성인을위한 맛의 기본 설정 분석<em&gt; 초파리</em

요약

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

초록

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

서문

동물 불리한 조건에서 떨어져 유리한 조건을 구별하는 chemosensation를 사용합니다. 이 인식은, 최고의 음식 소스를 결정하는 독성 물질을 피하거나 가장 짝짓기 파트너 ^{일을 결정하는} 등의 것들에 대한 중요 할 수 있습니다. 후각의 감각과 미각 감각 : Chemosensation은 종종 두 개의 감각 구성 요소로 나누어 져 있습니다. 이러한 감각의 주요 구별되는 특징은 후각 (냄새) 맛보기 (맛) 비 휘발성 기판과 물리적 접촉을 필요로하는 동안 주위의 가스 화학 환경을 샘플링하는 데 사용되는 것입니다. 두 감각 양식을 처리하고 적절한 매력적인 또는 ^{척력이 동작을} 생성하기 위해 뇌에서 디코딩되는 신경 반응을 자극한다. 이 감각은​​ 동물의 생존을위한 따라서 중요합니다.

초파리 비행 열매는 이해에 사용하기 위해 인기가 성장을 계속하고 모델 생물이다곤충은 냄새와 맛을 감지하는 방법을 보내고. 초파리 때문에, 분자 세포, 행동 경로의 해부에 사용할 유전 도구의 재산에 다른 모델 시스템에 비해 엄청난 장점을 제공한다. 지난 15 년 동안 작업은 특정 세포 정체성, 신경 수용체를 특성화하고, 냄새와 맛 모두에 관여하는 메커니즘을 신호에 특히 쓸모있다. 지금, 초파리 유전학의 힘은 더욱 이러한 프로세스는 하나의 신경 세포 및 단일 회로 레벨 ^3-6에서 코딩하는 방법을 명료하게 사용되고있다. 따라서, 제공하는 분석은 쉽게 감각 경로에 변화의 판독이 분야의 지속적인 사전에 매우 중요 얻었습니다.

많은 코딩 뇌에서 처리하는 방법 후각 신호에 대해 알려져 있지만, 훨씬 덜은 미각 경로와 유사한 메커니즘에 대한 이해된다. 우리는 여기서 맛 preferen을 확인하는 데 사용될 수있는 프로토콜을 설명쓴 맛 화합물 반대로 초파리. 초파리의 CE 마크는 포유 동물처럼, 일반적으로 달콤한 맛 화합물을 선호합니다. 이러한 음식 소스의 조합은 알려진 유전 적 변화가 맛 선택에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해이 실험 설계에 이용 될 수있다. 또한, 약리학 적 개입 전략은 유사 동물의 맛이 환경에 미치는 영향에 대해 평가 될 수있다. 이 분석의 용이성과 유연성 초파리 미각 지각의 특성을 이해하는 것이 유용에게 패러다임을 만든다.

프로토콜

1. 기아

1. 표준 플라이 유리 병의 하단에 18.2 MΩ 물 목화 공을 포화에 의해 기아 튜브를 비행 준비합니다. 다르게는, 유사 바이알 내의 각도 18.2 MΩ 물 장소 여과지의 작은 조각을 포화.
2. 준비된 유리 병에 파리를 추가 한 후 CO ₂ 패드 ~ 100 동물의 세트로 파리를 수집합니다.
   참고 : 최상의 결과 미만 5 일 이전입니다 동물 얻을 수있다. 그러나, 동물의 실제 나이는 시간에 기본 맛의 변화를 결정하는 변수로 실험을 제어 할 수있다.
3. 유리 병 폐쇄 확보하기 위해 목화 공 또는 거품 스토퍼를 사용합니다. 환경 제어 배양기에서 그들의 편에서 튜브를 놓습니다. 25 ° C의 온도, 70 % 이상의 습도를 유지한다. 24 시간 동안 그대로 튜브를 남겨주세요.

2. 맛 선호도 분석

1. 같은 날 A의 분석에 대한 모든 tastants 준비의 테스트.
   참고 : 실험 질문에 따라 달라집니다 사용되는 정확한 tastants이 요구된다. 다음은이 프로토콜에서 사용되는 예제 tastants 있습니다. 최적화를위한 부 (4)를 참조하십시오.
   1. 100 밀리미터 자당 용액 10 μL, 붉은 식용 색소의 13 μL, 18.2 MΩ 물 977 μl를 조합하여 제어 tastant (1 mM의 자당)을 준비합니다.
   2. 100 밀리미터 자당 용액 50 μL, 파란색 식용 색소의 10 μL, 18.2 MΩ 물 940 μl를 결합하여 실험 tastant (5 MM의 자당)을 준비합니다.
2. 다음과 같은 방법으로 제조 된 표준 100mm X 15mm의 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 분석을 챔버 :
   1. 12시 방향 판의 가장자리에 가까운 제어 tastant 세 10 μl의 방울, 6시 방향에 다른 3 방울을 배치합니다. 방울 사이의 간격이 유사하다는 것을 확인하십시오.
   2. 3시하고있는 플레이트의 가장자리에 가까운 실험 tastant 세 10 μL 방울을 배치다른 3 9시에 삭제합니다. 방울 사이의 간격이 유사하다는 것을 확인하십시오.
   3. 원하는대로 반복 많은 복제에 대한 2.2.1와 2.2.2 단계를 반복합니다.
3. 다만 충분히 모든 동물 (약 10 초)를 마취하는 CO ₂ 패드 상 ~ 100 굶주린 파리의 빈 1 병. 준비된 분석 챔버의 중앙으로 동물을 브러시와 접시의 뚜껑을 커버.
   주 : CO ₂ 노광 장기간의 공급 동작과 복구 시간 제한 및 간섭을 개선하기 위해 피해야한다. 얼음에 노출 (~ 5 분)의 제한에도 노출로부터 발생하는 CO ₂ 행동 효과를 피하기 위해 마취를 위해 사용될 수있다.
4. 불투명 한 골판지 상자에 분석 챔버를 놓습니다. 조건과 유전자형이 테스트되고 함께 상자의 외부에 라벨을해야합니다.
5. 2 시간 동안 적어도 70 % 습도와 25 ° C 배양기에 전체 설치 (단계 2.4에서 골판지 상자에 포함 된 분석 챔버)를 놓습니다.
6. 반복 모든 복제 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다.
7. 2시간 후, 직접 정량에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C 냉장고에 여전히 골 판지 상자에 포함 된 분석 챔버를 배치합니다.

3. 맛 특혜 분석의 정량화

1. 하나의 분석 챔버는 실온 (약 5 분)을 따뜻하게 할 수 있습니다.
2. 빨강, 파랑, 보라색 또는 클리어 (그림 1) : 해부 현미경, 브러시 또는 집게의 쌍을 사용하여, 그룹 동물 자신의 복부의 색상에 따라.
3. 각 그룹에서의 동물의 수를 기록한다. 어떤 계산에 포함하지 않는 때문에 분석에 참여하지 않은 명확한 동물을 고려합니다.
4. 하기 식 중 어느 한 항에있어서, 상기 선호 지수를 계산한다 :
   1. + N _블루 +의 N의 _purpl 관심의 실험 tastant가 붉은 염료에 추가되면, 사용 (N _빨간색 + 0.5N _보라색) / (N _레드전자).
   2. 실험 tastant가 파란색 염료에 추가되면, 다음 (N _{블루 보라색} + 0.5N) / (N _블루 + N _빨간색 + N _{보라색)에} 식을 조정합니다.
5. 모든 실험 조건 및 복제에 대한 계산을 반복합니다.

맛의 기본 설정 분석 4. 최적화

1. 경험적 식용 색소가 맛이 분석의 결과에 영향을주지 않도록 다음과 같이 사용되는 식용 색소 지표의 농도를 결정 :
   1. 단계 2.1로 표시된 동일한 염기 화합물 (예, 5 mM의 크로스)를 사용하여 4 tastants 준비했지만 식용 색소를 생략.
   2. tastants 중 하나에 1.3 % 붉은 식용 색소를 추가합니다. 각 튜브에 다양한 농도의 파란색 식용 색소 (예 : 0.6 %, 1 %, 1.3 %)와 나머지 3 tastants합니다.
   3. 전체 프로토콜은 각 tastant 쌍 3.4을 통해 2.2 단계 : 0.6 % 청색 1.3 %, 적색 대; 1.3 % 빨간색 대 1 % 파란색과1.3 % 빨간색 대 1.3 % 파란색.
   4. 선호 지수 평균 때까지 파란색 식용 색소의 다른 비율을 0 (그림 2)의 값이 단계를 반복 4.1.1-4.1.3.
      참고 : 시작 지점으로, 1 % 파란색 식용 색소와 결합 1.3 % 빨간색 식용 색소는 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 파란색 식용 색소의 만족스러운 농도가 1.3 % 염료와 일치 할 수없는 경우, 4.1.3을 통해 4.1.1이 붉은 색과 파란색 식용 색소의 일정한 농도의 다양한 농도로 반복 될 수있다 단계.
   5. 같은 최적화 된 식용 색소의 농도 테스트 할 모든 조건을 분석합니다.

결과

맛을 선호 분석에서 몇 가지 전형적인 결과는 다음과 같습니다. 대부분의 실험에서 복부 색상의 강도에 약간의 변화는 (그림 1) 볼 수 있습니다. 강한 또는 약한 여부 복부의 모든 색상이 양의 섭취로 간주됩니다. 잠재적 인 편견을 제한하기 위해 연구자들은 실험 조건에있는 동안 블라인드 동물을 득점하는 것은 그러므로 것이 좋습니다.

토론

우리는 초파리 취향 우선 순위를 결정하기위한 단순하지만 효율적인 프로토콜을 설명 하였다. 이 분석의 버전은 정기적으로 맛 화합물 (쓴맛, 단맛, 신맛, 짠맛,​​ 감칠맛과) 다른 특성을 지각에 미각 수용체 (GRS)의 기여를 결정하기 위해 실험에 사용된다. 초파리 게놈 대체 접합 ^8,9에 의해 68 식별 미각 수용체를 인코딩 약 60 유전자가 포함되어 있습니다. 그러나, 이러한 이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160