口味偏好测定成人<em&gt;果蝇</em

摘要

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

摘要

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

引言

动物用chemosensation从不利条件，除了区分了有利条件。这种看法可能是这样的事情作为确定最好的食物来源，避免有毒物质或确定最佳的交配伙伴¹关键。 Chemosensation通常分为两种感官部分:嗅觉和味觉的感官。这些感官的主要鉴别特征是，嗅觉（气味）被使用，而味觉（味道）需要与非易失性基板的身体接触来样周围的气态化学环境。这两种形式的感官刺激而被处理，并在大脑中产生相应的吸引力或排斥行为²解码神经系统的反应。这些感官因此对动物生存至关重要。

果蝇果蝇是不断增长的普及在了解使用模式生物ING昆虫如何感知气味和滋味。果蝇由于可用于分子，细胞，和行为途径的解剖遗传工具的丰富提供优于其他模型系统的巨大的优势。在过去15年的工作一直在表征特定细胞的身份，神经元受体和信号参与了嗅觉和味觉机制特别的工具。现在， 果蝇遗传学的功率被用来进一步阐明这些过程是如何在单个神经元和单电路级^3-6编码。因此，它们提供了测定轻松打进改建感觉通路的读数是对这些字段的持续进步至关重要。

而大量的已知如何嗅觉信号进行编码并在大脑中处理的，要少得多理解有关在味觉通路类似的机制。我们在这里描述了可用于确定味道preferen一个协议行政长官在果蝇 ， 果蝇，像哺乳动物，一般喜欢甜味的化合物，而不是苦味化合物。这些食物源的任何组合可以在本实验设计来确定已知的遗传改变如何影响口味的选择可以利用。此外，药理学干预策略可以类似地评估其对动物的口味偏好效应。该测定的便利性和灵活性使得它有用的范例为理解在果蝇味觉感知的性质。

研究方案

1.饥饿

1. 制备通过在标飞小瓶的底部饱和18.2兆欧水棉球飞饥饿小瓶中。另外，同样在药瓶内的角度饱和滤纸的18.2MΩ水的地方一小片。
2. 收集到的苍蝇套〜100只的_二氧化碳垫，然后苍蝇添加到小瓶的准备。
   注意:最好的结果是用动物是少于5天获得。然而，动物的确切年龄可被控制作为实验变量，以确定随时间的口味偏好的变化。
3. 使用棉球或泡沫塞子以固定小瓶封闭。放在自己身边瓶在环境控制孵化器。保持在25℃的温度，并在70％以上的湿度。离开瓶触及24小时。

2.口味偏好分析

1. 制备用于测定所有促味剂在同一天一小号测试。
   注意:要使用将根据实验的问题各不相同的确切促味剂被要求。以下是在本协议所使用的例子促味剂。请参阅优化第4节。
   1. 结合10微升的100毫米蔗糖溶液，13微升的红色食用色素和977微升18.2MΩ水准备控制呈味物质（1毫米蔗糖）。
   2. 结合50微升100毫米蔗糖溶液，10微升蓝色食用色素，和940微升18.2MΩ水准备实验呈味物质（5毫米蔗糖）。
2. 使用以下述方式制备的标准的100毫米×15毫米的塑料陪替氏培养皿使测定室:
   1. 放置在12点和最靠近所述板的边缘控制促味剂的3个10微升滴在6点钟另一个3滴。确保液滴之间的间隔是相似的。
   2. 放置最靠近所述板的边缘实验促味剂的3个10微升滴在3点和一个其他3滴在9点钟。确保液滴之间的间隔是相似的。
   3. 根据需要重复尽可能多的重复步骤2.2.1和2.2.2。
3. 空1瓶〜100饿死的苍蝇到_的 CO ₂垫或许足够用来麻醉所有动物（约10秒）。刷动物进入事先准备好的测定室的中间，并与菜盖上盖子。
   应避免较长的CO ₂的曝光时间，以改善恢复时间和限制干扰取食行为:注意。暴露于冰（〜5分钟）可以用于麻醉，以避免可能由即使是有限的曝光产生_的 CO ₂的行为的效果。
4. 放置测定室在一个不透明的纸板箱。请务必使用条件和基因型被检测到标签的包装盒外面。
5. 将整个设置程序（从步骤2.4所含纸箱内测定室）到25℃的培养箱具有至少70％的湿度为2小时。
6. 重复步骤2.3到2.5的所有重复。
7. 2小时后，放置在测定室中，仍含有纸箱内，直接放入-20℃的冰箱，直到准备定量。

3.口味偏好量化分析

1. 允许单个测定室温至室温（约5分钟）。
2. 在解剖镜下，用刷子或钳子的基础上，其腹部的颜色组动物:红色，蓝色，紫色或清除（ 图1）。
3. 记录动物在每个分组的数目。考虑没有参加试验明确动物，因此不包括他们在任何计算。
4. 根据下列方程之一计算优先指标:
   1. 如果感兴趣的实验促味剂被添加到红色染料，然后用（N- _红色 + 0.5N _紫色 ）/（N _红色 + N _蓝色 + N _purplE）。
   2. 如果实验促味剂被添加到蓝色染料，然后调整公式（N- _蓝 + 0.5N _紫色 ）/（N _蓝色 + N _红色 + N _紫色 ）。
5. 重复计算所有的实验条件和重复。

4.口味偏好分析的优化

1. 经验确定的食品着色指标浓度被使用，因此食品着色不影响味道试验的结果，如下所示:
   1. 使用如步骤2.1所示相同的基化合物（ 例如 5毫米蔗糖）准备4促味，但省略了食用色素。
   2. 加1.3％的红色食品着色的促味剂的一种。使剩余的3促味剂在每个管不同浓度的蓝色食用色素（ 例如 ，0.6％，1％和1.3％）。
   3. 完整的协议步骤2.2至3.4为每对呈味物质:1.3％红与0.6％的蓝色; 1.3％的红色与1％蓝色和1.3％的红色与1.3％的蓝色。
   4. 重复步骤4.1.1-4.1.3与蓝色食用色素不同百分比直到偏好指数平均值为0（ 图2）的值。
      注:作为一个起点，再加上1％的蓝色食用色素1.3％的红色食用色素通常会产生良好的效果。如果蓝色食用色素没有令人满意的浓度可以匹配到1.3％的染料，则步骤4.1.1通过4.1.3可以与不同浓度的红色着色和蓝色食品着色恒定浓度的重复。
   5. 分析用相同的优化食用色素浓度待测试的所有条件。

结果

从口味偏好分析一些典型结果如下所示。在大多数实验中腹部着色强度的一些变化可以看出（ 图1）。在腹部是否强烈或弱任何色素被认为是一个积极的摄入。因此，建议研究者将比分动物盲目的实验条件，同时，以限制任何潜在的偏见。

同样重要的是要选择食品染料不影响优先测定的结果的浓度。的使用各种食?...

讨论

我们已经描述了一个简单而有效的协议，用于确定在果蝇味道偏好。在实验中经常使用这个实验版本，以确定感知不同品质（苦，甜，酸，咸和鲜味）呈味物质的味觉受体（GRS）的贡献。 果蝇基因组包含大约60个基因其通过选择性剪接^8,9-编码68鉴定味觉受体。然而，其他蛋白质，如离子型谷氨酸受体和TRP通道也被证明在味道^10-13中发挥作用。因此，在昆虫味道辨别能?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160