生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

要約

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。

要約

T細胞受容体（TCR）は、免疫療法の有望なモダリティとして腫瘍を標的とするT細胞の特異性を指示するために臨床的に使用されます。そのため、様々な腫瘍関連抗原に特異的なTCRをクローニングすることは、多くの研究の目標でした。効果的なT細胞応答を誘発するために、TCRは、最適な親和性で標的抗原を認識しなければなりません。しかし、このようなTCRをクローニングすることが課題と多くの利用可能なのTCR同族抗原に対する準最適な親和性を有するとなっています。このプロトコルでは、我々はhemichain中心主義を利用することによって、既存のTCRを使用してデノボ高親和性抗原特異的TCRをクローン化する方法について説明します。いくつかのTCRのために、それぞれのTCRα又はTCRβのhemichainは抗原認識に等しく寄与しないことが知られており、ドミナントhemichainを中心hemichainと呼ばれます。我々はオリジナルのカウンターチェーンは異なるカウンター鎖を有する中心のhemichainを組み合わせることで、我々は抗原秒を維持することが可能であることが示されていますpecificity、同族抗原に対するその相互作用の強度を変調しながら。したがって、所与のTCRの治療可能性を中心とカウンタhemichains間の対形成を最適化することによって改善することができます。

概要

T細胞受容体（TCR）は、TCRαおよびTCRβ鎖からなるTリンパ球によって発現されるヘテロ二適応免疫受容体です。これらは、HLA /ペプチド複合体の実質的に無制限の構成を認識することができる非常に多様なレパートリーを産生するV（D）J遺伝子セグメントの体細胞再編成によって生成されます。臨床的には、腫瘍関連抗原に特異的なクローン型TCRを発現するように操作されたT細胞は癌¹の様々な有効性が実証されています。しかし、この目的のためにクローニングされた多くのTCRは、それらの治療的適用を制限する目的の抗原に対して十分な親和性を欠いています。

ここでは、チェーン中心主義を利用することにより、既存のTCRのためにこの制限を克服する方法を説明します。それは1のTCR hemichainは、標的抗原²の認識で、より支配的な役割を果たし得ることが報告されている、ここでは中心主義と呼ばれます。結晶構造解析は、その1中心を示していますTCRのhemichainは^3,4 MHC /ペプチド複合体上のフットプリントの大部分を占める可能性があります。この概念を使用して、我々は以前にSIG35αTCRαがTCRβ鎖の多様なレパートリーと対HLA-A2 ⁵により提示MART1 _27-35ペプチドに対する反応性を維持することができることを実証しました。同様の結果が中心TCRβのhemichainは、様々なTCRα鎖と対にし、HLA-A24 ⁶により提示WT1 _235-243ペプチドについて反応性を維持しTAK1 TCRで得られました。 MART1およびWT1の両方が腫瘍関連抗原です。チェーン中心主義は、異なるVβ11TCRβ鎖⁷を有するヒトのiNKT TCRの不変Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα鎖を組み合わせることで、CD1d拘束不変ナチュラルキラー（iNKT細胞）TCRの抗原認識を研究するために適用されました。

全ての場合において、我々は、トランスによってTCRのデノボレパートリーを生成することができました導入hemichainが内因性TCRαまたはTCRβカウンター鎖と対になった末梢血T細胞、に中心のTCRのhemichainをducing。本質的には、中心hemichainは一緒に対に適切なカウンタ鎖を同定するために用いることができるベイトとして機能まだ親和性が異なる、目的の抗原特異性を維持するTCRを形成します。これらの新規レパートリーから、我々は既存のTCRと比較して、標的抗原に対する改善された相互作用の強度を有するクローン型TCRを単離することができました。したがって、我々は、この方法は、臨床応用のための最適なTCRを特定のパイプラインを加速すると考えています。

プロトコル

1.レトロウイルスは、利息のエンコーディングTCR Hemichainを構築する準備

1. 以降のTCR遺伝子の挿入を可能にするようにするpMXベクターを線状化。 3時間37℃（ 表1）にEcoRIおよびNotI制限酵素でプラスミドDNAを消化^8。
2. 1.2％アガロースゲル上で消化されたプラスミドの電気泳動を行います。物品は約4,500塩基対（BPS）のバンド、および市販のゲル抽出キット^9を用いて^、30μlの滅菌水に溶出します。
3. 設計5 'および3'にもそれぞれ⁸するpMXベクターのEcoRIおよびNotI消化部位と重複15-20 BPSをコードする目的のTCR遺伝子のためのプライマー。
4. プライマーを用いてTCR遺伝子を増幅します。 PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように約1000 BPSのバンドを溶出させます。
5. 市販のプラスミドをそれぞれ線状断片を組み合わせて消化したベクターにクローンTCR遺伝子組立マスターミックス試薬と1時間50℃でインキュベートします。
   注：各成分の相対ボリュームに対して、製造業者のプロトコルを参照してください。この組立方法は、もともとギブソンら ¹⁰によって記載された技術に基づいています。
6. 人間の神経成長因子受容体フリン切断部位、セリン-グリシンリンカー、および2Aシーケンス^12,13によって分離された（ΔNGFR、アミノ酸1から^277）11の切断型で形質導入された細胞をマークする（オプション）タグTCR遺伝子。断片の末端と重複し、工程1.3-1.5に記載されるようにプラスミドを組み立てる設計プライマーをコードする配列。
   注：これらの配列は参考文献^11-13に記載されています。
7. 化学的にコンピテントE.を変換製造業者のプロトコル¹⁴次の組み立てプラスミドで大腸菌 。種子は、寒天プレート上の細菌（20 mg / mlでLB培地（LB）、15 mg / mlで寒天とを1μg/ mlのアンピシリン）を形質転換し、18時間37℃でインキュベートします。
8. 文化37℃、毎分200回の振とう培養器で16時間50 LB培地1ml（20 mg / mlとLBとを1μg/ mlアンピシリン）で単一の細菌コロニー。
9. 製造業者のプロトコルに従って、市販のミディプレップキットを使用してプラスミドを精製します。周りを1μg/μlの濃度にプラスミドを希釈します。
   注：プラスミド精製プロトコルは、アルカリ抽出法¹⁵に基づいています。

2.安定したパッケージング細胞株を生成します

注：両方293GPGとPG13細胞が接着性です。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）および50μg/ mlのゲンタマイシンを補充しました。トランスフェクションの前に1μg/ mlのテトラサイクリンと文化293GPG細胞。すべてのステップの間、5％CO ₂で37℃で細胞をインキュベートします。

1. トランスフェクト293GPGは、ステップ1.9で得られたhemichainをコードするベクターでUSIを細胞T75フラスコ内で培養^16をパッケージング製造者のプロトコル^{1 7}以下の市販のトランスフェクション試薬をngの。注：50から60までパーセントの密集度でのトランスフェ293GPG細胞。
2. 吸引293GPG細胞用培地と新鮮なDMEM培地1日後、トランスフェクションの10ミリリットルを追加します。
3. 収穫は一過シリンジに培地を移し、0.45μmフィルターを通過させることにより2日ステップ2.2の後、トランスフェクト293GPG細胞からウイルスを産生しました。
   注：ウイルスは、直ちに使用するか、または将来の使用のために-80℃で保存することができます。
4. T25フラスコでの培養は、1×10 ⁵ PG13細胞。血球計数器を用いて細胞を数えます。 1日、吸引培地とポリブレンの8 / mlのと一緒に、ステップ2.3および1.5ミリリットルDMEM培地から293GPG由来ウイルスの1.5ミリリットルを追加した後。
5. 4日間1日1回のステップ2.4で説明したように、関心のTCRのhemichainをコードするレトロウイルスを産生する安定PG13パッケージング細胞株を確立するために、メディアを変更します。
6. 吸引し培地と交換してください24時間さらに培養のための最後の感染後PG13細胞株のための新鮮なDMEM培地で。
   注：0.05％トリプシン-EDTA溶液で剥離することにより凍結またはサブ培養細胞。
7. 三日間細胞を播種した後、ステップ2.3に記載のように形質導入PG13細胞株からのウイルスを生成するために、T75培養における2×10 ⁶個^の細胞を10mlのDMEM培地、および収穫ウイルスフラスコ。
   注：ウイルスは最高のすぐに使用されますが、2つまでの数ヶ月のために-80℃で保存することができます。

3.アクティベーションおよび形質導入ヒトT細胞の

注：ヒトサンプルを得て、機関の倫理委員会承認プロトコールに従って使用されます。ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）の代わりにFCSの10％ヒト血清を添加した培地および50μg/ mlのゲンタマイシンで培養初代ヒト細胞です。すべてのステップの間、5％CO ₂で37℃で細胞をインキュベートします。

1. 密度によってヒト末梢血単核細胞（PBMC）を単離し製造業者のプロトコル¹⁸以下の勾配分離。
2. レトロウイルス感染のために必要な増殖を誘導するためにT細胞を活性化。組換えヒトインターロイキン2抗CD3モノクローナル抗体の（のrhIL-2）および50 ng / mlでの100 IU / mlのRPMI培地5ml中の6ウェルプレート中のウェルあたり文化2×10 ⁷新鮮なまたは解凍したPBMC、 （クローンOKT3）。
3. 三日は、刺激を投稿4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。上清を捨て、ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットル中に再懸濁し、24ウェルプレートにウェル当たり0.5〜1×10 ⁶ T細胞を播種する、とのrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。
4. 24時間後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットルで上清と再懸濁細胞を捨てて、のrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 6未感染の合計に対して、この手順を繰り返しイオン。
   注：感染症の数は、細胞株をパッケージングすることにより産生されたウイルスの力価に応じて最適化する必要があります。必要に応じて、毎日の細胞の20-30％を除去することにより流路T細胞が異常増殖を防止します。
5. 24時間最後の感染後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。さらなる培養のためのrhIL-2の100 IU / mlのRPMI培地中で上清と再懸濁細胞を捨てます。
6. 2~3日ステップ3.5、15分間、4℃で30分間、4℃でHLAマルチマーで染色T細胞は、抗ヒトCD3および共受容体モノクローナル抗体（mAb）の後。フローサイトメトリーによって分析します。 ¹⁹ - （3 図1）陰性対照として無関係の多量体および/または非形質導入細胞を使用してください。
7. 導入された中心hemichainがTCRα鎖である場合は^、20フローサイトメトリーにより、市販のVβ特異的抗体のパネルを使用してデノボ多量体陽性細胞のVβの使用状況を分析。

4.クローニング・デ・ノボ TCRカウンターhemichains

1. フロー支援細胞選別によって、ステップ3.6で新たに多量陽性集団をソートします。
2. 酸グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法^{21,2 2を}使用してソートT細胞からRNAを単離します。
   注：RNAを-80℃で保存することができるが、できるだけ早くのcDNAを生成するために使用されるべきです。
3. 製造業者のプロトコル^23,24以下の市販の逆転写酵素PCRキットを用いて抽出したRNAからcDNAライブラリーを合成します。
4. TCRβカウンター鎖をクローニングした場合、ステップ3.7で決定されるように、Vβ遺伝子とTCRβ定常領域特異的なプライマーを設計し、ステップ1.3から1.9に記載されているように、全長TCRβ遺伝子をクローニングします。カウンターチェーンがTCRαであればそうでない場合は5.1に進み、ステップ4.5を参照してください。
5. 市販のVα特異的抗体が限られている、したがって、Vα遺伝子の使用はできませんフローサイトメトリーによって決定されます。市販の5 'RACEキット^6を用いて、cDNA末端の5'迅速増幅^{（RACE）25を}介してクローンTCRαカウンター鎖、。
   1. 製造業者のプロトコルに従ってステップ4.2で抽出されたRNAから5 'RACE互換性のcDNAを合成。
   2. 表2に記載したように第¹ラウンドのPCRを行います。
   3. PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、1,100 bpsのバンドを溶出します。
   4. テンプレートとして第¹回目のPCR産物を使用して、 表3に記載されているように第²ラウンドのPCRを行います。
      注： 表3の下に示すプライマー配列をEcoRIおよびNotIにクローニングするために設計されたのPMXベクターを消化しました。
   5. PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、約1000 BPSのバンドを溶出します。
   6. EcoRIとNotIにクローンTCRα遺伝子をするpMXベクターおよびプリ消化しましたステップ1.5から1.9に記載されているように年度のプラスミド。

5.再構成新規抗原特異的TCRクローン

注：培養ジャーカット細胞を76及び10％のFCSおよび50μg/ mlのゲンタマイシンを補充したRPMI培地中でその後の細胞株。すべてのステップの間、5％CO ₂で37℃で細胞をインキュベートします。

1. ステップ2.3で作製293GPGウイルスを使用して中心のTCR hemichainと（ ^{- / -}ヒトT細胞株または同等TCR）ジャーカット76セル^26に伝達します。ジャーカット76、シードRPMI培地の1ウイルスのミリリットルと1ミリリットルで24ウェルプレート中のウェルあたり5×10 ⁴細胞について。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。
2. 感染後24時間は、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離によってhemichain形質導入されたジャーカット76細胞を収集します。さらなる培養のための新鮮なRPMI培地で上清と再懸濁を捨てます。
3. hemichainは2-3日ステップ5.2後にタグ付けされた分子である場合に染色することによって、形質導入された細胞を精製流れアシストまたは磁気アシストセル（オプション^）27をソートすることによって、その後抗NGFRモノクローナル抗体コンジュゲート蛍光体でる。
4. ステップ2.1〜2.3に続いて、293GPGウイルスはステップ4.4または4.5からクローン化TCRを反鎖をコード生成します。
5. 完全にTCRを再構成するには、安定的にステップ5.4からウイルスを用いて、ステップ5.1から5.3で生成された中心のTCRのhemichainを発現するT細胞株を形質導入します。ステップ5.1から5.2に記載されているように形質導入を行います。
6. 2-3日ステップ5.5 ²⁷の後に、製造業者のプロトコルに従って抗CD3磁気補助セルソーティングを使用して、CD3 ⁺トランスフェを精製します。
7. 、抗原特異性を検証し、抗CD3および/またはコレセプターモノクローナル抗体、およびHLA多量で、様々なカウンター鎖と対をなす中心のTCRのhemichainで構成されるクロノタイプTCRを発現するトランスフェクタントを染色するために、3~5日は、CD3精製を投稿してください。 ¹⁹ -フローサイトメトリーによる細胞（5 図4）を分析します。

結果

チェーン中心であるhemichainの予備知識なしに、TCRα及びTCRβ鎖を別々にクローン化されるべきであり、HLA-A24 / WT1反応TAK1 TCR（ 図1）の場合に行われた末梢血T細胞への形質導入します。 TAK1βの形質導入は、抗原特異的T細胞の顕著に高い頻度が得られました。逆に、非中心hemichainの形質導入は、TAK1α鎖（ 図1）で見られるように、 デノボ多...

ディスカッション

この方法の成功した適用のための最初の要件は、関心のhemichain一次T細胞の十分な変換効率を達成することです。我々の経験、ヒト一次T細胞における導入遺伝子の安定的かつ効率的な発現のレトロウイルスベクターの結果として、パッケージング細胞株とするpMXとしてPG13を用いて組み合わせました。 PG13パッケージング細胞を形質導入効率を向上させるために高力価のパッケージング細胞を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026