Gusto Preferenza Assay per adulti<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Abstract

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Introduzione

Gli animali usano chemosensation distinguere condizioni vantaggiose a parte condizioni svantaggiose. Questa percezione può essere fondamentale per cose come determinare la migliore fonte di cibo, evitando sostanze tossiche o determinare il miglior partner di accoppiamento ^1. Chemosensation è spesso diviso in due componenti sensoriali: olfatto e sensi gustative. Una principale caratteristica distintiva di questi sensi è che l'olfatto (odore) è usato per campionare l'ambiente chimico gassoso circostante mentre gustation (gusto) richiede il contatto fisico con un substrato non volatile. Entrambe le modalità sensoriali stimolano risposte neurologiche che vengono elaborati e decodificati nel cervello per produrre l'attrattiva o repulsiva comportamento appropriato ^2. Questi sensi sono quindi fondamentale per la sopravvivenza degli animali.

La mosca della frutta Drosophila melanogaster è un organismo modello che continua a crescere in popolarità per l'uso in capireing come gli insetti percepiscono odore e sapore. Frutta mosche offrono enormi vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per la ricchezza di strumenti genetici disponibili per la dissezione di percorsi molecolari, cellulari e comportamentali. Il lavoro nel corso degli ultimi 15 anni è stato particolarmente determinante nel caratterizzare le identità cellulari specifici, recettori neuronali, e meccanismi coinvolti sia in odore e il sapore di segnalazione. Ora, il potere della genetica della Drosophila viene usata per chiarire ulteriormente come questi processi sono codificati al singolo neurone e il circuito unico livello ^3-6. Pertanto, le analisi che forniscono facilmente lanciati letture di alterazioni percorsi sensoriali sono di vitale importanza per il continuo avanzamento di questi campi.

Mentre molto si sa su come i segnali olfattivi sono codificati ed elaborati nel cervello, e tanto meno è capito su meccanismi simili nel percorso gustativo. Descriviamo qui un protocollo che può essere utilizzato per verificare preferen gustoce in Drosophila. Drosophila, come i mammiferi, in genere preferiscono i composti di degustazione di dolci al contrario di composti sapore amaro. Qualsiasi combinazione di queste fonti di cibo può essere utilizzato in questo progetto sperimentale per determinare come note alterazioni genetiche influenzano la scelta gusto. Inoltre, le strategie di intervento farmacologico può analogamente essere valutati per i loro effetti sulla preferenza di gusto degli animali. La facilità e la flessibilità di questo test lo rende un paradigma utile per comprendere la natura della percezione gustativa in Drosophila.

Protocollo

1. fame

1. Preparare volare fiale fame saturando un batuffolo di cotone con 18,2 MW acqua sul fondo di una fiala mosca standard. In alternativa, allo stesso modo di saturare una piccola striscia di carta da filtro con 18,2 MW acqua e posto in un angolo all'interno della fiala.
2. Raccogliere vola in gruppi di circa 100 animali su un rilievo di CO ₂ e quindi aggiungere le mosche per una fiala preparato.
   Nota: i migliori risultati si ottengono con animali che sono meno di 5 giorni. Tuttavia, l'esatta età degli animali può essere controllata come variabile sperimentale per determinare le variazioni di preferenza di gusto nel tempo.
3. Utilizzare un batuffolo di cotone o schiuma tappo per fissare le fiale chiuse. Posizionare le fiale dalla loro parte in un incubatore ambiente controllato. Mantenere la temperatura a 25 ° C, e l'umidità superiore al 70%. Lascia fiale intatte per 24 ore.

2. Taste Preferenza Assay

1. Preparare tutti tastants per il saggio lo stesso giorno uns test.
   Nota: I tastants esatta da utilizzare varia a seconda domanda sperimentale viene chiesto. I seguenti sono esempi di tastants utilizzati in questo protocollo. Vedere la sezione 4 per ottimizzazioni.
   1. Preparare il controllo tastant (1 mM saccarosio) mediante la combinazione di 10 ml di 100 mm soluzione di saccarosio, 13 ml di colorante alimentare rosso, e 977 ml di 18,2 MW acqua.
   2. Preparare tastant sperimentale (5 mm saccarosio) mediante la combinazione di 50 ml di 100 mm soluzione di saccarosio, 10 ml di colorante alimentare blu, e 940 ml di 18,2 MW acqua.
2. Rendere camere dosaggio usando da 100 mm x 15 mm piatto di plastica standard di petri preparato nel seguente modo:
   1. Mettere tre gocce 10 microlitri di controllo tastant più vicino al bordo del piatto a ore 12 e un altro 3 gocce a ore 6. Assicurarsi che la distanza tra gocce è simile.
   2. Inserire tre gocce 10 microlitri di tastant sperimentale vicina al bordo della piastra a ore 3 e unaltri 3 gocce alle ore 9. Assicurarsi che la distanza tra gocce è simile.
   3. Ripetere i punti 2.2.1 e 2.2.2 per il numero di repliche, se lo desideri.
3. Vuoto 1 fiala di ~ 100 mosche di fame su un tappetino di CO ₂ giusto il tempo per anestetizzare gli animali (circa 10 sec). Spennellate gli animali in mezzo a una camera di test preparata e coprire con il coperchio piatto.
   Nota: più lunghi periodi di esposizione CO ₂ dovrebbe essere evitato per migliorare i tempi di recupero e l'interferenza con il limite di comportamento alimentare. L'esposizione al ghiaccio (~ 5 min) può essere utilizzato per anestetizzare per evitare _di CO ₂ effetti comportamentali che possono derivare da un'esposizione limitata.
4. Posizionare la camera di test in una scatola di cartone opaco. Assicurarsi di etichettare l'esterno della scatola con la condizione e il genotipo in fase di test.
5. Posizionare l'intera impostazione (camera di analisi contenuta in scatola di cartone a partire dal punto 2.4) in un incubatore a 25 ° con almeno il 70% di umidità per 2 ore.
6. Ripetere i passaggi 2.3 tramite 2.5 per tutte le repliche.
7. Dopo 2 ore, posizionare le camere di test, ancora contenuti in scatole di cartone, direttamente in un congelatore a -20 ° C fino al momento per la quantificazione.

3. Gusto Preferenza Assay Quantificazione

1. Lasciare una sola camera di test per riscaldare a temperatura ambiente (circa 5 min).
2. Sotto un microscopio dissezione, utilizzando un pennello o un paio di pinze, animali di gruppo in base al colore della loro addome: rosso, blu, viola o trasparente (Figura 1).
3. Registrare il numero di animali in ciascun gruppo. Considerare gli animali chiare per non hanno partecipato al test e quindi non includerli in tutti i calcoli.
4. Calcolare l'indice preferenza, secondo una delle seguenti formule:
   1. Se il tastant sperimentale di interesse viene aggiunto il colorante rosso, quindi utilizzare (N + _rosso 0,5N _viola) / (N + N _rosso N _{purpl blue} +e).
   2. Se il tastant sperimentale viene aggiunto il colorante blu, quindi regolare l'equazione (N _blu + 0,5 N _viola) / (N + N _{blu rosso} + N _viola).
5. Ripetere i calcoli per tutte le condizioni sperimentali e replicati.

4. Ottimizzazione del Gusto Preferenza Assay

1. Empiricamente determinare la concentrazione di indicatori colorante alimentare per essere utilizzato in modo colorante alimentare non influenza l'esito del test gusto, come segue:
   1. Preparare 4 tastants utilizzando la stessa mescola di base (ad esempio, 5 mM saccarosio), come indicato al punto 2.1, ma omettere il colorante alimentare.
   2. Aggiungere 1,3% colorante alimentare rosso per una delle sostanze sapide. Effettuare le restanti 3 tastants con prodotti alimentari blu coloranti di concentrazioni variabili in ogni tubo (ad esempio 0,6%, 1% e 1,3%).
   3. protocollo completo passi 2.2 attraverso 3.4 per ogni coppia tastant: 1,3% vs. 0,6% rosso blu; 1,3% rispetto al rosso 1% e il blu1,3% contro 1,3% rosso blu.
   4. Ripetere il passaggio 4.1.1-4.1.3 con diverse percentuali di colorante alimentare blu fino alle medie indice preferenza un valore pari a 0 (Figura 2).
      Nota: Come punto di partenza, 1,3% colorante alimentare rosso accoppiato con 1% colorante alimentare blu produce in genere buoni risultati. Se nessuna concentrazione soddisfacente di colorante alimentare blu può essere abbinato al 1,3% di colorante, poi passo 4.1.1 tramite 4.1.3 può essere ripetuta con concentrazioni variabili di colorazione rossa e una costante concentrazione di colorante alimentare blu.
   5. Analizzare tutte le condizioni per essere testati con le stesse concentrazioni di colorante alimentare ottimizzati.

Risultati

Alcuni risultati tipici da saggi di preferenza di gusto sono riportati di seguito. Nella maggior parte degli esperimenti qualche variazione di intensità di colorazione addominale sarà visto (Figura 1). Qualsiasi colorazione nell'addome se intensa o debole è considerato un ingestione positivo. E 'quindi consigliabile per i ricercatori a segnare animali, mentre ciechi alla condizione sperimentale in modo da limitare i potenziali errori.

Discussione

Abbiamo descritto un protocollo semplice ma efficace per determinare preferenza di gusto in Drosophila. Le versioni di questo test sono abitualmente utilizzati in esperimenti per determinare i contributi di recettori gustativi (GRS) a percepire le diverse qualità (amaro, dolce, acido, salato e umami) di composti di gusto. Il genoma di Drosophila contiene circa 60 geni che codificano 68 individuati recettori gustativi da splicing alternativo ^8,9. Tuttavia, altre proteine ​​come recettori...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160