Goût préférence Essai pour adultes<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Résumé

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Introduction

Les animaux utilisent chemosensation pour distinguer des conditions avantageuses en dehors des conditions désavantageuses. Cette perception peut être critique pour des choses telles que la détermination de la meilleure source alimentaire, en évitant les substances toxiques ou de déterminer le meilleur partenaire d'accouplement ^1. Chemosensation est souvent divisée en deux composants sensoriels: sens olfactif et les sens gustatifs. Une principale caractéristique distinctive de ces sens est que l'olfaction (odorat) est utilisé pour échantillonner l'environnement chimique gazeux environnant tout gustation (goût) nécessite un contact physique avec un substrat non volatile. Les deux modalités sensorielles stimulent les réponses neurologiques qui sont traités et décodés dans le cerveau pour produire le comportement attractives ou répulsives appropriée ^2. Ces sens sont donc essentiels pour la survie des animaux.

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un organisme modèle qui continue de croître en popularité pour une utilisation dans comprendrement comment les insectes perçoivent l'odeur et le goût. Les mouches des fruits offrent d'énormes avantages par rapport aux autres systèmes de modèles en raison de la richesse des outils génétiques disponibles pour la dissection des voies moléculaires, cellulaires et comportementales. Le travail au cours des 15 dernières années a été particulièrement important dans la caractérisation des identités cellulaires spécifiques, des récepteurs neuronaux, et les mécanismes impliqués à la fois l'odeur et le goût de signalisation. Maintenant, la puissance de la génétique chez la drosophile est utilisée pour élucider la façon dont ces processus sont codés au neurone unique et un seul circuit niveau ^3-6. Par conséquent, les essais qui fournissent facilement marqué des lectures altérations des voies sensorielles sont essentielles à l'avance continue de ces champs.

Alors que beaucoup est connu sur la façon dont les signaux olfactifs sont codées et traitées dans le cerveau, beaucoup moins, on entend à propos des mécanismes similaires dans la voie de gustatifs. Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour déterminer le goût préférenCE chez la drosophile. Drosophila, comme les mammifères, préfèrent généralement composés de goût sucré , par opposition à des composés de goût amer. Toute combinaison de ces sources de nourriture peut être utilisée dans cette conception expérimentale pour déterminer comment des altérations génétiques connues affectent le choix du goût. En outre, les stratégies d'intervention pharmacologiques peuvent être évalués de manière similaire pour leurs effets sur la préférence du goût des animaux. La facilité et la flexibilité de ce test, il est un paradigme utile pour comprendre la nature de la perception gustative chez la drosophile.

Protocole

1. Starvation

1. Préparer voler des flacons de famine en saturant une boule de coton avec 18,2 MQ eau au fond d'un flacon de mouche standard. Alternativement, saturer de même une petite bande de papier filtre avec 18,2 MQ eau et lieu à un angle dans le flacon.
2. Recueillir les mouches dans des ensembles de ~ 100 animaux sur un coussin de CO _2, puis ajouter les mouches à un flacon préparé.
   Remarque: Les meilleurs résultats sont obtenus avec les animaux qui sont âgés de moins de 5 jours. Cependant, l'âge exact des animaux peut être contrôlée comme une variable expérimentale pour déterminer les changements dans les préférences des goûts au fil du temps.
3. Utiliser une boule de coton ou de mousse bouchon pour fixer les flacons fermés. Placez les flacons de leur côté dans un incubateur à environnement contrôlé. Maintenir la température à 25 ° C et le taux d'humidité supérieur à 70%. Laisser les flacons intacts pendant 24 heures.

2. Goût préférence Assay

1. Préparer tous sapides pour le test le même jour uns tests.
   Remarque: Les tastants exactes à utiliser varie en fonction de la question expérimentale posées. Ce qui suit est un exemple tastants utilisés dans ce protocole. Voir la section 4 pour les optimisations.
   1. Préparer le contrôle exhausteur de goût (1 mM de saccharose) en combinant 10 ul de 100 mM solution de saccharose, 13 pi de colorant alimentaire rouge, et 977 pi de 18,2 MQ eau.
   2. Préparer exhausteur de goût expérimental (5 mM de saccharose) en combinant 50 ul de 100 mM solution de saccharose, 10 pi de colorant alimentaire bleu, et 940 pi de 18,2 MQ eau.
2. Faire des chambres d'essai en utilisant un x 15 mm plat en plastique de Pétri 100 mm standard préparé de la manière suivante:
   1. Placez trois 10 gouttes ul de contrôle exhausteur de goût le plus proche du bord de la plaque à 12 heures et un autre 3 gouttes à 6 heures. Assurez-vous que l'espacement entre les gouttes est similaire.
   2. Placez trois 10 gouttes ul d'exhausteur de goût expérimental le plus proche du bord de la plaque à 3 heures et uneautre 3 gouttes à 9 heures. Assurez-vous que l'espacement entre les gouttes est similaire.
   3. Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 pour autant de répétitions que désiré.
3. Empty 1 flacon de ~ 100 mouches affamées sur un tampon juste assez longtemps pour anesthésier les animaux (environ 10 sec) CO _2. Badigeonner les animaux dans le milieu d'une chambre de dosage préparée et couvrir avec le couvercle plat.
   Remarque: plus longue période de CO ₂ l' exposition doit être évitée afin d' améliorer le temps de récupération et de limiter les interférences avec le comportement alimentaire. L' exposition à la glace (~ 5 min) peut être utilisé pour anesthésier pour éviter CO ₂ effets comportementaux qui peuvent découler de même exposition limitée.
4. Placer la chambre de dosage dans une boîte en carton opaque. Assurez-vous d'étiqueter l'extérieur de la boîte avec la condition et le génotype testé.
5. Placer l'ensemble de l'installation (chambre dosage contenue dans une boîte en carton à l'étape 2.4) dans un incubateur à 25 ° d'au moins 70% d'humidité pendant 2 heures.
6. Répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour toutes les répétitions.
7. Après 2 heures, placer les chambres d'analyse, encore contenus dans des boîtes en carton, directement dans un -20 ° C au congélateur jusqu'au moment pour la quantification.

3. Goût préférence Assay Quantification

1. Permettre une chambre de dosage unique se réchauffer à la température ambiante (environ 5 min).
2. Sous un microscope de dissection, en utilisant une brosse ou une paire de pinces, les animaux du groupe sur la base de la couleur de leur abdomen: rouge, bleu, violet ou clair (Figure 1).
3. Notez le nombre d'animaux dans chaque groupe. Considérer les animaux claires de ne pas avoir participé à l'essai, et donc ne pas les inclure dans les calculs.
4. Calculer l'indice de préférence selon l'une des équations suivantes:
   1. Si l'exhausteur de goût expérimental d'intérêt est ajouté au colorant rouge, puis utilisez (N _rouge + 0,5N _violet) / (N + N _{rouge bleu} + N _purple).
   2. Si l'exhausteur de goût expérimental est ajouté au colorant bleu, puis ajuster l'équation (N _bleu + 0,5N _violet) / (N + N _{bleu rouge} + N _violet).
5. Répéter les calculs pour toutes les conditions expérimentales et répétitions.

4. Optimisation du Goût Préférence Assay

1. Déterminer empiriquement la concentration des indicateurs de colorants alimentaires à être utilisé si le colorant alimentaire ne modifie pas les résultats de l'essai de goût, de la manière suivante:
   1. Préparer 4 tastants en utilisant le même composé de base (par exemple mM de sucrose 5) comme indiqué dans l' étape 2.1, mais omettre le colorant alimentaire.
   2. Ajouter 1,3% colorant alimentaire rouge à l'un des sapides. Faire les 3 tastants restants avec colorant alimentaire bleu de concentrations variables dans chaque tube (par exemple 0,6%, 1% et 1,3%).
   3. protocole complète les étapes 2.2 à 3.4 pour chaque paire exhausteur de goût: 1,3% contre 0,6% rouge bleu; 1,3% contre 1% rouge et bleu1,3% contre 1,3% rouge bleu.
   4. Répétez l' étape 4.1.1-4.1.3 avec différents pourcentages de colorant alimentaire bleu jusqu'à ce que les moyennes de l' indice de préférence une valeur de 0 (Figure 2).
      Remarque: En tant que point de départ, 1,3% du colorant alimentaire rouge couplé avec 1% de colorant alimentaire bleu donne généralement de bons résultats. Si aucune concentration satisfaisante de colorant alimentaire bleu peut être adaptée à 1,3% de colorant, puis l'étape 4.1.1 à travers 4.1.3 peut être répété avec des concentrations variables de colorant rouge et une concentration constante de colorant alimentaire bleu.
   5. Analyser toutes les conditions à tester avec les mêmes concentrations optimisées de colorant alimentaire.

Résultats

Quelques résultats typiques de goût des tests de préférence sont présentés ci-dessous. Dans la plupart des expériences une certaine variation de l'intensité de la coloration abdominale On voit (figure 1). Toute coloration dans l'abdomen si intense ou faible est considéré comme une ingestion positive. Il est donc conseillé aux chercheurs de marquer les animaux tout en aveugle à la condition expérimentale afin de limiter les biais potentiels.

Discussion

Nous avons décrit un protocole simple mais efficace pour déterminer la préférence de goût chez la drosophile. Les versions de ce test sont couramment utilisés dans des expériences pour déterminer les contributions des récepteurs gustatifs (Grs) pour percevoir les différentes qualités (amer, sucré, acide, salé et umami) des composés de goût. Le génome de la Drosophile contient environ 60 gènes qui codent pour 68 récepteurs gustatifs identifiés par l' épissage alternatif ^8,9....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160