JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Özet

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Giriş

Hayvanlar dezavantajları dışında avantajlı koşullar ayırt chemosensation kullanımı. Bu algı, en iyi besin kaynağı belirleyen toksik maddelerin kaçınarak ya da en iyi çiftleşme ortağı 1 belirleyici gibi şeyler için çok önemli olabilir. koku duyuları ve tat duyuları: Chemosensation genellikle iki duyusal bileşenlere ayrılmıştır. Bu duyuların bir ana ayırt edici özelliği koku alma (koku) tadına bakma (tat) bir kalıcı alt tabaka ile fiziksel temas gerektiren iken çevreleyen gaz kimyasal ortamını örnek için kullanılan olmasıdır. Her ikisi de duyu modaliteleri işlenmiş ve uygun çekici veya itici davranışları 2 üretmek için beyinde çözülür nörolojik yanıtları uyarır. Bu duyular hayvan hayatta kalmak için bu nedenle önemlidir.

Drosophila melanogaster uçmak meyve anlıyorum kullanılmak üzere popülerlik büyümeye devam eden bir model organizmadırböcekler koku ve tat nasıl algıladıklarını ing. Meyve sinekleri nedeniyle moleküler, hücresel ve davranışsal yolların diseksiyon için kullanılabilir genetik araçları zenginliği diğer model sistemler üzerinde muazzam avantajlar sunmaktadır. Son 15 yılda iş spesifik hücresel kimlikleri, nöronal reseptörler karakterize ve koku ve tat hem de yer alan mekanizmaları sinyalizasyon özellikle etkili olmuştur. Şimdi, Drosophila genetiği gücü daha da bu süreçlerin tek nöron ve tek devre düzeyinde 3-6 kodlanmış nasıl aydınlatmak için kullanılıyor. Bu nedenle sağlamak tahlilleri kolayca duyusal yollara değişikliklerin readouts bu alanların sürekli peşin için çok önemlidir attı.

büyük bir kodlanmış ve beyinde nasıl işlendiğini koku işaretleri hakkında bilinen birlikte, daha az tat yolu içindeki mekanizmalar hakkında anlaşılmaktadır. Burada tadı preferen tespit etmek için kullanılabilecek bir protokol açıklarAcı tatma bileşiklerine karşı Drosophila. Drosophila ce, memeliler gibi, genel olarak tatlı tatmak bileşikleri tercih ederim. Bu gıda kaynaklarından herhangi bir kombinasyonu bilinen genetik değişiklikler tat seçimini nasıl etkilediğini belirlemek için bu deney tasarımında kullanılabilir. Buna ek olarak, farmakolojik müdahale stratejileri benzer hayvanların tat tercihi üzerindeki etkileri için değerlendirilebilir. Bu testte kolaylığı ve esneklik Drosophila tat algı doğasını anlamak için o yararlı bir paradigma yapar.

Protokol

1. Açlık

  1. Standart bir sinek şişenin dibinde M 18.2 suyla pamuk doyurarak açlık şişeleri sinek hazırlayın. Alternatif olarak, benzer bir şişe içinde bir açıda 18.2 su ve yer ile filtre kağıdı küçük bir şerit sulanacak.
  2. Hazırlanmış bir şişeye sinekler ekleyin CO 2 pad üzerinde ~ 100 hayvan setleri içine sinekleri toplayın ve.
    Not: En iyi sonuçlar az 5 gün geçmiş hayvanların elde edilir. Ancak, hayvanların kesin yaş zamanla tat tercih değişiklikleri belirlemek için deneysel bir değişken olarak kontrol edilebilir.
  3. şişeler kapalı sabitlemek için bir parça pamuk veya köpük stoper kullanın. çevre kontrollü inkübatör kendi tarafında şişeleri yerleştirin. 25 ° C sıcaklık ve% 70 üzerinde nemi muhafaza edin. 24 saat boyunca el değmemiş şişeleri bırakın.

2. Tat Tercihi Testi

  1. Aynı gün a denenmek üzere tüm tat yoğunluğu arttırıcı hazırlayıns testi.
    Not: Deneysel soru bağlı olarak değişecektir kullanılmak üzere tam tat yoğunluğu arttırıcı isteniyor. Aşağıda, bu protokolde kullanılan örnek tat yoğunluğu arttırıcı vardır. optimizasyonlar için bölüm 4'e bakınız.
    1. 100 mM sukroz çözeltisi 10 ul kırmızı gıda boyası 13 ul ve 18.2 su 977 ul birleştirerek kontrol tat yoğunluğu arttırıcı (1 mM sükroz) hazırlayın.
    2. 100 mM sukroz çözeltisi 50 ul, gıda boyası 10 ul ve 18.2 su 940 ul birleştirerek deney tat yoğunluğu arttırıcı (5 mM sükroz) hazırlayın.
  2. aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır, standart 100 mm x 15 mm plastik petri kabı kullanarak deney odaları sağlayın:
    1. 12 saat plakanın kenarına yakın kontrol tat yoğunluğu arttırıcı madde üç 10 ul damla ve 6 saat başka bir 3 damla yerleştirin. damla arasındaki aralık benzer olduğundan emin olun.
    2. 3 saat ve bir de plaka kenarına yakın deneysel tat yoğunluğu arttırıcı madde üç 10 ul damla yerleştirinDiğer 3 9 saat düşer. damla arasındaki aralık benzer olduğundan emin olun.
    3. istediğiniz gibi tekrarlayın gibi birçok çoğaltır için 2.2.1 ve 2.2.2 adımları.
  3. Sadece yeterince uzun bütün hayvanlar (yaklaşık 10 saniye) uyutmak için bir CO 2 ped üzerine ~ 100 açlıktan sinek boş 1 flakon. hazırlanmış bir tahlil odasının ortasına hayvanları fırçalayın ve çanak kapağı ile kaplayın.
    Not: CO 2 maruz kalma uzun süreler beslenme davranışı ile iyileşme süresi ve sınır girişimi geliştirmek için kaçınılmalıdır. Buz maruz kalma (~ 5 dakika) daha sınırlı maruz kaynaklanabilecek CO2 davranışsal etkileri önlemek için anestezi için kullanılabilmektedir.
  4. opak bir karton kutu içinde tahlil odasına yerleştirin. durumu ve genotip test edilen kutunun dışında etiket emin olun.
  5. 2 saat için en az% 70 nem ile 25 ° C inkübatör içine tüm kurulum (adım 2.4 karton kutu içinde bulunan tahlil odacık) yerleştirin.
  6. Tümünü tekrarla çoğaltır için 2.5 ile 2.3 arasındaki adımları.
  7. 2 saat sonra, doğrudan miktar tayini için hazır olana kadar -20 ° C dondurucu içine, yine mukavva kutular içinde bulunan deney odaları, yerleştirin.

3. Tat Tercihi Testi Ölçümü

  1. Tek bir tahlil odası, oda sıcaklığında (yaklaşık 5 dakika) kadar ısınmasını bekleyin.
  2. Kırmızı, mavi, mor ya da açık (Şekil 1): Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir fırça veya forseps çifti kullanarak, grup hayvanlar karın rengine dayalı.
  3. Her gruplandırma hayvanların numarasını kaydedin. Herhangi bir hesaplamalarda bunları içermez bu nedenle deneyde katılmamış açık hayvanları düşünün ve.
  4. Aşağıdaki denklem birine göre tercih indeksi hesaplanır:
    1. + N mavi + N purpl ilgi deneysel tat yoğunluğu arttırıcı madde kırmızı boya ilave edilirse, o zaman kullanın (N + kırmızı 0.5N mor) / (N kırmızıe).
    2. Deneysel tat yoğunluğu arttırıcı madde mavi boya ilave edilirse, o zaman (N mavisi, mor + 0.5N) / (N mavi + N kırmızı + N mor) denklemi ayarlayın.
  5. tüm deneysel koşullar ve çoğaltır için hesaplamalar tekrarlayın.

Tat Tercihi Testi 4. Optimizasyon

  1. Ampirik gıda boyası tat testinin sonucunu etkilemez böylece aşağıdaki gibi, kullanılacak gıda boyası göstergelerinin konsantrasyonunu belirlemek:
    1. Olarak adım 2.1 belirtilen aynı temel bileşiği (örneğin 5 mM sükroz) kullanılarak 4 tat yoğunluğu arttırıcı hazırlayın, ancak gıda boyası ihmal.
    2. tat yoğunluğu arttırıcı birine% 1.3 kırmızı gıda boyası ekleyin. Her bir tüp içinde değişik konsantrasyonlarda mavi gıda boyası (örneğin,% 0.6,% 1 ve% 1.3) ile birlikte geri kalan 3 tat yoğunluğu arttırıcı sağlayın.
    3. Komple protokol, her tat yoğunluğu çifti için 3.4 ile 2.2 arasındaki adımları:% 0.6 mavi% 1.3 kırmızı vs; % 1.3 kırmızı vs% 1 mavi ve% 1.3 kırmızı vs% 1.3 mavi.
    4. Tercih indeksi ortalamaları kadar mavi gıda boyası farklı yüzdelerde 0 (Şekil 2) değeri ile adımı tekrarlayın 4.1.1-4.1.3.
      Not: Bir başlangıç ​​noktası olarak,% 1 mavi gıda boyası ile birleştiğinde% 1.3 kırmızı gıda boyası genellikle iyi sonuçlar verir. gıda boyası herhangi bir tatmin edici bir konsantrasyonu,% 1.3 boya eşleştirilebilir, sonra 4.1.3 boyunca 4.1.1 kırmızı bir renk ve mavi gıda boyası sabit bir konsantrasyonda değişik konsantrasyonları ile tekrar sağlanabilir.
    5. Aynı optimize gıda boyası konsantrasyonları ile test edilecek tüm koşulları analiz edin.

Sonuçlar

tat tercih deneyleri Bazı tipik sonuçlar aşağıda gösterilmiştir. Deneylerin çoğunda karın boyama yoğunluğunda bazı farklılık (Şekil 1) görülecektir. güçlü ve zayıf olsun karın herhangi bir boyama pozitif yenmesi olarak kabul edilir. herhangi bir potansiyel önyargıları sınırlayacak şekilde araştırmacılar deneysel koşul iken kör hayvanlar puan için bu nedenle tavsiye edilir.

Te...

Tartışmalar

Biz Drosophila tat tercihini belirlemek için basit ama etkili bir protokol tanımlanmıştır. Bu testin sürümleri rutin tat bileşikleri (acı, tatlı, ekşi, tuzlu ve umami) farklı nitelikleri algılamaya tat reseptörleri (GY) katkılarını belirlemek için deneylerde kullanılır. Drosophila genom alternatif bölünme 8,9 ile 68 tespit tat ​​reseptörleri kodlayan yaklaşık 60 gen içermektedir. Bununla birlikte, bu iyonotropik glutamat reseptörleri ve TRP kanalları gibi diğ...

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

We would like to thank members of the Tessier lab for critical reading of this manuscript and helpful suggestions during the preparation of this protocol.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)McCormickN/A
Cryo/Freezer Boxes w/o DividersFisher03-395-455
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
Glacial Acetic AcidFisherBP2401-500
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscopeW. Nuhsbaum, Inc.10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)BD Falcon351029Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap MicrotubesAlkali Scientific Inc.C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)McCormickN/A
SucroseIBI ScientificIB37160

Referanslar

  1. Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
  4. Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
  5. Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
  6. Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
  7. Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042 (2013).
  8. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  9. Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
  10. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  11. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  12. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  13. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
  16. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  17. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  18. French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
  19. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 115LezzettatDrosophilaBeslenme paradigmaa l kcazibeka nman robiyolojigeli im biyolojisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır