Вкус Предпочтение анализа для взрослых<em&gt; Drosophila</em

Резюме

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Аннотация

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Введение

Животные используют chemosensation отличить выгодные условия помимо невыгодных условий. Такое восприятие может иметь решающее значение для таких вещей , как определение наилучшего источника пищи, избегая токсичных веществ или определения наилучшего брачного партнера ^1. Chemosensation часто делится на две сенсорные компоненты: обоняния и вкусовых ощущений. Главной отличительной особенностью этих чувств является то, что обоняние (запах) используется для образца окружающей газовой среды, в то время как химическая проба на вкус (вкус) требует физического контакта с нелетучим субстратом. Обе сенсорные модальности стимулируют неврологические реакции , которые обрабатываются и декодируются в мозге , чтобы произвести соответствующий притягательные или отталкивающие поведение ^2. Эти чувства имеют решающее значение для выживания животных.

Плодовой мушки дрозофилы представляет собой модель организм , который продолжает расти в популярности для использования в понимать ,ING, как насекомые воспринимают запах и вкус. Плодовые мушки предлагают огромные преимущества по сравнению с другими системами модели благодаря богатству генетических инструментов, доступных для рассечения молекулярных, клеточных и поведенческих путей. Работа в течение последних 15 лет было особенно важную роль при характеристике специфических клеточных идентичности, нейронные рецепторы, и механизмы, участвующие в обоих запаха и вкуса сигнализации. Теперь сила дрозофилы генетики используется для дальнейшего выяснения , каким образом эти процессы кодируются на один нейрон и одного контура уровня ^3-6. Поэтому анализы, которые обеспечивают забиваются легко считывания изменений в сенсорных путей являются жизненно важными для продолжения наступления этих полей.

В то время как много известно о том, как обонятельные сигналы кодируются и обрабатываются в головном мозге, гораздо меньше понимают о подобных механизмах в вкусового пути. Здесь мы опишем протокол, который может быть использован для установления вкуса preferenв.п. в дрозофилы. дрозофилы, как и у млекопитающих, как правило , предпочитают сладкие соединения дегустации , в отличие от горьких соединений дегустации. Любое сочетание этих источников пищи могут быть использованы в этой экспериментальной конструкции, чтобы определить, как известные генетические изменения влияют на выбор вкуса. Кроме того, фармакологические стратегии вмешательства так же можно оценить на предмет их влияния на вкусовые предпочтения животных. Легкость и гибкость этого анализа делает его полезным для парадигмы понимания природы вкусового восприятия у дрозофилы.

протокол

1. Голодание

1. Приготовьте летать на голодном ампул насыщением ватный тампон с 18,2 МОм воды в нижней части стандартного флакона летать. В качестве альтернативы, так же насыщают небольшую полоску фильтровальной бумаги с 18,2 МОм воды и место под углом в пузырьке.
2. Сбор мух в наборы ~ 100 животных на CO ₂ площадки , а затем добавить мух в подготовленную пробирку.
   Примечание: Наилучшие результаты получают с животными, которые менее чем за 5 дней. Тем не менее, точный возраст животных можно контролировать в качестве экспериментальной переменной для определения изменений вкусовых предпочтений в течение долгого времени.
3. Используйте ватный шарик или пены пробку, чтобы обеспечить закрытым флаконах. Поместите ампул на их стороне в экологически контролируемом инкубаторе. Поддерживают температуру при 25 ° С, а влажность выше 70%. Оставьте флаконы нетронутым в течение 24 часов.

2. Вкус Предпочтение Анализ

1. Подготовьте все Tastants для анализа на тот же деньs тестирование.
   Примечание: Точные Tastants, которые будут использоваться будет варьироваться в зависимости от экспериментальных нами вопроса. Ниже приведены примеры Tastants, используемые в данном протоколе. Смотрите раздел 4 для оптимизации.
   1. Подготовка управления tastant (1 мМ сахарозы) путем объединения 10 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 13 мкл красного пищевого красителя, и 977 мкл 18,2 МОм воды.
   2. Подготовьте экспериментальную tastant (5 мМ сахарозы) путем объединения 50 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 10 мкл голубого пищевого красителя, и 940 мкл 18,2 МОм воды.
2. Сделать опробования камеры с использованием стандартного 100 мм х 15 мм пластиковые чашки блюдо, приготовленное следующим образом:
   1. Поместите три 10 мкл капли управления tastant ближайшего края пластины в 12 часов и еще 3 капли в 6 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
   2. Поместите три 10 мкл капли экспериментальной tastant ближайшего края пластины в 3 часа ночи идругие 3 капли в 9 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
   3. Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 столько повторов, как хотелось бы.
3. Пустой 1 флакон ~ 100 голодающих мух на СО ₂ колодки просто достаточно долго , чтобы обезболить всех животных (около 10 сек). Кисть животных в середину подготовленной аналитической камеры и накрыть крышкой блюдо.
   Примечание: более длительные периоды воздействия CO ₂ , следует избегать , чтобы улучшить время восстановления и ограничения вмешательства в пищевом поведении. Воздействие льда (~ 5 мин) может быть использован для обезболивающее , чтобы избежать CO ₂ , поведенческие эффекты , которые могут возникнуть в результате даже ограниченным воздействием.
4. Поместите камеру для анализа в непрозрачном картонной коробке. Обязательно маркировать вне коробки с условием и генотип испытывается.
5. Поместите всю установку (пробирного камеры содержится в картонной коробке с шага 2.4) в 25 ° C инкубаторе с по крайней мере, 70% влажности в течение 2 часов.
6. Повторите шаги 2,3 через 2,5 для всех повторах.
7. После 2-х часов, поместите пробирного камеры, все еще содержащиеся в картонные коробки, непосредственно в -20 ° C морозильнике до готовности к количественному.

3. Вкус Предпочтение Анализ Количественное

1. Разрешить один тест камеры нагреться до комнатной температуры (примерно 5 мин).
2. Под микроскопом рассечение, используя щетку или пару щипцов, группы животных на основе цвета их живота: красный, синий, фиолетовый или ясно (рисунок 1).
3. Записывают число животных в каждой группе. Рассмотрим четкие животных не участвовали в анализе, и поэтому не включать их в каких-либо расчетов.
4. Вычислить индекс предпочтений согласно одному из следующих уравнений:
   1. Если экспериментальная tastant интерес добавляется к красным красителем, а затем использовать (N _{красный} + 0,5н _{фиолетовый)} / (N + N _{красный синий} + N _Purplд).
   2. Если экспериментальная tastant добавляется к синим красителем, а затем настроить уравнение к (N _синий + 0,5н _{фиолетовый)} / (N _синий + _{красный} + N N _{фиолетовый).}
5. Повторите расчеты для всех условий эксперимента и повторах.

4. Оптимизация вкуса Предпочтение Пробирной

1. Эмпирически определить концентрацию показателей пищевой краситель для использования таким образом пищевой краситель не влияет на результат анализа вкуса, следующим образом:
   1. Подготовьте 4 Tastants с использованием того же основного соединения (например , 5 мМ сахарозы) , как показано на шаге 2.1, но опустить пищевой краситель.
   2. Добавить 1,3% красный пищевой краситель к одному из Tastants. Выполните оставшиеся 3 Tastants с синим пищевым красителем различных концентраций в каждой пробирке (например , 0,6%, 1% и 1,3%).
   3. Полный протокол шаги 2.2 через 3.4 для каждой пары tastant: 1,3% против 0,6 красный% синий; 1,3% красного против 1% синего и1,3% по сравнению с красным 1,3% синим цветом.
   4. Повторите шаг 4.1.1-4.1.3 с различным процентным содержанием синего пищевого красителя , пока средние значения индекса предпочтения значение 0 (Рисунок 2).
      Примечание: В качестве отправной точки, 1,3% краситель красный пищевой в сочетании с 1% синей окраски пищи, как правило, дает хорошие результаты. Если нет удовлетворительной концентрации синего пищевого красителя не могут быть сопоставлены с 1,3% красителя, а затем шаг 4.1.1 через 4.1.3 можно повторить с различными концентрациями красной окраски и постоянной концентрации синего пищевого красителя.
   5. Анализировать все условия, чтобы быть проверены с помощью тех же самых оптимизированных концентрациях пищевой краситель.

Результаты

Некоторые типичные результаты вкусовых предпочтений анализов приведены ниже. В большинстве экспериментов некоторые различия в интенсивности окраски брюшной будет видно (рисунок 1). Любая окраска в брюшной полости ли интенсивным или слабым считается положи?...

Обсуждение

Мы описали простой , но эффективный протокол для определения вкусовых предпочтений у дрозофилы. Версии этого анализа обычно используются в экспериментах для определения вклада вкусовых рецепторов (ГР), чтобы воспринимать различные качества (горький, сладкий, кислый, соленый, и ум?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Glacial Acetic Acid	Fisher	BP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160