Ensaio de Preferência gosto para Adulto<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Resumo

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Introdução

Animais usar chemosensation distinguir condições vantajosas para além de condições desvantajosas. Esta percepção pode ser crítico para coisas como determinar a melhor fonte de alimento, evitando substâncias tóxicas ou determinar o melhor parceiro de acasalamento ^1. Chemosensation é frequentemente dividida em dois componentes sensoriais: olfato e sentidos gustativos. A principal característica distintiva desses sentidos é que o olfato (cheiro) é usado para provar o ambiente químico gasoso circundante, enquanto gustação (gosto) requer contato físico com um substrato não-volátil. Ambas as modalidades sensoriais estimular respostas neurológicas que são tratados e descodificados no cérebro para produzir o comportamento atração ou repulsão adequada ^2. Estes sentidos são, portanto, fundamental para a sobrevivência animal.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um organismo modelo que continua a crescer em popularidade para o uso em compreendering como insetos perceber cheiro e sabor. As moscas de fruta oferecem enormes vantagens sobre outros sistemas modelo devido à riqueza de ferramentas genéticas disponíveis para a dissecção das vias moleculares, celulares e comportamentais. Trabalho ao longo dos últimos 15 anos tem sido particularmente instrumental na caracterização das identidades celulares específicos, receptores neuronais e mecanismos envolvidos, tanto cheiro e sabor sinalização. Agora, o poder da genética de Drosophila está sendo usado para elucidar como esses processos são codificados no neurônio único e circuito único nível ^3-6. Assim, ensaios que fornecem assim marcou leituras de alterações de vias sensoriais são vitais para o avanço contínuo destes campos.

Embora uma grande parte se sabe sobre como os sinais olfativos são codificados e processados ​​no cérebro, e muito menos se sabe sobre mecanismos semelhantes na via gustativa. Descrevemos aqui um protocolo que pode ser usado para determinar preferen gustativasce em Drosophila. Drosophila, como mamíferos, geralmente preferem compostos sabor doce ao invés de compostos sabor amargo. Qualquer combinação destas fontes de alimentos podem ser utilizados na presente concepção experimental para determinar como alterações genéticas conhecidas afectar a escolha gosto. Além disso, as estratégias de intervenção farmacológica semelhante pode ser avaliada pelos seus efeitos sobre a preferência de paladar dos animais. A facilidade e flexibilidade deste ensaio torna um paradigma útil para a compreensão da natureza da percepção gustativa em Drosophila.

Protocolo

1. A fome

1. Prepare mosca frascos de fome saturando uma bola de algodão com 18,2 mohms de água no fundo de um frasco de mosca padrão. Alternativamente, semelhante saturar uma pequena tira de papel de filtro com 18,2 mohms água e coloque em um ângulo dentro do frasco.
2. Recolha moscas em conjuntos de ~ 100 animais em uma almofada de CO ₂ e em seguida, adicione as moscas para um frasco preparado.
   Nota: Os melhores resultados são obtidos com os animais que são menos do que 5 dias de idade. No entanto, a idade exacta dos animais pode ser controlada como uma variável de experimental para determinar mudanças na preferência do gosto ao longo do tempo.
3. Use uma rolha bola de algodão ou espuma para proteger os frascos fechados. Coloque os frascos em seu lado em uma incubadora de ambiente controlado. Manter a temperatura a 25 ° C, e a humidade superior a 70%. Deixar frascos intocadas durante 24 h.

2. Taste Ensaio Preferências

1. Preparar todas as saborizantes para o ensaio no mesmo dia ums testes.
   Nota: Os tastants exatos a serem usados ​​irão variar dependendo da pergunta experimental ser perguntado. Os seguintes são exemplos de saborizantes utilizados neste protocolo. Ver secção 4 para otimizações.
   1. Prepare o controle saborizante (sacarose 1 mM) através da combinação de 10 ml de solução de sacarose 100 mM, 13 ul de corante vermelho, e 977 ul de 18,2 mohms água.
   2. Prepare saborizante experimental (sacarose a 5 mM) ao combinar 50 ul de solução de sacarose 100 mM, 10 ul de corante azul de alimentos, e 940 ul de água 18,2 mohms.
2. Adicione câmaras de ensaio com 100 mm x 15 milímetros prato de petri de plástico padrão preparado da seguinte forma:
   1. Coloque três gotas de 10 ul de saborizante de controle mais próximo da borda da placa às 12 horas e mais 3 gotas às 6 horas. Assegure-se que o espaçamento entre as quedas é semelhante.
   2. Coloque três gotas de 10 ul de saborizante experimental mais próximo do bordo da placa de 03:00 e umoutros 3 gotas às 9 horas. Assegure-se que o espaçamento entre as quedas é semelhante.
   3. Repita os passos 2.2.1 e 2.2.2 para tantas repetições como desejado.
3. Vazio 1 frasco de ~ 100 moscas famintas em uma almofada de CO ₂ apenas o tempo suficiente para anestesiar todos os animais (aproximadamente 10 segundos). Escovar os animais no meio de uma câmara de ensaio preparada e cobrir com a tampa prato.
   Nota: longos períodos de exposição ao CO ₂ deve ser evitada para melhorar o tempo de recuperação e interferência limite com o comportamento alimentar. A exposição ao gelo (~ 5 min) pode ser usado para anestesiar para evitar CO ₂ efeitos comportamentais que podem surgir de uma exposição limitada.
4. Coloque a câmara de ensaio em uma caixa de papelão opaco. Certifique-se de rotular o exterior da caixa com a condição e genótipo que está sendo testado.
5. Coloque a configuração inteira (câmara de ensaio contido dentro da caixa de cartão a partir do passo 2.4) em uma incubadora a 25 ° C com, pelo menos, 70% de humidade durante 2 h.
6. Repita os passos 2.3 através de 2.5 para todas as repetições.
7. Após 2 horas, colocar as câmaras de ensaio, ainda contidos dentro de caixas de cartão, directamente num congelador a -20 ° C até estar pronto para a quantificação.

3. Taste Quantificação Preferência Assay

1. Permitir que uma única câmara de ensaio a aquecer até à temperatura ambiente (aproximadamente 5 min).
2. Sob um microscópio de dissecação, usando um pincel ou um par de fórceps, animais do grupo com base na cor de seu abdômen: vermelho, azul, roxo ou clara (Figura 1).
3. Grave o número de animais de cada grupo. Considere animais claras para não participaram no ensaio e, portanto, não incluí-los em todos os cálculos.
4. Calcular o índice de preferência de acordo com uma das equações seguintes:
   1. Se o saborizante experimental de interesse é adicionado ao corante vermelho, em seguida, usar (N _vermelho + 0,5 N _roxo) / (N _vermelho + N _azul + N _purple).
   2. Se o saborizante experimental é adicionado ao corante azul, em seguida, ajuste a equação (N _azul + 0,5 N _roxo) / (N _azul + N _vermelho + N _roxo).
5. Repita os cálculos para todas as condições experimentais e repetições.

4. Optimization of Taste Preferências Assay

1. Empiricamente determinar a concentração de indicadores de coloração de alimentos para ser usado de modo corante alimentar não afecta o resultado do ensaio de gosto, como se segue:
   1. Prepare saborizantes 4 utilizando o mesmo composto de base (por exemplo, sacarose a 5 mM), conforme indicado na etapa 2.1, mas omitindo o corante alimentar.
   2. Adicionar 1,3% corante vermelho para um dos saborizantes. Adicione os restantes 3 ​​saborizantes com corante alimentar azul de várias concentrações em cada um dos tubos (por exemplo, 0,6%, 1% e 1,3%).
   3. protocolo completo as etapas de 2.2 a 3.4 para cada par saborizante: 1,3% vs. 0,6% vermelho azul; 1,3% vs. vermelho 1% de azul e1,3% vs. 1,3% vermelho azul.
   4. Repita o passo 4.1.1-4.1.3 com diferentes porcentagens de coloração de alimento azul até as médias preferência índice Um valor de 0 (Figura 2).
      Nota: Como ponto de partida, de 1,3% corante vermelho juntamente com 1% de azul corante alimentar normalmente produz bons resultados. Se há concentração satisfatória de coloração de alimento azul pode ser correspondido a 1,3% de corante, então passo 4.1.1 através 4.1.3 pode ser repetido com concentrações variadas de coloração vermelha e uma concentração constante de coloração de alimento azul.
   5. Analisar todas as condições a serem testadas com as mesmas concentrações de corante alimentar otimizados.

Resultados

Alguns resultados típicos de ensaios de preferência do gosto são mostrados abaixo. Na maioria das experiências alguma variação na intensidade de coloração abdominal será visto (Figura 1). Qualquer coloração no abdómen se intensa ou fraca é considerada uma ingestão positivo. Portanto, é aconselhável para os investigadores para marcar animais, enquanto cegos à condição experimental, de modo a limitar os potenciais vieses.

Discussão

Nós descrevemos um protocolo simples, mas eficaz para determinar a preferência gosto em Drosophila. Versões deste ensaio são rotineiramente usados ​​em experimentos para determinar as contribuições dos receptores gustativos (GRS) para perceber as diferentes qualidades (amargo, doce, azedo, salgado e umami) de compostos de gosto. O genoma de Drosophila contém cerca de 60 genes que codificam receptores gustativos 68 identificados por splicing alternativo ^8,9. No entanto, outras prot...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160