发电<em&gt;德诺</em&gt;抗原特异性人T细胞受体通过中心的Hemichain的逆转录病毒转导

摘要

这里我们描述了一种新方法，以产生抗原特异性T细胞受体（TCR）通过配对现有的TCR的TCRα或TCRβ，具有感兴趣的抗原特异性，与外周T细胞受体库的补充hemichain。 从头产生的TCR保留抗原特异性有不同的亲和力。

摘要

T细胞受体（TCR）在临床上用于指导T细胞的特异性靶向肿瘤免疫疗法的一个有前途的方式。因此，具体的关于各种肿瘤相关抗原的克隆的TCR一直是许多研究的目标。以引发有效的T细胞应答，T细胞受体必须认识到与最佳亲和力的靶抗原。然而，这种克隆的TCR一直是一个挑战，许多可用的TCR具有对同源抗原次优的亲和力。在这个协议中，我们描述了克隆使用现有的TCR通过利用hemichain为中心从头高亲和力的抗原特异性的TCR的方法。众所周知，对于某些的TCR，每个TCRα或TCRβhemichain不相等，以抗原识别贡献，显性hemichain被作为中心hemichain提及。我们已经表明，通过配对与反链从原来的反链不同的中心hemichain，我们能够保持抗原小号pecificity，而调节其作用强度为同源抗原。因此，一个给定的TCR的治疗潜力可通过优化中心和计数器hemichains之间的配对的提高。

引言

T细胞受体（TCR）是由T淋巴细胞表达异二聚体适应性免疫受体，一个TCRα和TCRβ链组成。它们通过V（D）J基因片段，其产生能识别的HLA /肽复合物的几乎无限的构型的高度多样化剧目体重排产生的。在临床上，改造为表达克隆型的TCR特异性的肿瘤相关抗原的T细胞在多种癌症¹已经证明效力。但是，克隆用于此目的的许多的TCR缺乏感兴趣的抗原，这限制了它们的治疗应用足够的亲和力。

在这里，我们描述了通过利用链为中心克服这种限制对于现有的TCR的方法。已经报道，一个TCR hemichain可以发挥识别靶抗原²的更主要的作用，这里称为为中心。晶体结构分析表明，一个中心一个TCR的hemichain可能占大多数的MHC /肽复合物^3,4的足迹。使用这一概念，我们先前已经证明了SIG35αTCRα可以与TCRβ链的多样剧目配对，并保持反应性对抗由HLA-A2 ⁵提出的MART1 _27-35肽。类似的结果与TAK1 TCR，其中该中心TCRβhemichain配对与各种TCRα链和维持反应对由HLA-A24 ⁶提出的WT1 _235-243肽得到。既MART1和WT1是肿瘤相关抗原。链为中心也被用于研究CD1d的限制不变的自然杀伤（的iNKT）的TCR的抗原识别，通过配对不同Vβ11TCRβ链⁷人的iNKT的TCR的不变Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα链。

在任何情况下，我们能够通过跨产生的TCR的从头剧目ducing的中心的TCR hemichain到外周血T细胞，其中该引入hemichain与内源TCRα或TCRβ计数器链配对。在本质上，中心hemichain作为可用于确定适当的反链，其一起使用时形成保持目的抗原的特异性的TCR，但在亲和力改变一个诱饵。从这些新的全集，我们能够克隆型的TCR与抗相比预先存在的TCR对靶抗原改进相互作用强度隔离。因此，我们认为这种方法将加快确定最佳的TCR为临床应用的管道。

研究方案

1.准备逆转录病毒构建利益编码TCR Hemichain

1. 线性PMX矢量，以允许在随后的步骤的TCR基因的插入。消化用EcoRI和NotI限制性内切酶的质粒DNA在37℃下3小时（ 表^1）8。
2. 开展1.2％琼脂糖凝胶的消化的质粒的电泳。的约4500个碱基对（BPS）消费税乐队，稀释成30微升无菌水使用市售凝胶提取试剂盒^9。
3. 设计5'和3'引物对感兴趣的TCR基因也编码15-20 bps的重叠PMX矢量，分别为⁸的EcoRI和NotI消化位点。
4. 扩增TCR基因引物。如步骤1.2中所述进行的约1,000个基点的PCR产物和洗脱带电泳。
5. 克隆的TCR基因导入消化的载体由每个线性片段与可商购的质粒组合装配主混合试剂，并在50℃温育1小时。
   注:参见制造商的协议对于每个组件的相对体积。这种装配方法是基于最初由Gibson等 ¹⁰中所述的技术。
6. （可选的）标记的TCR基因标为转导的细胞与人神经生长因子受体的截短形式（ΔNGFR，氨基酸^1-277）11由弗林蛋白酶切割位点，丝氨酸-甘氨酸接头分开，和图2A序列^12,13。设计引物编码序列重叠片段末端，并按照步骤1.3-1.5描述组装质粒。
   注意:这些序列可参考^11-13找到。
7. 变换化学感受态大肠杆菌具有下列制造商的协议¹⁴组装质粒。在琼脂平板上的种子转化的细菌（20毫克/毫升LB培养基（LB），15毫克/毫升琼脂和1微克/毫升氨苄青霉素），在37°C孵育18小时。
8. 培养单个菌落在50毫升LB培养基（20毫克/毫升的LB和1微克/毫升氨苄青霉素），用于在振荡培养箱16小时，在37℃和200转每分钟。
9. 净化用以下制造商的协议市售中提试剂盒的质粒。质粒稀释到大约1微克/μL的浓度。
   注:质粒纯化协议基于碱性提取方法^15。

2.生成稳定的包装细胞系

注:两个293GPG和PG13细胞贴壁。在Dulbecco氏改良Eagle培养基（DMEM）中培养的细胞在补充有10％胎牛血清（FCS）和50μg/ ml庆大霉素。培养293GPG细胞转染前1微克/毫升四环素。孵育细胞在37℃，5％的CO ₂的所有步骤之间。

1. 转染293GPG包装细胞中，在步骤1.9，USI得到的hemichain编码矢量的T75烧瓶¹⁶培养纳克市售的转染试剂依照制造商的方案^{1 7。}注:转染细胞293GPG在50-60％汇合。
2. 对于293GPG细胞吸中，加入10毫升新鲜DMEM培养基后1天转染。
3. 嘉实步2.2转增培养基注射器，并通过0.45微米的过滤器后第2天瞬时产生病毒转染的细胞293GPG。
   注:病毒可以立即使用或储存于-80℃以备将来使用。
4. 培养1×10 ^5个 PG13细胞的T25烧瓶中。算使用血球细胞。一天后，吸培养基，并添加1.5 293GPG源性病毒的溶液从步骤2.3和1.5毫升DMEM培养基中，以8微克/毫升聚凝胺的沿。
5. 4天每天一次在步骤2.4所描述的改变介质，以建立编码目的TCR hemichain稳定PG13包装细胞系制备逆转录病毒。
6. 吸媒体和替换为PG13细胞系进行进一步培养上一次感染后24小时的新鲜DMEM培养基。
   注:冻结或子培养细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液脱离。
7. 至如在步骤2.33天接种细胞后描述产生从转导PG13细胞系的病毒，培养2×10 ^6个细胞在T75用10ml DMEM培养基烧瓶中，收获病毒。
   注:病毒立即最好使用，但可存储在-80℃达两个月。

3.激活和人类T细胞的转导

注意:人的样品，获得并根据机构伦理委员会批准的方案使用。罗斯韦尔园区纪念研究所培养原代人细胞补充有10％人血清，而不是FCS和50μg/ ml庆大霉素（RPMI）培养基。孵育细胞在37℃，5％的CO ₂的所有步骤之间。

1. 分离人外周血单核细胞（PBMC）通过密度依照制造商的协议¹⁸梯度分离。
2. 活化T细胞以诱导对逆转录病毒感染所需的增殖。每孔培养2×10 ⁷个新鲜或解冻的PBMC在6孔板，在5毫升与100IU / ml重组人白介素-2（的rhIL-2）和50ng / ml的抗CD3单克隆抗体的RPMI培养基中的（克隆OKT3）。
3. 三天后的刺激，在350 XG吹打，离心收集T细胞4分钟。弃上清和种子每孔0.5-1×10 ^6个 T细胞再悬浮于1ml PG13病毒从步骤2.7 24孔板，1补充有200单位/毫升的rhIL-2的RPMI培养基中。在1000 xg离心离心机板和32℃下1小时。
4. 24小时后，收集T细胞吹打，离心350 XG 4分钟。丢弃上清，重悬细胞于1ml PG13病毒从步骤2.7和1补充有200单位/毫升的rhIL-2的RPMI培养基中。重复此步骤，总共6侵染的离子。
   注:感染数量应根据由包装细胞系产生的病毒的滴度进行优化。如果需要的话，通路T细胞每天除去细胞的20-30％，以防止过度生长。
5. 最后在感染后24小时，收集T细胞吹打，离心350 XG 4分钟。丢弃与100IU / ml的重组人IL-2的用于进一步培养RPMI培养基上清，重悬细胞。
6. 步骤3.5，染色的T细胞在4℃，15分钟，4℃，30分钟，然后加入抗人CD3的HLA多聚和共受体的单克隆抗体（mAb）后2-3天。通过流式细胞仪分析。使用多聚体无关和/或细胞未转染为阴性对照（ 见图1 - ^3）19。
7. 如果所引入的中心hemichain是TCRα链，使用市售的Vβ特异性抗体面板通过流式细胞仪²⁰分析的从头多聚阳性细胞的Vβ的使用。

4.克隆德诺 TCR反hemichains

1. 排序从头多聚积极步骤3.6流辅助细胞分选的人口。
2. 从使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法^{21,2 2}排序的T细胞分离RNA。
   注:RNA可被储存在-80℃，但应使用尽快生成的cDNA。
3. 使用以下制造商的协议^23,24市售逆转录酶-PCR试剂盒从提取的RNA合成cDNA文库。
4. 如果克隆TCRβ反链，设计Vβ基因和TCRβ恒定区特异性的引物，如在步骤3.7确定的，并克隆全长TCRβ步骤1.3-1.9中描述的基因作为。请参阅步骤4.5，如果反链TCRα，否则继续执行步骤5.1。
5. 市售Vα特异性抗体有限，因而Vα基因的使用不能通过流式细胞仪来确定。通过cDNA末端^（RACE）25 5'-快速扩增克隆TCRα反链，使用市售5'RACE包^6。
   1. 合成从在步骤4.2中提取的RNA下列制造商的协议5'RACE兼容的cDNA。
   2. 如表2所示进行^第一轮PCR。
   3. 进行PCR产物的电泳和洗脱的约1,100个基点带，如在步骤1.2中描述。
   4. 如表3中所述，使用^第一轮PCR产物作为模板进行^第二轮PCR。
      注:下表3所示的引物序列被设计用于克隆到EcoRI和NotI消化PMX载体。
   5. 进行PCR产物的电泳和洗脱的大约1000个基点带，如在步骤1.2中描述。
   6. 克隆TCRα基因插入EcoRI和NotI消化PMX载体和普里FY质粒如步骤1.5-1.9中描述。

5.重建新的抗原特异性TCR克隆

注:培养的Jurkat 76细胞和随后的细胞系在RPMI培养基中补充有10％FCS和50μg/ ml的庆大霉素。孵育细胞在37℃，5％的CO ₂的所有步骤之间。

1. 转导的Jurkat 76细胞^26（或同等学历TCR ^{- / -}人类T细胞系）用在步骤2.3生产293GPG病毒中心TCR hemichain。对Jurkat细胞76，种子，每孔5×10 ^4个细胞在24孔板用1ml病毒和1ml RPMI培养基中。在1000 xg离心离心机板和32℃下1小时。
2. 感染后24小时，收集hemichain转导的Jurkat 76细胞吹打，离心350 XG 4分钟。弃上清，重悬在进一步培养新鲜RPMI培养基。
3. 净化转导细胞如果hemichain分子是5.2步后2-3天标记，通过染色ING与荧光团共轭抗神经生长因子受体单克隆抗体其次是流动，协助或磁辅助细胞分选（可选^）27。
4. 以下步骤2.1至2.3，生产293GPG病毒编码TCR反链从步骤4.4或4.5克隆。
5. 要完全重建的TCR，转导T细胞系稳定表达使用病毒从步骤5.4步骤5.1-5.3产生的TCR为中心hemichain。按照步骤5.1-5.2描述执行传导。
6. 净化使用抗CD3磁辅助细胞分选CD3 ⁺转以下制造商的协议，步5.5 ²⁷后2-3天。
7. 为了验证抗原特异性，染色表达与各种反链配对的中心的TCR hemichain组成克隆型的TCR，用抗CD3和/或共受体的mAb，和HLA多聚的转染子，3-5天后CD3的纯化。分析通过流式细胞术（ 图4 - 5）细胞^19。

结果

没有先验知识其中hemichain的是链为中心，在TCRα和TCRβ链应分开克隆，并转到外周血T细胞，将其在HLA-A24 / WT1反应TAK1 TCR的（ 图1）的情况下完成的。 TAK1β的转导产生抗原特异性T细胞的显着更高的频率。相反，非中心hemichain转导不会产生从头多聚体阳性T细胞，所看到与TAK1α链（ 图1）。在分析过程中，对NGFR ⁺细胞的大门，如果TCR基因?...

讨论

这种方法的成功应用的第一个要求是实现初级T细胞与感兴趣的hemichain足够的转导效率。根据我们的经验，使用PG13作为包装细胞系和PMX如在人原代T细胞中导入基因的稳定，高效表达逆转录病毒载体的结果的组合。 PG13包装细胞可以是单细胞克隆以选择高滴度包装细胞，以提高转导效率。此外，还需要通过逆转录病毒高转导效率的T细胞的增殖。在所描述的协议中，刺激用可溶性抗CD3单抗OKT3，具有的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026