Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

Resumo

Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.

Resumo

receptores de células T (TCR) são utilizados clinicamente para dirigir a especificidade das células T para tumores alvo promissor como uma modalidade de imunoterapia. Por conseguinte, a clonagem de TCR específicos para vários antigénios associados a tumor tem sido o objectivo de muitos estudos. Para provocar uma resposta eficaz de células T, o TCR deve reconhecer o antigénio alvo com afinidade óptima. No entanto, a clonagem, tais TCRs tem sido um desafio e muitos TCRs disponíveis possuem afinidade sub-ótima para o antigénio correspondente. Neste protocolo, descrevemos um método de clonagem de novo de alta afinidade TCRs antígeno-específicas usando TCRs existentes, explorando hemichain centralidade. Sabe-se que para algumas TCR, cada TCRα ou TCRβ hemichain não contribuem igualmente para o reconhecimento do antigénio, e a hemichain dominante é referido como o hemichain centrada. Nós mostramos que, emparelhando o hemichain centrado com contra-correntes diferentes da cadeia contador original, somos capazes de manter o antígeno specificity, enquanto modula a sua força de interação para o antigénio cognato. Assim, o potencial terapêutico de um determinado TCR pode ser melhorada pela optimização do emparelhamento entre as centrais e contador hemichains.

Introdução

receptores de células T (TCR) são receptores heterodiméricos imunes adaptativas expressa por linfócitos T, compostas por uma cadeia TCRα e TCRβ. Eles são gerados por meio de rearranjo somático de V (D) J segmentos de genes, o que produz um repertório diverso altamente capazes de reconhecer configurações virtualmente ilimitado de complexos de HLA / péptido. Clinicamente, as células T manipuladas para expressar clonotípico TCRs específicos para antigénios associados a tumores demonstraram eficácia em uma variedade de cancros ^1. No entanto, muitos TCRs clonados para este propósito não têm afinidade suficiente para o antigénio de interesse, o que limita a sua aplicação terapêutica.

Aqui, descrevemos um método para superar esta limitação para TCRs existentes, explorando cadeia de centralidade. Tem sido relatado que um hemichain TCR poderia desempenhar um papel mais dominante no reconhecimento do antigénio alvo ^2, aqui denominado centralidade. análises estruturais de cristal têm mostrado que um centradahemichain de um TCR poderia ser responsável pela maior parte da pegada do MHC / péptido complexo ^3,4. Utilizando este conceito, já anteriormente demonstrado que a SIG35α TCRα pode emparelhar com um repertório diversificado de cadeias TCRβ e manter a reactividade contra o peptídeo MART1 _27-35 apresentado por HLA-A2 ^5. Resultados semelhantes foram obtidos com o TCR TAK1, onde o hemichain TCRβ centrada emparelhado com várias cadeias TCRα e mantida a reactividade para o péptido WT1 _235-243 apresentado por HLA-A24 ^6. Ambos MART1 e WT1 são antigénios associados a tumores. Chain-centricity também foi aplicado para estudar o reconhecimento do antígeno de TCR CD1d-restritas invariantes natural killer (iNKT), emparelhando a invariante cadeia Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα de TCRs iNKT humanos com diferentes cadeias Vβ11 TCRβ ^7.

Em todos os casos, fomos capazes de gerar um repertório de novo de TCR por transdução do hemichain TCR centric às células T do sangue periférico, onde a hemichain introduzido emparelhados com o TCRα endógena ou TCRβ contra-correntes. Em essência, o hemichain centrada serve como um isco, que pode ser usado para identificar as contra-correntes adequadas, as quais quando combinadas em conjunto formam TCRs que mantêm a especificidade do antigénio de interesse, mas variando na afinidade. A partir destes novos repertórios, fomos capazes de isolar TCR clonotípicas com uma resistência melhorada contra a interacção do antigénio alvo em comparação com os TCRs pré-existentes. Portanto, acreditamos que este método irá acelerar o gasoduto de identificar TCRs ideais para aplicação clínica.

Protocolo

1. Preparar Retroviral construção que codifica TCR Hemichain de Interesse

1. Linearizar pMX vector para permitir a inserção de um gene de TCR em passos subsequentes. Digerir o ADN de plasmídeo com enzimas de restrição EcoRI e NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabela 1) ^8.
2. Realizar a eletroforese do plasmídeo digerido em 1,2% em gel de agarose. Banda especial de consumo de aproximadamente 4.500 pares de base (bps), e eluir em 30 mL de água estéril usando comercialmente disponíveis kits de extração de gel ^9.
3. Design de 5 'e 3', os iniciadores para o gene de TCR de interesse que também codificam 15-20 pb que se sobreponham ao local digestão com EcoRI e Notl do vector pMX, respectivamente ^8.
4. Amplificar o gene do TCR com primers. Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
5. Clonar o gene do TCR no vector digerido por combinação de cada fragmento linear com o plasmídeo disponível comercialmentemestre montagem reagente mistura e incubando a 50 ° C durante 1 h.
   NOTA: Consulte o protocolo do fabricante para os volumes relativos de cada componente. Este método de montagem é baseada na técnica originalmente descrita por Gibson et ai. ^10.
6. (Opcional) Tag gene TCR para marcar as células transduzidas com a forma truncada do receptor do factor de crescimento do nervo humano (ΔNGFR, aminoácidos 1-277) ¹¹ separados por local de clivagem de furina, ligante serina-glicina, e 2A sequências ^12,13. sequências de codificação de conceber iniciadores que se sobrepõem as extremidades do fragmento e montar plasmídeo como descrito nas etapas 1,3-1,5.
   NOTA: Estas sequências podem ser encontradas nas referências ^11-13.
7. Transformar E. quimicamente competente coli com o plasmídeo montados seguindo o protocolo do fabricante ^14. Semente bactérias transformadas sobre placas de agar (20 mg / ml de caldo lisogenia (LB), 15 mg / ml de agar, e 1 ug / ml de ampicilina) e incubar a 37 ° C durante 18 h.
8. A cultura de uma colónia única bactéria em 50 ml de meio LB (20 mg / ml de LB e 1 ug / ml de ampicilina) durante 16 horas numa incubadora com agitação a 37 ° C e 200 ciclos por minuto.
9. Purifica-se os plasmídeos utilizando estojos comercialmente disponíveis Midiprep seguindo o protocolo do fabricante. Dilui-se o plasmídeo a concentração de cerca de 1 ug / uL.
   NOTA: O protocolo de purificação de plasmídeo baseia-se no método de extracção alcalina ^15.

Linha celular de empacotamento estável 2. Geração

NOTA: Tanto as células 293GPG e PG13 são aderentes. Células de cultura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 50 ug / ml de gentamicina. 293GPG células de cultura com 1 ug / ml de tetraciclina antes da transfecção. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO ₂ entre todos os passos.

1. 293GPG transfectar células de empacotamento ¹⁶ em cultura em balão T75 com o vector que codifica hemichain obtido na etapa 1.9, USIng reagente de transfecção disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante ^{1 7.} NOTA: As células transfectar 293GPG a 50-60% de confluência.
2. médio aspirado para 293GPG células e adicionar 10 ml de fresco DMEM meio 1 dia pós transfecção.
3. Colheita transitoriamente produzidos vírus a partir de células transfectadas 293GPG 2 dias após o passo 2.2 pela transferência de meio de cultura a seringa e que passa através do filtro de 0,45 um.
   NOTA: O vírus pode ser utilizada imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso futuro.
4. Culturas 1 x 10 ⁵ células em PG13 frasco T25. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Após um dia, meio de cultura aspirado e adicionar 1,5 ml de vírus 293GPG derivado a partir do passo 2.3 e 1,5 ml de meio DMEM, juntamente com 8 ug / ml de polibreno.
5. Mudar a forma como descrito no passo 2.4, uma vez por dia durante 4 dias, para estabelecer que produzem retrovírus estável linha celular de empacotamento PG13 codificando o hemichain TCR de interesse.
6. Aspirar médio e substituircom meio DMEM fresco para linhas celulares PG13 24 horas após a última infecção para posterior cultura.
   NOTA: congelar ou sub-cultura de células por destacando com solução de tripsina-EDTA 0,05%.
7. Para produzir vírus de linhas celulares transduzidas PG13, a cultura 2 x 10 ⁶ em células T75 frasco com 10 ml de meio DMEM, e vírus da colheita, tal como descrito na etapa 2.3 três dias após a sementeira das células.
   NOTA: Vírus é melhor usado imediatamente, mas pode ser armazenado a -80 ° C durante até dois meses.

3. A activação e Transdução de células T humanas

NOTA: As amostras humanas são obtidas e utilizadas de acordo com os protocolos aprovados da comissão de ética institucionais. células humanas primárias em cultura de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de soro humano em vez de FCS e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO ₂ entre todos os passos.

1. Isolar células periféricas humanas mononucleares do sangue (PBMC) por densidadeseparação por gradiente seguindo o protocolo do fabricante ^18.
2. Activar as células T para induzir a proliferação necessário para a infecção retroviral. Cultura de 2 x 10 ⁷ PBMC frescas ou descongeladas por poço em placas de 6 poços, em 5 ml de meio RPMI com 100 UI / ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2) e 50 ng / ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone).
3. Três dias após a estimulação, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Elimine o sobrenadante e sementes de 0,5-1 x 10 ⁶ células T por poço em placas de 24 poços ressuspensas em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h.
4. Após 24 horas, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Repita este passo para um total de 6 Infectíons.
   NOTA: Número de infecções deve ser optimizada, dependendo título do vírus produzido pela linha celular de empacotamento. Se necessário, as células T por remoção de passagem de 20-30% das células de cada dia para prevenir o crescimento excessivo.
5. 24 h após a última infecção, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI com 100 UI / ml de rhIL-2 para posterior cultura.
6. 2-3 dias após a etapa 3.5, as células T com mancha multímero de HLA, a 4 ° C durante 30 min, em seguida, CD3 anti-humano e anticorpos monoclonais do co-receptor (mAb) a 4 ° C durante 15 min. Analisar por citometria de fluxo. Use multímero irrelevante e / ou células não transduzidas como controlos negativos (Figura 1 - 3) ^19.
7. Se o hemichain centric introduzido é uma cadeia TCRα, analisar o uso Vp dos de novo multimero células positivas utilizando o painel de anticorpos específicos de Vp comercialmente disponível por citometria de fluxo ^20.

4. Clonagem De Novo TCR Counter-hemichains

1. Ordenar o novo população positiva de multimero no passo 3,6 por separação de células assistida por fluxo.
2. Isolar o ARN a partir de células T classificados usando o guanidínio ácido tiocianato-fenol-clorofórmio método de extracção de ^{2 21,2.}
   NOTA: o RNA pode ser armazenado a -80 ° C, mas devem ser utilizadas para gerar ADNc tão rapidamente quanto possível.
3. Sintetizar biblioteca de ADNc a partir de ARN extraído utilizando kits de transcriptase reversa-PCR disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante ^23,24.
4. Se a clonagem TCRβ contra-correntes, projetar gene Vp e região constante primers específicos TCRβ, conforme determinado na etapa 3.7, e clonar full-length TCRβ genes como descrito nos passos 1,3-1,9. Veja o passo 4.5 se contra-corrente é TCRα, caso contrário, continue para o passo 5.1.
5. Comercialmente os anticorpos específicos-Va disponíveis estão limitados, assim, o uso de genes Va não podeser determinada por citometria de fluxo. Clone TCRα contra-correntes através de amplificação 5'-rápida de extremidades de cDNA (RACE) ^25, utilizando comercialmente disponível 5 kits RACE ^«6.
   1. Sintetizar 5 'RACE de cDNA compatível partir de RNA extraído no passo 4.2, seguindo o protocolo do fabricante.
   2. Execute ^1º PCR rodada, conforme descrito na Tabela 2.
   3. Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1100 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
   4. Realizar 2 ^ND ciclo de PCR como descrito na Tabela 3, utilizando-se um produto de PCR como molde redondo ^r.
      NOTA: As sequências dos iniciadores mostrados sob Tabela 3 foram desenhados para clonagem EcoRI e NotI digerido vector pMX.
   5. Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
   6. clonar genes TCRα em EcoRI e Notl vector digerido pMX e puriplasmídeos fy como descrito nos passos 1,5-1,9.

Clones de TCR antígeno-específica 5. Reconstituting Novel

NOTA: Cultura de Jurkat 76 células e linhas celulares subsequentes em meio RPMI suplementado com FCS a 10% e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO ₂ entre todos os passos.

1. Transduzir células Jurkat 76 ²⁶ (ou equivalente TCR ^{- / -} linha de células T humana) com hemichain TCR centrada utilizando vírus 293GPG produzido no passo 2.3. Para Jurkat 76, semente de 5 x 10 ⁴ culas por po em placa de 24 cavidades com 1 ml de vírus e de 1 ml de meio RPMI. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h.
2. 24 h após a infecção, recolhe hemichain Jurkat transduzidas 76 células por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender em meio RPMI fresco para posterior cultura.
3. Purificar células transduzidas se o hemichain é molecularmente marcado 2-3 dias após o passo 5.2, por coloraçãoing com fluoróforo conjugado anti NGFR-mAb seguido por assistida por fluxo ou célula magnética assistida classificação (opcional) ^27.
4. Seguindo os passos 2.1 a 2.3, produzem vírus 293GPG que codifica uma cadeia contador de TCR clonado a partir de passos 4.4 ou 4.5.
5. Para reconstituir integralmente a TCR, transdução de linha de células T expressando estavelmente o hemichain TCR centric gerado nas etapas 5,1-5,3 utilize o vírus a partir do passo 5.4. Realizar transdução como descrito nos passos 5,1-5,2.
6. Purificar CD3 ⁺ transfectantes utilizando anti-CD3 separação de células magnética assistida seguindo o protocolo do fabricante, 2-3 dias após o passo 5.5 ^27.
7. Para validar a especificidade do antigénio, manchar os transfectantes que expressam TCR clonotípicas compostos da hemichain TCR centrada emparelhado com vários contra-correntes, com os mAbs co-receptor de anti-CD3 e / ou, e multimero de HLA, 3-5 dias após a purificação CD3. Analise as células por citometria de fluxo (Figura 4-5) ^19.

Resultados

Sem o conhecimento prévio de que hemichain cadeia é centrada, a cadeia TCRα e TCRβ deve ser clonadas separadamente e transduzidos para células T de sangue periférico, o que foi feito no caso do HLA-A24 / WT1 reactivo TAK1 TCR (Figura 1). Transdução de TAK1β produziram uma frequência notavelmente mais elevada de células T específicas de antigénio. Por outro lado, a transdução de um hemichain não centrada não produziria de novo as células T posit...

Discussão

O primeiro requisito para a aplicação bem sucedida deste método é alcançar a eficiência de transdução suficiente de células T primárias com o hemichain de interesse. Na nossa experiência, a combinação de PG13 utilizando como linha celular de empacotamento e pMX como resultado o vector retroviral na expressão estável e eficiente do gene introduzido em células T humanas primárias. células de empacotamento PG13 pode ser clonado de uma única célula para seleccionar para células de empacotamento de títu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026