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요약

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

초록

T 세포 수용체 (TCR도)의 면역 요법의 유망 양상으로 종양 타겟팅 T 세포의 특이성을 직접 임상 사용된다. 따라서, 다양한 종양 관련 항원에 대한 특정 복제 TCR도 많은 연구의 목표였다. 효과적인 T 세포 반응을 유도하기 위해, TCR 최적 친화력 표적 항원을 인식해야한다. 그러나, 복제 등의 TCR도는 도전과 많은 사용할 수 TCR도하고 동족 항원에 대한 차선의 친 화성을 가지고있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 hemichain의 중심성을 이용하여 기존 TCR도를 사용하여 드 노보 선호도가 높은 항원 특이 TCR도를 복제하는 방법을 설명합니다. 이는 일부 TCR도, 각 TCRα 또는 TCRβ hemichain의 항원 인식에 동일하게 기여하지 않는 것으로 알려져 있으며, 지배적 hemichain는 중심 hemichain로 지칭된다. 우리는 원래 반 체인에서 다른 반 체인으로 중심 hemichain 페어링하여, 우리는 항원의를 유지할 수 있음을 보여 주었다pecificity, 동족 항원 상호 작용의 강도를 조절하면서. 따라서, 주어진 TCR의 치료 가능성은 중심과 대향 hemichains 사이의 페어링을 최적화함으로써 개선 될 수있다.

서문

T 세포 수용체 (TCR도)는 TCRα 및 TCRβ 쇄로 이루어지는 T 림프구에 의해 발현 이종 적응 면역 수용체이다. 그들은 HLA / 펩타이드 복합체의 거의 무한대의 구성을 인식 할 수있는 매우 다양한 레퍼토리를 생산 V (D) J 유전자 세그먼트의 체세포 재 배열을 통해 생성된다. 임상 종양 관련 항원에 대한 clonotypic TCR도의 특정을 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포는 암 (1)의 다양한 효능을 증명하고있다. 그러나, 이러한 목적을 위해 많은 클론 TCR도 그들의 치료 학적 적용을 제한 관심있는 항원에 충분한 친 화성이 부족하다.

여기서는 체인 중심성을 이용하여 기존의 TCR도이 제한을 극복하는 방법을 설명한다. 그것은 하나의 TCR의 hemichain는 표적 항원이 인식에서 더 지배적 인 역할을 할 수 있다고보고되고있다, 여기 중심성 불린다. 크리스탈 구조 분석은 하나의 중심을 보여 주었다TCR의 hemichain는 3,4 복잡 MHC / 펩타이드의 공간의 대부분을 설명 할 수있다. 이 개념을 사용하여, 우리는 이전에 SIG35α TCRα가 TCRβ 체인의 다양한 레퍼토리와 페어링 및 HLA-A2 (5)에 의해 제시된 MART1 27-35 펩타이드에 대한 반응성을 유지할 수 있음을 증명하고있다. 유사한 결과는 중심 TCRβ의 hemichain 다양한 TCRα 사슬과 페어링 및 HLA-A24 (6)에 의해 제공되는 WT1 펩티드 235-243 반응성을 유지 TAK1 TCR로 얻었다. MART1 및 WT1 모두 종양 관련 항원이다. 체인 중심성은 다른 Vβ11 TCRβ 체인 (7) 인간하여 iNKT TCR도의 불변 Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα 체인을 페어링하여, CD1d 제한 불변 자연 살해 (인 iNKT) TCR도의 항원 인식을 연구하기 위해 적용되었다.

모든 경우에서는 트랜스로 TCR도의 드 노보 레퍼토리를 생성 할 수 있었다도입 hemichain이 내생 TCRα 또는 TCRβ 카운터 사슬와 결합 말초 혈액 T 세포에 중심 TCR의 hemichain를으로 줄. 본질적으로, 중심 hemichain 함께 쌍으로 관심의 항원 특이성을 유지 TCR도 형성하면서도 친 화성 변화 적절한 이의 사슬을 식별하는데 사용될 수있는 미끼로서 기능한다. 이러한 신규 레퍼토리에서, 우리는 기존에 비하여 TCR도 표적 항원에 대해 향상된 상호 작용 강도 clonotypic TCR도를 분리 할 수 ​​있었다. 따라서, 우리는이 방법이 임상 응용 프로그램에 대한 최적의 TCR도를 식별하는 파이프 라인을 가속화 할 전망이다.

프로토콜

1. 레트로 바이러스가 관심의 인코딩 TCR Hemichain를 구축 준비

  1. 후속 단계에서 TCR 유전자의 삽입을 허용하도록 PMX 벡터 선형화. 3 시간 동안 37 ° C (표 1)에 제한 효소 EcoRI과 NotI을 제한 효소로 플라스미드 DNA를 소화 8.
  2. 1.2 % 아가 로스 겔에 소화 플라스미드의 전기 영동을 수행하십시오. 소비세 약 4,500 염기쌍 (BPS)의 밴드 및 용출은 30 ㎕의 멸균 수에 시판 겔 추출 키트 (9)를 사용.
  3. 또한 PMX 벡터, 각각 8의를 EcoRI 및 NotI을 소화 사이트를 겹쳐 15 ~ 20 BPS를 인코딩 관심의 TCR 유전자 설계 5 '및 3'프라이머.
  4. 프라이머와 TCR 유전자를 증폭. 단계 1.2에 설명 된대로 약 1,000 BPS의 PCR 제품 및 용출 밴드의 전기 영동을 수행하십시오.
  5. 시판되는 플라스미드를 각각 선형 단편을 조합함으로써 소화 벡터에 TCR 유전자를 복제어셈블리 마스터 믹스 시약을 1 시간 동안 50 ° C에서 배양.
    주 : 각 구성 요소의 상대적 볼륨에 대한 제조 업체의 프로토콜을 참조하십시오. 이 조립 방법은 원래 깁슨 외. (10)에 의해 기술 된 방법에 기초한다.
  6. (선택 사항) 태그 TCR 유전자가 인간의 신경 성장 인자 수용체의 절단 된 형태로 세포를 형질 표시하려면 (ΔNGFR, 아미노산 1-277) (11)는 furin 분열 사이트, 세린 - 글리신 링커에 의해 분리하고, 2A는 12, 13을 시퀀스. 단편의 단부를 중첩 및 단계 1.3-1.5에 기재된 플라스미드를 조립 설계 프라이머 코딩 서열.
    참고 :이 시퀀스는 참조 11-13에서 찾을 수 있습니다.
  7. 화학적으로 유능한 E. 변환 제조 업체의 프로토콜 (14) 다음 조립 플라스미드를 가진 대장균. 한천 접시에 씨앗 변형 박테리아 (20 ㎎ / ㎖ 원성 국물 (LB), 15 ㎎ / ㎖ 한천, 1 μg의 / ㎖ 암피실린), 18 시간 동안 37 ° C에서 품어.
  8. 문화 37 ° C 및 분 당 200 원에서 진탕 배양기에서 16 시간 동안 50 LB 배지 ㎖ (20 ㎎ / ㎖ LB 1 μg의 / ㎖ 암피실린)에서 하나의 박테리아 식민지.
  9. 제조 업체의 프로토콜 시판 midiprep 키트를 사용하여 플라스미드를 정제. 약 1 μg의 / μL의 농도에 플라스미드를 희석.
    주 : 플라스미드 정제 프로토콜은 알칼리 추출 방법 (15)에 기초한다.

2. 생성 안정 포장 세포주

참고 : 293GPG 및 PG13 두 세포가 부착된다. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 된 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충. 형질 전환 이전에 1 μg의 / ㎖ 테트라 사이클린과 문화 293GPG 세포. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.

  1. 단계 1.9, USI에서 얻은 hemichain 인코딩 벡터와 T75 플라스크에 16 배양 형질 293GPG 포장 세포제조사의 프로토콜 1~7 시판되는 형질 감염 시약 겨. 참고 : 50-60%의 포화 상태에서의 형질 293GPG 세포.
  2. 대기음 293GPG 세포 매체와 신선한 DMEM 매체 일일 포스트 형질 10 ㎖를 추가합니다.
  3. 수확은 일시적으로 이일 주사기에 배지를 전달하고 0.45 μm의 필터를 통과하여 단계 2.2 이후 형질 293GPG 세포로부터 바이러스를 생산했다.
    참고 : 바이러스는 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
  4. T25 플라스크 문화는 1 × 10 5 PG13 세포. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 어느 날 기음 문화 매체와 폴리 브렌 8 μg의 / ㎖와 함께, 단계 2.3 및 1.5 ml의 DMEM 매체로부터 293GPG 유래 바이러스의 1.5 ml를 추가 한 후.
  5. 4 일 동안 하루에 한 번 단계 2.4에 설명 된대로 관심의 TCR의 hemichain를 인코딩 안정 PG13 포장 세포주 생산 레트로 바이러스를 설정, 매체를 변경합니다.
  6. 대기음 매체 및 교체24 시간 더 배양을위한 마지막 감염 후 PG13 세포주에 대한 신선한 DMEM 매체와.
    주 : 0.05 % 트립신 EDTA 용액으로 분리하여 냉동 또는 하위 문화 세포.
  7. 세포를 시딩 한 후 단계 2.3 사흘 바와 같이 형질 도입 PG13 세포주에서 바이러스 T75에서 2 × 106 세포를 10 mL의 DMEM 배지로 플라스크 배양 및 수확 바이러스를 생성한다.
    주 : 바이러스 가장 즉시 사용되지만, 최대 두 달 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다.

3. 활성화 및 형질 인간 T 세포

참고 : 인간의 샘플을 얻을 및 기관 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 사용됩니다. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 문화의 기본 인간의 세포 (RPMI) 매체는 10 % 인간 혈청 대신 FCS 및 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신으로 보충. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.

  1. 밀도 분리 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)제조 업체의 프로토콜 (18) 다음 그라데이션 분리.
  2. 레트로 바이러스 감염에 필요한 증식을 유도하는 T 세포를 활성화. 재조합 인간 인터루킨 2 항 CD3 단클론 항체 (rhIL-2) 및 50 ng를 / ㎖의 100 IU / ㎖와 RPMI 배지 5 ㎖ 6 웰 플레이트에 웰 당 문화 2 × 10 7 신선한 또는 해동 PBMC, (클론 OKT3).
  3. 세 일, 자극을 게시 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 상청액을 폐기하고, 단계 270에서 PG13 바이러스 1 ㎖에 재현 탁하고, 24 웰 플레이트에 웰 당 0.5 × 106 T 세포를 시드와 rhIL-2, 200 IU / ㎖로 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖. 원심 분리기 1000 XG에 접시와 1 시간 동안 32 ° C.
  4. 24 시간 후, 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 단계 2.7에서 PG13 바이러스 상등액 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 폐기하고, rhIL-2, 200 IU / ㎖로 보충 된 RPMI 배지 1 ㎖. (6)을 감염의 총에 대해이 단계를 반복합니다이온.
    참고 : 감염의 수 세포주 포장에 의해 생성 된 바이러스의 역가에 따라 최적화되어야한다. 필요한 경우 매일 세포의 20 ~ 30 %를 제거하여 통로 T 세포 과증식을 방지 할 수있다.
  5. 24 시간 마지막 감염 후 4 분 동안 350 XG에 피펫과 원심 분리기에 의해 T 세포를 수집합니다. 또한 문화 rhIL-2의 100 IU / ㎖와 RPMI 배지에서 뜨는에 resuspend 세포를 폐기하십시오.
  6. 2-3일 단계 3.5, 15 분 동안 4 ° C에서 30 분 동안 4 ° C, 다음 항 인간 CD3에서 HLA의 다량 체와 공동 수용체 단클론 항체 (단클론 항체)와 얼룩 T 세포 후. 유동 세포 계측법에 의해 분석합니다. 19 - 관련성이 다량 체 및 / 또는 음성 대조군 (3 그림 1)과 같은 untransduced 세포를 사용합니다.
  7. 도입 중심 hemichain가 TCRα 체인 경우 20 유세포 시판 Vβ 특정 항체의 패널을 사용하여 새로이 합체 양성 세포 Vβ 사용을 분석한다.

4. 복제 드 노보 TCR 카운터 hemichains

  1. 흐름 이용한 세포 분류에 의해 단계 3.6 정렬 드 노보 다량 체 긍정적 인 인구.
  2. 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출법 21,2 (2)를 사용하여 정렬 T 세포로부터 RNA를 분리.
    주 : RNA는 -80 ℃에서 저장 될 수 있지만, 가능한 한 빨리의 cDNA를 생성하는데 사용되어야한다.
  3. 제조 업체의 프로토콜 23, 24 다음 시중에서 판매하는 역전사 효소-PCR 키트를 사용하여 추출 된 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 합성.
  4. TCRβ 카운터 - 체인을 복제하는 경우, 전체 길이를 단계 3.7에서의 결정에 따라, Vβ 유전자와 TCRβ 불변 영역 특정 프라이머를 설계하고, 복제 TCRβ 단계 1.3-1.9에서 설명하는 유전자있다. 그렇지 않으면 5.1 단계로 진행 단계 카운터 체인 TCRα 경우 4.5를 참조하십시오.
  5. 시판 Vα 특정 항체가 제한된다, 따라서 Vα 유전자의 사용은 할 수 없습니다유동 세포 계측법에 의해 결정된다. cDNA를 종료 (RACE) 25 5'-빠른 증폭을 통해 복제 TCRα 카운터 - 체인, 5 'RACE 키트 (6) 시판 사용.
    1. 제조 업체의 프로토콜 다음 단계 4.2에서 추출 RNA의 5 'RACE 호환의 cDNA를 합성.
    2. 표 2에 기술 된 바와 같이 1 차 라운드 PCR을 수행합니다.
    3. PCR 산물의 전기 영동을 수행하여 단계 1.2에 기재된 바와 같이, 약 1,100의 BPS 밴드를 용출.
    4. 주형으로서 1 차 라운드 PCR 생성물을 사용하여, 표 3에 기재된 바와 같이 2 차 라운드 PCR을 수행한다.
      참고 : 표 3에서 나타낸 프라이머 시퀀스를 EcoRI 및 NotI에에 복제를 위해 설계되었습니다는 PMX 벡터를 소화.
    5. PCR 산물의 전기 영동을 수행하여 단계 1.2에 기재된 바와 같이, 약 1,000의 BPS 밴드를 용출.
    6. 를 EcoRI 및 NotI에로 복제 TCRα 유전자 PMX 벡터와 푸리을 소화같은 년도 플라스미드 단계 1.5-1.9에 설명.

5. 재구성 소설 항원 특이 적 TCR 클론

주 : RPMI 배지에서 배양 된 Jurkat 세포 (76) 및 후속 세포주는 10 % FCS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신으로 보충. 모든 단계 사이의 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.

  1. 단계 230에서 생성 293GPG 바이러스를 이용하여 중심의 TCR hemichain으로 (사람 T 세포주 - - / 또는 등가 TCR)는 Jurkat 세포 76 (26) 형질 도입. 주르 케트 (76) 씨 RPMI 매체의 1 바이러스 mL 및 1 ml의 24 웰 플레이트에 웰 당 5 × 10 4 세포하십시오. 원심 분리기 1000 XG에 접시와 1 시간 동안 32 ° C.
  2. 24 시간 감염 후 4 분 동안 350 XG에 hemichain 형질 도입 된 Jurkat에게 피펫과 원심 분리기 76 세포를 수집합니다. 또한 문화에 대한 신선한 RPMI 매체에 뜨는 및에 resuspend 폐기하십시오.
  3. hemichain이 2-3일 단계 5.2 이후 태그 분자의 경우 얼룩에 의해, 형질 세포를 정화흐름 보조 또는 자기 보조 세포 (옵션) (27)를 정렬 한 다음 반 NGFR 단클론 항체 결합 형광으로 보내고.
  4. 단계 2.1 2.3에 따라, 293GPG 바이러스가 단계 4.4 또는 4.5에서 클로닝 TCR 카운터 체인을 인코딩 생산하고 있습니다.
  5. TCR을 완전히 재구성 안정적으로 단계 5.4로부터의 바이러스를 사용하는 단계 5.1-5.3에서 생성 중심의 hemichain TCR을 발현하는 T 세포주를 형질 도입. 단계 5.1-5.2에 설명 된대로 전달을 수행합니다.
  6. 2~3일 단계 5.5 27 후, 제조 업체의 프로토콜 다음 항 CD3에게 자기를 이용한 세포 정렬을 사용하여 CD3 + 형질을 정화.
  7. 항원 특이성을 확인하려면, 항 CD3 및 / 또는 공동 수용체 단클론 항체, 및 HLA의 다량 체와 다양한 반 사슬과 쌍을 이루는 중심 TCR의 hemichain 구성 clonotypic TCR도를 발현하는 형질 얼룩 3-5 일 CD3 정화를 게시합니다. 19 - 유동 세포 계측법 (5 그림 4)에 의한 세포를 분석 할 수 있습니다.

결과

사전 지식없이하는 hemichain의 TCRα 및 TCRβ 체인은 별도 복제 및 HLA-A24 / WT1 반응 TAK1 TCR (그림 1)의 경우에 이루어졌다 말초 혈액 T 세포에 형질 도입해야 체인 중심이다. TAK1β의 전달은 항원 특이 적 T 세포의 현저히 더 높은 주파수를 수득 하였다. 반대로, 비 중심 hemichain의 전달은 드 노보 합체 양성 T 세포 TAK1α 체인 것과 같이 (도 1)를 산출하...

토론

이 방법을 성공적으로 적용하는 첫 번째 요건은 관심 hemichain 일차 T 세포의 충분한 전달 효율을 달성한다. 경험 인간 T 세포 주에서 도입 유전자의 안정하고 효율적인 발현 레트로 바이러스 벡터의 결과로서 패키징 세포주와 PMX로서 PG13를 사용하는 조합. PG13 패키징 세포는 형질 도입 효율을 향상시키는 고역가 포장 셀 선택 클로닝 단일 셀 수있다. 또한, T 세포 증식은 또한 레트로 바이러스에 의?...

공개

The University Health Network has filed a patent related to this methodology on which N.H., M.N., and T.O. are named as inventors. The other authors have no financial conflicts of interest.

감사의 말

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAWisent Bioproducts325-043-CL
293GPG cellsGenerated by Ory et al. (ref 8)
AgarWisent Bioproducts800-010-CG
AgaroseWisent Bioproducts800-015-CG
Ampicillin sodium saltWisent Bioproducts400-110-IG
ChloroformBioShopCCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447L
DMEM, high glucose, pyruvateLife Technologies11995065
EcoRINew England BiolabsR0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction KitBS353
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483020
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
FilterCorning4312200.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAbBiolegend345104clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAbBiolegend300440clone UCHT1
GentamicinLife Technologies15750078
Gibson Assembly Master MixNew England BiolabsE2611Lused for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamerProimmunedepends on antigenic peptideHLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomersNIH Tetramer Core Facilitymultimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serumValley BiomedicalHP1022
human CD3 microbeadsMiltenyi Biotec130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire KitBeckman CoulterIM3497
Jurkat 76 cellsGenerated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB BrothWisent Bioproducts800-060-LG
LS MACS columnMiltenyi Biotec130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2987I
NEBuffer 3.1New England BiolabsB7203Sused for EcoRI and NotI digestion
NotINew England BiolabsR0189S
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAbBeckman CoulterB21205clone B9.11
PG13 cellsATCCCRL-10686
Phusion HF Buffer PackNew England BiolabsB0518S
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530L
pMX retroviral vectorCell BiolabsRTV-010
polybreneSigma-AldrichH-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)Novartisby Rx onlyequivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibodyBiolegend317301clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640Life Technologies11875119
SA-PELife TechnologiesS866used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  KitClontech634858
Sterile waterWisent Bioproducts809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18080051for cDNA synthesis
SyringeBD30160410 ml, slip tip
Tetracycline hydrochlorideSigma-AldrichT7660
TransIT-293Mirus BioMIR 2700used to transfect 293GPG cells
TRIzol ReagentLife Technologies15596026

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