Ensayo Preferencia gusto por adulto<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Resumen

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Introducción

Los animales usan para distinguir chemosensation condiciones ventajosas, aparte de las condiciones desventajosas. Esta percepción puede ser crítico para cosas tales como la determinación de la mejor fuente de alimento, evitar sustancias tóxicas o determinar el mejor socio de acoplamiento ^1. Chemosensation a menudo se divide en dos componentes sensoriales: sentidos olfativos y gustativos sentidos. Un principal característica distintiva de estos sentidos es que el olfato (olor) se utiliza para muestrear el ambiente químico gaseoso circundante mientras gustation (sabor) requiere contacto físico con un sustrato no volátil. Ambas modalidades sensoriales estimulan respuestas neurológicas que son tratados y decodificados en el cerebro para producir el comportamiento de atracción o repulsión adecuada ^2. Estos sentidos son de importancia crítica para la supervivencia del animal.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un organismo modelo que sigue creciendo en popularidad para su uso en entendering cómo los insectos perciben olor y sabor. moscas de la fruta ofrecen enormes ventajas sobre otros sistemas modelo debido a la gran cantidad de herramientas genéticas disponibles para la disección de las vías moleculares, celulares y de comportamiento. Trabajo en los últimos 15 años ha sido especialmente importante en la caracterización de las identidades celulares específicos, receptores neuronales, y los mecanismos que intervienen en tanto olor y el sabor de señalización. Ahora, el poder de la genética de Drosophila se utiliza para aclarar aún más cómo estos procesos se codifican en el nivel sola neurona y simple circuito ^3-6. Por lo tanto, los ensayos que proporcionan anotó fácilmente lecturas de las alteraciones en las vías sensoriales son vitales para el avance continuado de esos campos.

Mientras que una gran cantidad se sabe acerca de cómo las señales olfativas son codificados y procesados ​​en el cerebro, y mucho menos se sabe acerca de los mecanismos similares en la vía gustativa. Se describe aquí un protocolo que se puede utilizar para determinar preferen gustativasce en Drosophila. Drosophila, como los mamíferos, por lo general prefieren compuestos de sabor dulce en lugar de compuestos de sabor amargo. Cualquier combinación de estas fuentes de alimentos se puede utilizar en este diseño experimental para determinar cómo las alteraciones genéticas conocidas afectan a la elección gusto. Además, las estrategias de intervención farmacológica de manera similar se pueden evaluar por sus efectos sobre la preferencia del gusto de los animales. La facilidad y flexibilidad de este ensayo hace que sea un paradigma útil para comprender la naturaleza de la percepción gustativa en Drosophila.

Protocolo

1. El hambre

1. Preparar volar viales de hambre por saturación de una bola de algodón con el 18,2 mO agua en el fondo de un vial mosca estándar. Por otra parte, de manera similar saturar una pequeña tira de papel de filtro con 18,2 mO agua y el lugar en un ángulo dentro del vial.
2. Recoger las moscas en conjuntos de ~ 100 animales en una almohadilla de CO ₂ y luego agregar las moscas a un vial preparado.
   Nota: Los mejores resultados se obtienen con los animales que están a menos de 5 días de edad. Sin embargo, la edad exacta de los animales puede ser controlado como una variable experimental para determinar los cambios en la preferencia de sabor con el tiempo.
3. Utilice un tapón de algodón o espuma para asegurar los viales cerrados. Colocar los viales en su lado en una incubadora con ambiente controlado. Mantener la temperatura a 25 ° C, y la humedad por encima de 70%. Deja viales sin tocar durante 24 horas.

Ensayo Preferencia 2. Sabor

1. Preparar todos los estimulantes del gusto para el ensayo en el mismo día unas prueba.
   Nota: Los estimulantes del gusto exacta a usar variará dependiendo de la pregunta experimental que se les pide. Los siguientes son ejemplos de estimulantes del gusto utilizados en este protocolo. Ver la sección 4 para optimizaciones.
   1. Preparar el control saborizante (sacarosa 1 mM) mediante la combinación de 10 l de solución de sacarosa 100 mM, 13 l de colorante rojo, y 977 l de agua 18.2 mO.
   2. Preparar saborizante experimental (sacarosa al 5 mM) mediante la combinación de 50 l de solución de sacarosa 100 mM, 10 l de colorante azul, y 940 l de agua 18.2 mO.
2. Hacer cámaras de ensayo usando una 100 mm x 15 mm placa de petri de plástico estándar preparado de la siguiente manera:
   1. Coloque tres gotas 10 l de saborizante de control más cercano al borde de la placa a las 12 horas y las otras 3 gotas a las 6 h. Asegúrese de que la separación entre gotas es similar.
   2. Coloque tres gotas 10 l de saborizante experimental más cercana al borde de la placa a las 3 en punto y unaotras 3 gotas a las 9 en punto. Asegúrese de que la separación entre gotas es similar.
   3. Repita los pasos 2.2.1 y 2.2.2 para tantas repeticiones como se desee.
3. 1 frasco de vacío ~ 100 moscas hambrientas en una almohadilla de CO ₂ sólo el tiempo suficiente para anestesiar a todos los animales (aproximadamente 10 segundos). Cepillo de los animales en el medio de una cámara de ensayo preparado y cubrir con la tapa de la placa.
   Nota: El aumento de los periodos de exposición al CO ₂ se debe evitar para mejorar el tiempo de recuperación y limitar la interferencia con el comportamiento alimentario. La exposición a hielo (~ 5 min) puede ser utilizado para anestesiar para evitar CO ₂ efectos de comportamiento que pueden surgir de incluso una exposición limitada.
4. Coloque la cámara de ensayo en una caja de cartón opaco. Asegúrese de marcar la parte exterior de la caja con la condición y el genotipo siendo probados.
5. Coloque la configuración completa (cámara de ensayo contenida dentro de la caja de cartón desde el paso 2.4) en un 25 ° C incubadora con al menos un 70% de humedad durante 2 horas.
6. Repita los pasos 2.3 a través 2.5 para todas las repeticiones.
7. Después de 2 horas, colocar las cámaras de ensayo, todavía contenidas dentro de cajas de cartón, directamente en un congelador a -20ºC hasta que esté listo para la cuantificación.

3. Ensayo de Sabor Preferencia Cuantificación

1. Permitir que una sola cámara de ensayo se caliente a la temperatura ambiente (aproximadamente 5 minutos).
2. Bajo un microscopio de disección, usando un cepillo o un par de pinzas, los animales del grupo basado en el color de su abdomen: rojo, azul, púrpura o clara (Figura 1).
3. Registre el número de animales en cada grupo. Considere animales claras para no hayan participado en el ensayo y por lo tanto no los incluyen en los cálculos.
4. Calcular el índice de preferencia de acuerdo con una de las siguientes ecuaciones:
   1. Si se añade el saborizante experimental de interés para el tinte rojo, a continuación, utilizar (N + _{rojo púrpura} 0,5 N) / (N + N _{rojo azul} + N _purple).
   2. Si se añade el saborizante experimental para el colorante azul, y luego ajustar la ecuación de (N + _{azul púrpura} 0,5 N) / (N + N _{azul rojo púrpura} + N).
5. Repetir los cálculos para todas las condiciones experimentales y repeticiones.

4. Optimización de Ensayo de preferencia de sabor

1. Empíricamente determinar la concentración de los indicadores de colorante de alimentos para ser usado de modo colorante de alimentos no afecta el resultado del ensayo de sabor, como sigue:
   1. Preparar 4 estimulantes del gusto usando el mismo compuesto de base (por ejemplo, sacarosa al 5 mM) como se indica en el paso 2.1, pero omitir el colorante de alimentos.
   2. Añadir 1,3% de colorante rojo a uno de los estimulantes del gusto. Hacer los 3 restantes con estimulantes del gusto azul colorante de alimentos de las concentraciones que varían en cada tubo (por ejemplo, 0,6%, 1% y 1,3%).
   3. protocolo completo los pasos 2.2 a 3.4 para cada par saborizante: 1,3% frente a 0,6% de azul rojo; 1,3% frente a 1% de color rojo y azul1,3% frente a 1,3% de azul rojo.
   4. Repita el paso 4.1.1-4.1.3 con diferentes porcentajes de colorante azul hasta los promedios del índice de preferencia un valor de 0 (Figura 2).
      Nota: Como punto de partida, un 1,3% de colorante rojo junto con 1% de colorante azul normalmente da buenos resultados. Si hay concentración satisfactoria de colorante azul se puede adaptar al 1,3% de colorante, a continuación, paso 4.1.1 a través de 4.1.3 se puede repetir con diferentes concentraciones de colorante rojo y una concentración constante de colorante azul.
   5. Analizar todas las condiciones de la prueba con las mismas concentraciones de colorantes de alimentos optimizados.

Resultados

Algunos resultados típicos de los ensayos de preferencias gustativas se muestran a continuación. En la mayoría de los experimentos alguna variación en la intensidad de la coloración abdominal se verá (Figura 1). Cualquier coloración en el abdomen ya sea intensa o débil se considera una ingesta positivo. Por tanto, es aconsejable que los investigadores para anotar animales mientras ciegos a la condición experimental de modo que se limiten los posibles sesgos.

Discusión

Hemos descrito un protocolo simple pero eficaz para determinar preferencia de sabor en Drosophila. Las versiones de este ensayo se utilizan habitualmente en experimentos para determinar las contribuciones de los receptores gustativos (gr) para percibir las diferentes calidades (amargo, dulce, agrio, salado y umami) de los compuestos del sabor. El genoma de Drosophila contiene aproximadamente 60 genes que codifican los receptores gustativos 68 identificados por splicing alternativo ^8,9. Sin e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160