气2％异氟醚用于维护）维持麻醉。由于缺乏肢体撤回检查麻醉深度继续之前反射。
8. 在整个手术过程中保持无菌条件尽可能最好。戴上一次性面罩，一个手术衣和手套。
9. 使使用剪刀²⁰的头部的顶约1cm皮肤切口。轻轻拉动皮肤使用钝钳一边，用夹子固定修复暴露颅骨表面，清洁头骨与H ₂ O _2。
10. 用细尖记号笔在骷髅标记注射部位。钻一小孔（大约1毫米的直径）为在标记位点的头骨。对于单边PIN / MGN注射该螺栓，使用下列坐标:从囟（毫米）:3.0后，横向±1.8，腹面3.8。
11. 安装填充玻璃吸管上连接到压力注射装置立体定位框架，并把吸移管到前囟的位置。
12. 断绝用细直尖镊子玻璃吸管的尖端。确保枪头是applyin开放GA几个压力脉冲和病毒液滴观察挤压。
13. 转至所需的注射坐标和使用注射压力注射设备上进行以下设置移液器的内容（约0.5微升）的一半:20压磅，平均脉冲宽度30毫秒脉冲50的平均数量。
14. 离开吸管到位慢（1mm /分钟）之前缩回它〜1分钟。
15. 清洁头骨PBS（pH 7.4）中，取出夹子。轻轻拉动皮肤在一起，缝合切口（3 - 4节）。伤口周围施加消毒剂（基于聚维酮碘）。
16. 停止麻醉，不要离开鼠标，直到无人看管完全清醒。养老鼠单住。术后继续监测健康状况;如有必要，辖止痛。
17. 饲养动物4周脑固定前，以确保病毒表达的适当水平。

2.试样制备

1. 脑固定</ STRONG>
   1. 固定剂的制备
      1. 为1升的固定剂的，称取多聚甲醛，并把它添加到300毫升去离子H ₂ O的热火以55 - 60ºC为〜10分钟，并不断搅拌。
      2. 关闭加热并添加7 - 4 N氢氧化钠8滴。该解决方案应该成为〜10分钟清楚。
      3. 让其冷却至室温，添加的苦味酸饱和溶液150毫升，并与去离子H ₂ O带来至500ml
      4. 加入500毫升0.2M的磷酸盐缓冲液（PB）的。用滤纸过滤。调节pH至7.4，用NaOH。
      5. 冷却该固定剂6ºC，它在6ºC存储在黑暗玻璃瓶不超过一天。
   2. Transcardiac灌注
      1. 麻醉小鼠硫喷妥钠（120毫克/公斤体重）的腹膜内注射。确保动物深受检查踏板撤出REFL麻醉当然，应不存在。将动物在其上灌注表背与四肢捆绑住。
      2. 用钝头剪刀打开腹壁纵向，使沿左肋的尾部边缘横向两个额外的削减，揭露隔膜。切掉膜片切胸壁在两侧osteocartilageneous边框。解除胸壁含有胸骨暴露心脏中央板坯的尾端。
      3. 除去心包，使在左心室的前端的小的精确切割承认灌注装置的插管。使用一个钝套管具有0.6毫米的直径。通过脑室轻轻走过套管至顶尖将出现升主动脉，并用夹子固定套管。以允许血液和灌流液从血液流出口，使在右心房的切口。
      4. 灌流小鼠transcardially用蠕动泵的流速起初5毫升/分钟，用PBS（25mM的，0.9％氯化钠，pH值7.4）中约1分钟，随后冰冷的固定剂为7分钟。
      5. 固定后，切断小鼠头部有一对剪刀，然后切开皮肤通过中线从颈部到鼻子。取下的肌肉充分暴露颅骨。
      6. 用锋利的剪刀，让通过枕部和枕骨大孔开始interparietal骨头纵向切割。用细镊子取出这些骨头，露出整个小脑。然后，让通过顶叶和额叶留到鼻骨另一纵剪切和镊子删除它们，露出整个大脑。
      7. 用刮刀取出大脑而不损坏它，并将其放置在冰冷的0.1M PB。
2. 切片和试样的修整
   1. 切成大约5冠状块 - 用含有感兴趣的区域剃刀叶片6毫米。它粘到持有人的vibroslicer用氰基丙烯酸酯胶。定向组织块，以使新皮质朝向振动的刀片。切片冠状切片，将含有杏仁核，在冰冷的0.1M的PB 140微米与vibroslicer（ 图1A），并收集它们在相同缓冲液中的6孔培养皿中。
   2. 在立体显微镜，修剪出的感兴趣区域（这里是ITC的内-背paracapsular集群，参见图1B）从切片。为此在涂有聚硅氧烷弹性体和填充用0.1M PB培养皿，用眼科手术刀。确保修剪块放入隔离（约1.5mm）（ 图1B）的孔。
   3. 移动修剪成块冷冻保护液（30％甘油在0.1M PB）O / N为6ºC。

3.高压凝

注:FRIL由6基本步骤（ 图2）:1）快速冷冻用高压（2300 - 标本2600条）。 2）试样的压裂。裂缝平面大致如下冷冻的膜的中心疏水核心，将它们分成两个半膜小叶:即位于相邻的原生质（P-面）一半和位于相邻的胞外或exoplasmic空间半（E-面对）。 3）由铂和碳的真空沉积在试样的复制。 4）的组织的洗涤剂消化。 5）免疫标记。 6）使用透射电子显微镜的副本的分析。

1. 铜载体的制备
   注:要通过FRIL过程的连续阶段被处理，试样需要被安装到金属（金或铜）的载体。根据压裂和使用的机器类型的模式，规模和设计，这些运营商不同而不同。在这里，我们使用的铜载体（ 图1B，E）和一个铰接的"双副本表"; （参见图3B），它在打开时产生通过将冷冻样品的拉伸断裂（ 图2）。这允许保持和复制的断裂试样的两侧。
   1. 波兰航空公司铜用麂皮皮肤片晦暗卸妆。
   2. 地方的载体在玻璃锅和干净的非离子型洗涤剂（pH约1.5）中超声处理水浴两次，然后广泛自来水中，随后用去离子水冲洗，然后用乙醇冲洗两次。
   3. 超声处理在丙酮铜载体15分钟。
   4. 放置在滤纸上的载体干燥。
   5. 附着双面胶带的一个环的铜载体（ 图1C），这将作为保持以及用于修剪块（保持载波）。
2. 试样的冷冻
   注:处理液氮的照顾和适当佩戴护目镜。
   1. 打开免费的高压诚单元（ 图1F）与试样冷冻开始之前至少1.5小时。
   2. 按"空气预热器"按钮，启动加热，烤了50分钟。设定空气温度至80℃。
   3. 连接的氮罐向高压冷冻单元并按下"氮"按钮，以填补在里面杜瓦用液氮。在"氮LEVEL"指示灯点亮。开始按"冷却"按钮冷却。
   4. 按"DRIVE IN"按钮时"氮素水平"熄灭。检查液压系统移动活塞来回3次。
   5. 按下"自动"按钮，和"氮"按钮。当"READY"亮起，高压冷冻机组准备高压冻结。
   6. 放置一个修剪块，其中已被熔化成股份公司的双面胶带（ 图1B）使用铂导线环的孔姑娘吸管。
   7. 除去多余的使用滤纸或刷子的冷冻保护剂溶液。
      注意:此过程也很重要，以去除气泡，可能形成围绕组织和可能导致的组织的形状和/或超微结构失真。
   8. 下一个立体显微镜，覆盖夹持载体与另一种载体，使该组织的块被夹在两个载波之间。
   9. 插入载体夹层到高压冷冻单元（ 图1D）的试样保持器。将试样保持器到高压冷冻单元（头朝下），并通过在试样保持器螺纹连接固定。
   10. 通过按"喷气自动"按钮开始冷冻循环。尽快工作，取出样品支架和淹没用液氮尖端插入一个绝缘盒。沉浸2对钳的尖端在液氮冷却它们。
   11. 小心取下日E从试样保持器载波三明治，并将其放置在一个预先冷却冷冻管。确保该载体只用液氮冷却的镊子处理。冷冻管应该被穿孔，以允许氮气从小瓶（ 图1G）流出。
   12. 直到所有想要的样品都被冻结重复步骤3.2.6到3.2.11。包含相同类型的样品的多个载波三明治可以存储在相同的小瓶中。
   13. 含存放在冷冻槽运营商直到复制（ 图1H）的冷冻管。

图1.组织制备和高压冷冻。（A）中Vibroslicer用于部分的组织。   （B）与交流侧含有杏仁核显示一侧的冠状导致老鼠大脑部分奥珀载体装有双面胶带的一个环。虚线框表示兴趣，包含ITC的内侧paracapsular集群的区域。在双面胶带的孔的直径是约1.5毫米。 （C）工具准备铜载体。从左上方以顺时针方式:双面胶带，镊子，冲床，铜载体和剪刀。载波三明治成用于高压冷冻的试样保持器的（D）的插入。载波夹层放入试样保持器的孔。 （E）的铜的载体不具有和具有双面胶带的环和"载波三明治"。   （F）与加压罐馈送液氮它的高压冷冻单元。 （ 七 ）离心管去购买的冷冻组织。注意在小瓶允许氮气流出小瓶（箭头）的上中间位置的孔。 >（H）冷冻槽用于储存冷冻组织。 请点击此处查看该图的放大版本。

4.冷冻断裂和复制

1. 电子束枪的研制
   1. 插入电子束枪前先取出盾牌的"导流板"。将"设置计"，通过较低的阴极罩中心长丝进入弹簧夹头。
      注意:用于设置计的较大直径端的碳枪而较小直径端为铂枪。
   2. 滑过计新长丝直到"压力薄片"可夹住长丝的两端，确保灯丝线圈不在于以一角度。
   3. 取出设置表和插入碳棒。通过加强合作解决这个问题蒸发器杆保持器的llet卡盘，确保杆的端部的高度是在从底部第二线圈的中间。对于铂枪中，铂杆的端部的高度应在从顶部起第二灯丝线圈的中间。
   4. 更换偏转板和插入枪进入冷冻断裂装置中。随着使用后沙冲击波清洁枪。

图2.插图FRIL技术的关键步骤。
为准备和副本的分析所需的不同步骤的轮廓。 （1）组织的高压冻结。 （2）压裂。在冷冻组织的压裂，质膜的脂质双层是在疏水界面分成两半。在质膜蛋白被分配到要么exoplasmic（E-面）或原血浆膜（P-面）。 （3）复制。碳（C）的蒸发捕集的裂隙的组织的表面上的脂质和蛋白质。该材料涂覆有2nm的铂/碳在60°角阴影，然后用它加强复制品的结构（C-层，铂阴影）另一个为15nm的碳层。 （4）增溶。未捕获由副本膜组织，然后用SDS-溶液溶解。 （5）标记。目的蛋白质可以在复制品使用由特定的初级抗体（初级抗体）中，用一金颗粒（Au）的共轭次级抗体（二次抗体）的复合物可视化。使用不同大小的金颗粒的允许在相同的副本多于一种蛋白质的检测。 （6）免疫标记后，副本被收集到铜网格，并在80透射电子显微镜分析- 100千伏请CLICķ此处查看该图的放大版本。

2. 设置冷冻断裂装置的向上
   1. 通过转动电网到1。的冷冻断裂和复制过程的详细描述切换冷冻断裂装置中（ 图3A）上，看到由制造商提供的使用说明书。
   2. 之前冷却该冷冻断裂装置中，烘烤用温空气的单元的整个冷却系统。按在MTC 010器件中的"解冻"按钮（温度控制单元）（ 图3A），并让45分钟的烘烤过程中运行。
   3. 激活真空站。冷冻断裂装置通常工作在约10 ^-6的真空范围- 10 ^-7毫巴。
   4. 填充氮气罐，并将其连接到冷冻断裂装置。检查阀支架干燥，也清洗罐的阀支架的插入之前的条目（湿度可以与VACUU干扰M和N个指示₂填充油箱）。
   5. 开始由温度设定为-115℃的冷却。冷却时间约45分钟。
   6. 插入电子束枪与调整电流和电压，以达到蒸发以下参数:
      碳枪:在旋转，位置90°，碳积累速率0.1 - 0.2纳米/秒
      碳铂枪:旋转关，位置60°，累积0.06的速率 - 0.1nm /秒
      注意:如果一个枪被用于第一次的碳或铂棒，脱气使用前3分钟的交换之后。
3. 压裂和复制
   1. 将冷冻运营商的三明治到双副本表并确保所有的操作都​​在液氮中进行。
   2. 传送双副本表到杜瓦容器中，在45°的角度其固定在试样台接收机。液氮水平应该永远是双副本表的上方。
   3. 拿起双副本表与表操纵器，并将其插入冷冻断裂装置上冷阶段。等待大约20分钟，以允许双副本表的温度调整到-115℃。
   4. 检查真空度低于10 ^-6毫巴，温度为-115℃。
   5. 断裂由连接到放置在双副本表上方的导流罩轮手动顺时针反向旋转的组织。当护罩转动，它迫使双副本表来打开，压裂的组织。
   6. 按在EVM 030设备（电子束蒸发控制单元）冷冻断裂装置（ 图3A）的"高张力"按钮。
   7. 由碳（旋转）通过定位在90°角的厚度为5nm的电子束枪的装置的蒸发复制裂隙的组织（ 图3C）的暴露表面，随后是单向shado翼带以60°角的厚度为2纳米的铂 - 碳。最后，从90°的角度（旋转）申请的碳的15纳米厚的层。
   8. 使用蒸发以下参数:
      第一个碳:上旋转，位置90°;速度0.1 - 0.2纳米/秒; 5纳米
      第二碳铂:位置60°;速度0.06 - 0.1纳米/秒; 2纳米
      第三碳:上旋转，位置90°;速度0.3 - 0.5纳米/秒; 15纳米
   9. 从冷冻断裂装置中取出样品复制，并将它们传送到陶瓷12孔板（ 图4A）充满TBS（Tris缓冲液，pH值7.4）。
   10. 使用白金环线材，取出试样载体（ 图4A）复制的组织。
   11. 直到所有样品都被复制，重复步骤4.3.1到4.3.10。

R /> 图3.冻结压裂和复制。
（ 一 ）冷冻断裂装置。机包含多个控制单元和监视器。试样引入室中，通过一个端口在腔室的左侧。一种加压液氮容器被连接​​到冷冻断裂装置以冷却阶段。图片下面的两个单位的显示放大图（UPC 010和MDC 010）和第二碳层的蒸发期间显示参数显示器。   （B）开（左）和双副本表的关闭（右）的景色。的"载波三明治"被插入到表中的所述槽（由箭头表示）。小武器防止"运营商的三明治"，从操作过程中脱落。 （C）断裂和复制样本。副本出现在裂隙组织顶部薄黑片。53 / 53853fig3large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

4. 副本的SDS-消化
   1. 传输副本，以填充用1ml的SDS-消化缓冲液（2.5％月桂基硫酸钠，在15毫摩尔Tris 20％蔗糖，pH值8.3）的4毫升的玻璃小瓶中。消化在80℃振荡（45冲程/分钟）18小时。
   2. 传输副本，以一个新的管填充用SDS-消化缓冲液并储存于RT。

5.免疫标记

注:所有的孵育均在室温轻轻摇动进行，除了与抗体孵育。

1. 洗净的副本在新的SDS-消化缓冲液10分钟。
2. 用2.5％BSA（牛血清白蛋白）的TBS 5分钟，然后3×10分钟用0.1％BSA的TBS洗复制品一次。
3. 在TBS块非特异性结合位点，用5％BSA的1小时。
4. 主要适用于抗体稀释于2％BSA-TBS。在15℃下72小时（ 图4C）执行在潮湿室中30微升下降（ 图4B）保温。
   1. 在这项研究中，从破裂的组织过程中两个副本。孵育一个副本与针对氨基酸717提出了豚鼠多克隆抗体 - 754鼠标的GluR1共同所有AMPA-R亚基（稀释:1:200），或小鼠单克隆抗体针对重组融合蛋白募集覆盖氨基酸660 - 在NMDA-R的NR1亚基的811（稀释:1:500），和针对绿色荧光蛋白提出的兔多克隆抗体（稀释度:1:300）。
   2. 孵育其他副本与相应于氨基酸384针对合成肽产生一个兔多克隆抗体 - 398大鼠μ阿片受体的（稀释:1:500）。
5. 的TBS洗含0.05％BSA（3×5分钟）。
6. 应用二次抗体。在这项研究中ū本身金（5毫微米为离子型谷氨酸受体，10为μ阿片受体和/或供的ChR2-YFP 15纳米）的TBS稀释用2％BSA共轭的抗体。稀释二级抗体1:30，在15°CO / N的30微升下降孵育。
7. 在RT在0.05％BSA-TBS洗涤3×5分钟。
8. 洗在超纯水中2×5分钟。
9. 上涂覆的Formvar-100线平行条格（ 图4D）安装复制品。

6.副本分析

1. 图像副本，在80或100千伏的透射电子显微镜（TEM）。通过由CCD（电荷耦合器件）照相机获取数字图像。
2. 离线，找到使用地标（ 图4E）两个副本的图像对应区域。分析使用Image J。确定突触后区和针对分析该受体免疫标记的颗粒的数目的数字图像。

图4.副本的免疫标记。
（A）工具操纵和洗的副本。一种陶瓷12孔板（右上）和2种玻璃移液器（左上）。圆尖（左下）玻璃吸管用于传输副本，并用铂棒（底部中心）的吸移管是用来展开副本。在洗涤液的复制品（右下）。 （B）的副本的免疫标记以在组织培养6孔板的孔中放置一小片封口膜的滴（30微升）中进行。注意，一个副本由含有缓冲液的抗体的滴覆盖。为了防止蒸发，一片湿润薄纸的嵌合围绕井的内边缘。 （ 三 ）对孵化器的免疫标记的一步。孵育都在15℃下进行。 （D）安装在副本的formvar覆层100-线双杠网格。 （ 五 ）从一对副本的低倍显微照片。虚线方框表示三种典型的地标在相应的副本，以确定一个位置。比例尺:10微米。所有的数据都显示为平均值±SEM 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

的FRIL技术，当与微生物来源^21， 即信道集成在质膜和有效地沿轴突顺行输送的光遗传学致动器的表达相结合，允许在限定的亚组来定量检验AMPA-R和NMDA-Rs的突触后表达突触。这显示在这里从不同丘脑核（如 PIN / MGN）始发到杏仁核神经元ITC轴突。这种方法使个体感觉输入突触到ITC神经元，一组细胞的已耐火仔细的解剖和分子表征到目前为止的分子分析。

立体定向注射的rAAV-的ChR2-YFP的入PIN / MGN 4周后，的ChR2-YFP阳性轴突密集支配洛杉矶，所述amygdalostriatal过渡区域（Astria）和内侧paracapsular我在杏仁核的TC簇，与以前的跟踪完全一致的图案研究^16,22。我们还检测到强烈的金上从腺相关病毒的ChR2-YFP-在冷冻断裂复制品轴突和终端的P-面免疫标记为的ChR2-YFP注射的小鼠（ 图5A），但不是从非注射的小鼠的副本。在一个复制品谷氨酸突触的突触后膜专业化可以观察到作为质膜^2，23的E-面膜内颗粒（IMP）中的集群，并且常伴有其突触前质膜⁷的P面（ 图5B-C）。允许识别由PIN / MGN轴突终末形成谷氨酸突触的突触后专业化这些功能（ 图5和6）。我们标记AMPA-R的与识别所有四个亚基（GluA1-4），而使用抗必要NR1亚基的抗体检测NMDA-R的抗体。

ntent"FO:保together.within页="1">由于缺乏工具来检测相同的副本是否这些突触用树突棘或ITC神经元的轴做，我们标注相应的副本脸μ阿片受体，作为ITC的神经元表达突触后高水平这些受体^24，这使用了采用标策略所需的相同的突触后轮廓的识别的两个副本（ 图5C-F和图6A-D）（ 图4E） 。

图5的ChR2-YFP和离子型谷氨酸受体的检测通过免疫颗粒副本。（A）横断裂轴突终端（浅蓝色）和标记有15nm的金颗粒检测的ChR2-YFP其P-面的一小部分。在终端内，膜Ô˚F众多突触小泡可以观察（SV）。注意免疫标记的限制的质膜很大一部分的特异性。标记为的ChR2识别终端作为从PIN / MGN始发。该终端形成具有脊的不对称突触。突触后膜专业化（PSD）在E-面显示膜内粒子的特性簇，并标记为5nm的金颗粒揭示AMPA-卢比。 （B）一种的ChR2表达轴突（标有15纳米的金颗粒）的P面所示接壤2树突的它们具有标记为5nm的金颗粒露出的NMDA-R的2的PSD之一。 （CD）一个PIN / MGN-ITC突触前和突触后膜的相对面。 （C）的端子的P面表达的ChR2（标有15纳米的金粒子）并延伸超过两树突轴，包含标记为AMPA-卢比（5纳米的金颗粒）二的PSD其中之一的E面。 （ 的D）的两个树突的相应的P-面标记为μ阿片受体（10纳米的金粒子）。 （EF）由虚线所概述的区域的放大图。比例尺:500纳米请点击此处查看该图的放大版本。

为在PIN / MGN-ITC突触AMPA-卢比Immunoparticles发现所有的IMP簇以上，这表明突触后专业化（ 图5E）中的均匀分布。在PIN / MGN观察到显著较高（非配对t检验P <0.018）AMPA-R标记密度突触到ITC棘（715±38金颗粒/微米^2，N = 32）相比，突触到ITC树突（590 ±44金颗粒/微米^2，N = 32）。总体而言，在PIN / MGN-ITC突触AMPA-R的密度呈相对较低方差（方差的系数，CV = 0.37）与均匀分布是一致的。

为在PIN / MGN-ITC突触的NMDA-R的Immunoparticles常常突触后的IMP簇（ 图5B）内观察到的分布不均。 NMDA-R标记的密度相似（非配对t检验p = 0.39）之间的PIN / MGN突触到ITC棘（1070±153金颗粒/微米^2，N = 8）和ITC树突（812±183金粒子/微米^2，N = 9）。不像所观察为AMPA-卢比，在PIN / MGN-ITC突触的NMDA-Rs的密度是高度变量（CV = 0.54）。

图6. AMPA-R和NMDA-R的免疫标记在鉴定PIN / MGN-ITC突触。
（AB）一个PIN / MGN-ITC的前和突触后膜的相对面作出到树突棘其中终端的P面表达的ChR2突触（标有15纳米的金颗粒）和在PSD到树突棘标记为AMPA-卢比（5纳米金粒子）。 （CD）由虚线所概述的区域的放大图。这些区域已经被旋转约45°逆时针允许的PSD更好的视野。 （E） - AMPA-R颗粒对在ITC的脊骨和树突突触区的数目的散点图。在这两种结构中，一个正相关已经观察到。 （F）对在ITC刺和树突突触区的NMDA-R的粒子数的散点图。检测只在树突棘一个显著的正相关关系。比例尺:500纳米请点击此处查看该图的放大版本。

因为部分常常覆盖在突触后的IMP簇突触前质膜的P面，我们可以估算的只有30％的突触的突触区（棘:平均面积0.032微米^2，范围:0.007〜0.063微米²中，n = 8;树突:0.047 ^平方微米，范围:0.024至0.166微米^2，N = 11）。这是在一个类似的范围内前面所分析的端脑谷氨酸突触^25。

在这两种刺和树突，金immunoparticles在个别突触AMPA-Rs的数目呈正突触区域相关（斯皮尔曼，棘:R = 0.88，树突:R = 0.60，P <0.0001）（ 图6E）。相反，发现金immunoparticles为NMDA-Rs的数目在棘（斯皮尔曼，棘:R = 0.90，P <0.002）与突触区域关联，但不是在树突性（r = 0.21，P = 0.29）（ 图6F ）。

讨论

冷冻断裂电子显微镜已在超微结构研究的重大技术超过40年。然而，由于缺乏有效的手段来研究膜的分子组成产生了它的使用显著下跌。近来，出现了在冷冻断裂电子显微术的一个主要复兴由于通过免疫标记^1,2，即FRIL技术以显示完整的膜蛋白的有效方法的发展。

该FRIL技术比其他免疫超微结构方法具有几个优点。首先，蛋白质是抗体增加的敏感度容易接近。第二，细胞膜特，如突触后膜，副本的二维表面上的大的部分的曝光允许感兴趣的分子的空间分布和物理邻接的检查而不斯里的费力和耗时的重建人超薄切片。第三，质膜的两半的可用性增加了可被标记为每个单独的结构蛋白的数量，提供合适的抗体是可用的。在压裂，分裂膜的疏水面涂覆有碳 - 铂该entrenches残留在断裂表面上的蛋白质结构域。这可以防止在这些结构域抗原的抗体的访问。例如在一个复制品的P面仅面向原浆空间表位可以通过抗体而在E-面仅表位朝向可被抗体结合的exoplasmic空间进行检测，（ 见图2）。

在另一方面，FRIL技术也从一定的局限性²受损。由于骨折随机发生的，它可能是很难瞄准特定的细胞或结构。这也可能导致一个抽样偏差， 例如，突触集合中，考虑到不同的概率离的沿结构具有不同的曲率（ 例如，刺对轴）的膜cturing。此外，膜蛋白的两个面中的一个的分配是不可预测的。因此，蛋白质为P-面或E-面的分布，特别是用于定量研究，应认真使用抗体反应的细胞内和细胞外结构域检查。最后，在某些结构，例如突触前轴突终端的复制品的识别，仅基于形态特征时是很困难的。然而，对于标志蛋白的特异性抗体的使用或标记整合膜蛋白或使用病毒载体提供额外的工具通道的转导，以便于裂隙膜的鉴定。例如，本研究了的ChR2-YFP的丘脑神经元的转导的优点，以确定他们的轴突传出神经在杏仁核或标记为μ阿片受体揭示突触后箱ITC神经元mbranes。

为了成功地进行FRIL技术，应特别注意关于组织固定服用。强组织固定（> 2％多聚甲醛）可导致交叉骨折率很高，并在贴标签的灵敏度的降低。另一方面，弱注视使组织处理和加工（ 例如，切割部分）的困难。同样重要的是，以控制修剪块的厚度的双面胶带的厚度相匹配。如果检体的厚度比带的下部，所述组织的表面可能不附着到两个金属载体的表面上，从而将冷冻试样不破裂。如果组织是厚，它会与不可避免结构扭曲压缩两个铜载波的三明治制成时。在该试样断裂（在此协议-115℃，）中的温度也起着重要的作用上的副本的结构。较高的温度可能会产生伪像的一个更高的速率，如在组织的表面上的水蒸汽的冷凝之前或蒸发期间。较低的温度（<-125℃）压裂过程中可能会增加分裂的危险掉的材料。这种材料可落入到样品的表面上或保持连接到它。材料的这些片也铜版纸和对比产生图像上的黑斑。在较低温度下压裂也可以影响交骨折的频率特别是对于小的精细结构如树突棘。在副本的制备进一步关键步骤是该洗涤剂消化。如果消化不完全，未消化的组织出现在副本的暗斑，在TEM混杂结构的分析。此外，未消化的组织可以非特异性陷阱或绑定的抗体，增加了背景标记。另一方面，使用洗涤剂的S表示组织消化可变性关联到副本改变其二级和三级结构的分子。因此，对于某些抗原可能需要逐渐稀释SDS浓度额外洗涤步骤。

对于免疫标记，不同大小的缀合到二级抗体的金颗粒的可用性允许在同一时间进行检测，但只有定性，多种蛋白质，甚至在质膜的特定微区，如突触后专业化。然而，由于空间位阻，定量研究一般仅限于在检测只有一个分子。前述金颗粒的尺寸也可影响标签功效。

在FRIL标记的解释，应该记住的是，在免疫粒子可位于任何地方与从该抗原20-25纳米的半径的半球内由于柔性复杂的形式由初级和二级抗体²⁶编有关理论和FRIL及其相关技术的实践提供进一步的信息，我们将为读者也给其他方法的第²⁷条^，28。

的FRIL技术最近已用于在不同的突触种群^29,30。此外，AMPA-Rs中的FRIL技术的检测灵敏度估计高达每一个功能的AMPA 1免疫粒子谷氨酸受体定 ​​位的高分辨率定量分析-R通道^29。因此，这种方法是整体非常有用的量化和分析AMPA-R和NMDA-R的在中央突触突触后表达的图案。在这里，我们展示了其在PIN / MGN-ITC突触适用性，一个网站最有可能的，生怕调节过程中传达美国的信息很重要。使用针对AMPA受体亚基谷氨酸的高度保守的细胞外的氨基酸残基产生的抗体A1-GluA4，我们发现对应于突触后膜专业进出口集群内连金颗粒的分布。相比于通过PIN / MGN丘脑传入针对性轴突触AMPA-R的在ITC棘密度为显著高。在两个脊柱和轴突触，检测标记为AMPA-R和突触后区之间的正相关性，常见于其他谷氨酸突触²⁵的功能。在PIN / MGN-ITC突触AMPA-R的密度低方差指示类似于丘脑传出神经形成⁷突触等，但不同于皮层突触²⁵的均匀分布。相反，NMDA-R的密度为更多变和脊椎和轴突触暗示比AMPA-R的不同规定之间没有差异。在未来，FRIL技术的高再现性将不仅允许评估中央突触的基础分子组成，但可有利于的c检测hanges在离子型谷氨酸受体的数量和分布subsynaptic恐惧学习后，补充这些投入前和突触后性能的离体记录。

总之，这种方法可以由其他研究者用来洞察特定输入兴奋性突触的结构与功能的关系中的许多其他的神经回路，其中解开输入的原点和突触后元件的性质和组合物是至关重要的，但问题。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectants
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointments
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue preparation
Paraformaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., United Kingdom	AGR1018
Saturated picric acid solution	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Germany	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Germany	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Germany	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Germany	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glycerol	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure ultrapure water system	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Peristaltic pump	ISMATEC, Germany	ISM 930C
Filter Paper	MACHEREY-NAGEL, Germany	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
Ophthalmic scalpel	Alcon Laboratories, USA		can be replaced by other ophthalmic scalpels
Perfusion cannula	Vieweg, Germany	F560088-1	can be replaced by similar items from other companies
Name	Company	Catalog Number	Comments
High-pressure  Freezing
Copper carriers	Engineering Office M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Germany		can be replaced by same item from other companies
Chamois skin	Household supply store
Hole punch, 1,5mm	Stubai, Austria		can be replaced by same item from other companies
Denatured ethanol	Donauchem, Austria		can be replaced by same item from other companies
Aceton	Roth, Germany	9372.5	CAUTION!
High Pressure Freezing Machine HPM 010	BalTec, CH; now Leica Microsystems	HPM010	not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100
Stereo-microscope	Olympus, Japan	SZX10
Liquid nitrogen			CAUTION!
Cryo-vials	Roth, Germany	E309.1	can be replaced by same item from other companies
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001	can be replaced by same item from other companies
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001	can be replaced by same item from other companies
Liquid nitrogen storage vessel	Cryopal, France	GT38	can be replaced by same item from other companies
Non-ionic detergent (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Germany
Name	Company	Catalog Number	Comments
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	SANDURET 2-K	can be replaced by same item from other companies
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21µ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	955932
Freeze Fracture System BAF 060	BalTec, CH; now Leica Microsystems	BAF060
Ceramic 12 well plate	Gröpel, Austria	14511	can be replaced by same item from other companies
Trizma base	SIGMA, USA	T1503	can be replaced by same item from other companies
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253	can be replaced by same item from other companies
Sodium chloride	Merck, Germany	1,064,041,000	can be replaced by same item from other companies
SDS, Sodium lauryl sulfate	Roth, Germany	5136.1	CAUTION! ;  can be replaced by same item from other companies
Sucrose	Merck, Germany	1,076,871,000	can be replaced by same item from other companies
TRIS	Roth, Germany	5429.3	can be replaced by same item from other companies
Universal Hybridization Oven	Binder, Germany	7001-0050	can be replaced by same item from other companies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647	can be replaced by same item from other companies
Anti-GFP Antibody	Molecular Probes, USA	A11122
Anti-pan-AMPAR Antibody	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1	Merck Millipore, Germany	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, USA	24216
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody	BBInternational,	EM.GAG5
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody	BBInternational,	EM.GAR15
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody	AURION, Netherlands	DAR 10nm
Copper grids, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Incubator	Major Science, USA	MO-RC	can be replaced by same item from other companies
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Germany	3313.1	CAUTION! ;  can be replaced by same item from other companies
Name	Company	Catalog Number	Comments
EM analysis
Philips CM120 TEM	Philips/FEI
Morada CCD camera	Soft Imaging Systems, Germany
iTEM Ver. 5.2, imaging software	Soft Imaging Systems, Germany