Geschmackspräferenz Assay für Erwachsene<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Zusammenfassung

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Einleitung

Tiere verwenden Chemosensorik vorteilhaften Bedingungen zu unterscheiden, abgesehen von ungünstigen Bedingungen. Diese Wahrnehmung kann für solche Dinge entscheidend sein , wie die beste Nahrungsquelle zu bestimmen, die Vermeidung toxischer Substanzen oder zur Bestimmung der besten Paarungspartner ^1. Chemosensorik wird oft in zwei sensorische Komponenten aufgeteilt: Geruchssinn und Geschmacks-Sinne. Ein Hauptunterscheidungsmerkmal dieser Sinne ist, dass olfaction (Geruch) die umgebende gasförmige chemische Umgebung verwendet wird, zu probieren, während gustation (Geschmack) physischen Kontakt mit einem nichtflüchtigen Substrat erfordert. Beide sensorischen Modalitäten stimulieren neurologische Reaktionen , die verarbeitet werden und im Gehirn dekodiert die entsprechende anziehende oder abstoßende Verhalten ² zu erzeugen. Diese Sinne sind daher von entscheidender Bedeutung für das Überleben der Tiere.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Modellorganismus, der in der Popularität für den Einsatz weiter zu wachsen in verstehening, wie Insekten Geruch und Geschmack wahrnehmen. Fruchtfliegen bieten enorme Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen aufgrund der Fülle von genetischen Werkzeuge zur Verfügung, für das Aufschneiden der molekularen, zellulären und Verhaltenswege. Arbeit in den letzten 15 Jahren hat sich besonders dazu beigetragen, die spezifische zelluläre Identitäten bei der Charakterisierung, neuronale Rezeptoren und Signal beide Mechanismen, die in Geruch und Geschmack. Nun ist die Macht der Drosophila Genetik verwendet wird , um weiter erläutern , wie diese Prozesse im einzelnen Neurons und einzelne Schaltungsebene codiert sind ^3-6. Daher Assays, die Ablesungen von Veränderungen an sensorischen Bahnen vital dieser Felder auf die anhaltende Fortschritt sind leicht erzielt bieten.

Während viel über bekannt ist, wie olfaktorische Signale werden im Gehirn kodiert und verarbeitet werden, viel weniger über ähnliche Mechanismen in der Geschmacks- Weg verstanden. Wir beschreiben hier ein Protokoll, das verwendet werden kann, Geschmack preferen zu ermittelnce in Drosophila. Drosophila, wie Säugetiere, bevorzugen in der Regel süß schmeckende Verbindungen als zu bitter schmeckenden Verbindungen gegenüber . Jede Kombination dieser Nahrungsquellen können in diesem Versuchsdesign verwendet werden, um festzustellen, wie bekannte genetische Veränderungen Geschmack Wahl beeinflussen. Zusätzlich können pharmakologische Interventionsstrategien in ähnlicher Weise auf ihre Wirkungen auf Tiere Geschmackspräferenz bewertet werden. Die Leichtigkeit und Flexibilität dieses Assays ist es ein nützliches Paradigma für die Natur der gustatory Wahrnehmung in Drosophila zu verstehen.

Protokoll

1. Starvation

1. Bereiten Sie Hunger Fläschchen fliegen durch einen Wattebausch mit 18,2 MOhm Wasser am Boden eines Standard-Fliegen Fläschchen zu sättigen. Alternativ in ähnlicher Weise einen kleinen Streifen aus Filterpapier mit 18,2 MOhm Wasser und in einem Winkel in der Phiole zu sättigen.
2. Sammeln Sie Fliegen in Gruppen von ~ 100 Tiere auf einem CO ₂ Pad und fügen Sie dann die Fliegen auf einem vorbereiteten Fläschchen.
   Hinweis: Die besten Ergebnisse werden mit den Tieren erhalten, die weniger als 5 Tage alt sind. Jedoch kann die genaue Alter der Tiere als experimentelle Variable gesteuert werden, um Änderungen in Geschmack bevorzugt im Laufe der Zeit zu bestimmen.
3. Verwenden Sie einen Wattebausch oder Schaumstoffstopper zu sichern die Fläschchen verschlossen. Legen Sie Fläschchen auf ihrer Seite in einem umwelt kontrollierten Inkubator. Man hält die Temperatur bei 25 ° C und die Feuchtigkeit über 70%. Lassen Sie Fläschchen unberührt für 24 Stunden.

2. Geschmackspräferenz Assay

1. Bereiten Sie alle tastants für den Test am selben Tag eins-Tests.
   Hinweis: Die genauen tastants verwendet werden, je nach Versuchs Frage variieren gefragt. Im Folgenden sind beispiels tastants in diesem Protokoll verwendet. Siehe Abschnitt 4 für Optimierungen.
   1. Bereiten Kontrolle Geschmacksträger (1 mM Saccharose) von 10 & mgr; l von 100 mM Saccharose-Lösung kombiniert, 13 ul rote Lebensmittelfarbe, und 977 & mgr; l von 18,2 M & Omega; Wasser.
   2. Bereiten Sie experimentellen Geschmacksträger (5 mM Saccharose) von 50 & mgr; l von 100 mM Saccharose-Lösung kombiniert, 10 ul blauen Lebensmittelfarbe, und 940 & mgr; l von 18,2 M & Omega; Wasser.
2. Machen Assaykammern unter Verwendung eines Standard 100 mm x 15 mm Kunststoff-Petrischale in der folgenden Weise hergestellt:
   1. Platzieren Sie drei 10 ul Tropfen Steuergeschmacksträger am nächsten zu dem Rand der Platte um 12 Uhr und weitere 3 Tropfen bei 6 Uhr. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen den Tropfen ähnelt.
   2. Platzieren drei 10 ul Tropfen experimentellen Geschmacksträger am nächsten zu der Kante der Platte bei 3 Uhr und einandere 3 fällt um 9 Uhr. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen den Tropfen ähnelt.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 und 2.2.2 für so viele Wiederholungen wie gewünscht.
3. Leer 1 Flasche ~ 100 verhungert Fliegen auf einen CO ₂ Pad gerade lang genug , um alle Tiere zu betäuben (ca. 10 sec). Bürsten Sie die Tiere in die Mitte eines vorbereiteten Testkammer und Deckel mit dem Schalendeckel.
   Hinweis: Längere CO ₂ Exposition sollte vermieden werden , um Erholungszeit und Begrenzung Interferenzen mit dem Fressverhalten zu verbessern. Die Exposition gegenüber Eis (~ 5 min) für anesthetizing verwendet werden , um CO ₂ Verhaltenseffekte zu vermeiden , die von selbst eine begrenzte Exposition entstehen können.
4. Legen Sie die Testkammer in einem undurchsichtigen Karton. Achten Sie darauf, die außerhalb der Box mit der Bedingung und Genotyp getestet zu beschriften.
5. Platzieren Sie die gesamte Einrichtung (Testkammer enthalten innerhalb Karton aus Schritt 2.4) in einen 25 ° C-Inkubator mit mindestens 70% Feuchtigkeit für 2 Stunden.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.5 für alle Wiederholungen.
7. Nach 2 Stunden, legen Sie die Testkammern, noch in Kartons enthalten sind, direkt in einem -20 ° C Gefrierschrank bis sie bereit zur Quantifizierung.

3. Geschmackspräferenz Assay Quantifizierung

1. Lassen Sie einen einzigen Test Kammer auf Raumtemperatur erwärmen (ca. 5 min).
2. Unter einem Präpariermikroskop, einer Bürste oder einem Paar Pinzette, Gruppe Tiere auf der Grundlage der Farbe ihres Bauches: rot, blau, violett oder klar (Abbildung 1).
3. Notieren Sie die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe. Betrachten wir klare Tiere wurden nicht in den Test teilgenommen und deshalb sind sie nicht in allen Berechnungen.
4. Berechne den Vorzugsindex nach einer der folgenden Gleichungen:
   1. Wenn die experimentelle Geschmacksträger von Interesse für den roten Farbstoff zugesetzt wird, dann verwenden (N _rot + 0,5 N _lila) / (N _rot + _blau N + N _purple).
   2. Wenn die experimentelle Geschmacksträger auf den blauen Farbstoff hinzugefügt wird, und stellen Sie dann die Gleichung (N _blau + 0,5 N _lila) / (N + N _{blau rot} + N _violett).
5. Wiederholen Sie die Berechnungen für alle experimentellen Bedingungen und Replikate.

4. Optimierung der Geschmackspräferenz Assay

1. Empirisch bestimmen verwendet werden, um die Konzentration von Lebensmittelfarbe Indikatoren so Lebensmittelfarbe nicht das Ergebnis des Geschmackstest wirkt sich wie folgt:
   1. Bereiten Sie 4 tastants die gleiche Basis - Verbindung (zB 5 mM Saccharose) , wie in Schritt angegeben 2.1, aber lassen Sie die Lebensmittelfarbe.
   2. In 1,3% rote Lebensmittelfarbe auf eine der tastants. Nehmen Sie die restlichen 3 tastants mit blauen Lebensmittelfarbe von unterschiedlichen Konzentrationen in jedem Röhrchen (zB 0,6%, 1% und 1,3%).
   3. Vollständige Protokollschritte 2.2 bis 3.4 für jedes Paar Geschmacksträger: 1,3% rot vs. 0,6% blau; 1,3% rot vs. 1% blau und1,3% rot vs. 1,3% blau.
   4. Wiederholen Sie Schritt 4.1.1-4.1.3 mit unterschiedlichen Prozentsätzen der blauen Lebensmittelfarbe , bis die Präferenz - Index Mittelwerte ein Wert von 0 (Abbildung 2).
      Hinweis: Als Ausgangspunkt, um 1,3% rote Lebensmittelfarbe in Verbindung mit 1% blau Lebensmittelfarbe der Regel gute Ergebnisse liefert. Wenn keine befriedigende Konzentration an blauen Lebensmittelfarbe kann auf 1,3% Farbstoff angepaßt werden, wird im Schritt 4.1.1 bis 4.1.3 mit variierenden Konzentrationen von roten Färbung und eine konstante Konzentration an blauen Lebensmittelfarbe wiederholt werden.
   5. Analyse alle Bedingungen mit den gleichen optimierten Lebensmittelfarbe Konzentrationen getestet werden.

Ergebnisse

Einige typische Ergebnisse von Geschmackspräferenz Assays sind unten dargestellt. In den meisten Experimenten wird eine gewisse Variation in der Intensität der abdominalen Färbung zu sehen (Abbildung 1). Jede Färbung im Bauch, ob intensiv oder schwach ist, eine positive Aufnahme in Betracht gezogen. Es ist daher ratsam, für Forscher Tiere während blind für die experimentellen Bedingungen zu erzielen, um mögliche Verzerrungen zu begrenzen.

Diskussion

Wir haben für die Bestimmung Geschmackspräferenz in Drosophila eine einfache aber effektive Protokoll beschrieben. Versionen dieses Tests werden routinemäßig in Experimenten verwendet, die Beiträge von Geschmacks- Rezeptoren (GRS) zur Wahrnehmung der verschiedenen Qualitäten (bitter, süß, sauer, salzig und umami) Geschmacksverbindungen zu bestimmen. Das Drosophila - Genom enthält etwa 60 Gene , die ^8,9 68 identifiziert Geschmacks- Rezeptoren durch alternatives Spleißen kodieren. Al...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160