יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

Summary

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

Abstract

לקולטנים מצויים בתאי T (TCRs) משמשים קליני לכוון את הספציפיות של תאי T למקד גידולים כמו אופנות מבטיחות של אימונותרפיה. לכן, שיבוט TCRs הספציפית אנטיגנים סרטניים הקשורים שונים הייתה המטרה של מחקרים רבים. כדי לעורר תגובה של תאי T אפקטיבי, TCR חייב להכיר אנטיגן היעד עם זיקה אופטימלית. עם זאת, שיבוט כזה TCRs כבר אתגר ורבים זמין TCRs להחזיק זיקה תת אופטימלית עבור אנטיגן מאותו מקור. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה של שיבוט דה נובו זיקה גבוהה TCRs אנטיגן ספציפי באמצעות TCRs הקיים תוך ניצול מרכזיות hemichain. זה ידוע כי עבור חלק TCRs, כל TCRα או hemichain TCRβ לא לתרום באופן שווה הכרת אנטיגן, ואת hemichain הדומיננטי הוא המכונה hemichain הממוקדת. הראינו כי על ידי התאמת hemichain הממוקדת עם שרשרות דלפק שונות מדלפק השרשרת המקורית, אנו מסוגלים לשמור על אנטיגן specificity, תוך ויסות כוח האינטראקציה שלה עבור אנטיגן מאותו מקור. לפיכך, את הפוטנציאל הטיפולי של TCR נתון ניתן לשפר על ידי אופטימיזציה של זיווג בין hemichains ממוקדת הדלפק.

Introduction

לקולטנים המצויים בתאי T (TCRs) הם קולטנים החיסונית heterodimeric אדפטיבית שהביעו לימפוציטים מסוג T, מורכבת שרשרת TCRα ו TCRβ. הם מופקים באמצעות התארגנות סומטיים של V (D) קטעי גן J, המייצר רפרטואר מגוון מאוד מסוגל לזהות תצורות כמעט בלתי מוגבלות של מתחמי HLA / פפטיד. מבחינה קלינית, תאי T שהונדסו ספציפיים TCRs clonotypic עבור אנטיגנים גידולים הקשורים הוכיחו יעילות במגוון סוגי סרטן ^1. עם זאת, רבי TCRs משובט למטרה זו חסרה זיקה מספקת את האנטיגן של עניין, מגבילות מריחות הטיפולית שלהם.

כאן, אנו מתארים שיטה להתגבר על מגבלה זו על TCRs הקיים תוך ניצול-מרכזיות שרשרת. זה כבר דווח כי hemichain אחד TCR יכול לשחק תפקיד דומיננטי יותר לאות הוקרה על האנטיגן היעד ^2, כאן כינה מרכזית. ניתוחים מבניים קריסטל הראו כי ממוקד אחדhemichain של TCR יכול להסביר את רוב טביעת הרגל על פפטיד MHC / ^3,4 המורכב. תוך שימוש בקונספט זה, שהראנו בעבר כי SIG35α TCRα תוכל לשייך את רפרטואר מגוון של שרשראות TCRβ ולתחזק תגובתיות כנגד פפטיד MART1 _27-35 שהציג HLA-A2 ^5. תוצאות דומות התקבלו עם TAK1 TCR, שבו hemichain TCRβ ממוקדת זיווג עם שרשראות TCRα שונים ומתוחזק תגובתיות לייצור הפפטיד WT1 _235-243 שהציג HLA-A24 ^6. שניהם MART1 ו WT1 הם אנטיגנים גידולים הקשורים. שרשרת-מרכזיות יושמה גם ללמוד ההכרה אנטיגן של הרוצח הטבעי משתנה-מוגבל CD1d (iNKT) TCRs, על ידי הצמדת שרשרת Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα משתנה של TCRs iNKT אדם עם ⁷ שרשראות Vβ11 TCRβ שונים.

בכל המקרים, הצלחנו ליצור רפרטואר דה נובו של TCRs על ידי טרנסמחוללות hemichain TCR ממוקדת לתאי T דם היקפיים, שבו hemichain הציג לזווג עם TCRα אנדוגני או נגד רשתות TCRβ. בעיקרו של דבר, hemichain הממוקדת משמשת פיתיון שיכול לשמש לזיהוי נגד השרשרות המתאימות, אשר כאשר לזווג יחד יוצרות TCRs המקיים את הספציפיות אנטיגן של עניין, עדיין משתנות זיקה. ברפרטואר הרומן אלה, הצלחנו לבודד TCRs clonotypic עם כוח אינטראקציה משופרת נגד אנטיגן היעד לעומת TCRs קיימים. לכן, אנו מאמינים בשיטה זו תאיץ את צנרת זיהוי TCRs האופטימלי עבור יישומים קליניים.

Protocol

1. הכנת retroviral לבנות קידוד TCR Hemichain עניין

1. Linearize וקטור PMX לאפשר החדרה של גנים TCR בשלבים הבאים. לעכל את ה- DNA פלסמיד עם אנזימי הגבלה EcoRI ו NotI ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (טבלה 1) ^8.
2. לבצע אלקטרופורזה של פלסמיד מתעכל על 1.2% ג'ל agarose. להקה ובלו של כ -4,500 זוגות בסיסים (bps), ו elute ב 30 μl מים סטריליים באמצעות ערכות חילוץ ג'ל זמינות מסחרי ^9.
3. פריימרים עיצוב 5 'ו 3' עבור הגן TCR של עניין כי גם לקודד 15-20 bps חופפים באתר העיכול EcoRI ו NotI של וקטור PMX, בהתאמה ^8.
4. להגביר גן TCR עם פריימרים. לבצע אלקטרופורזה של מוצר ה- PCR הלהקה elute של כ -1,000 bps כמתואר בשלב 1.2.
5. Clone גן TCR לתוך וקטור מתעכל על ידי שילוב כל שבר ליניארי עם פלסמיד זמין מסחריהרכבת מיקס מאסטר מגיב דוגר על 50 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
   הערה: עיין הפרוטוקול של היצרן עבור כרכים יחסיים של כל רכיב. שיטת ההרכבה זה מבוסס על הטכניקה המתוארת במקור על ידי גיבסון et al. ^10.
6. (אופציונלי) הגן תג TCR לציון transduced תאים עם בגרסה מקוצרת של קולטן גורם הגדילה העצבי האדם (ΔNGFR, חומצות אמינו 1-277) ¹¹ מופרדות האתר מחשוף furin, מקשר גליצין-סרין, ו 2A רצפים ^12,13. רצפים קידוד פריימרים עיצוב חופפים את הקצוות שבר ולהרכיב פלסמיד כמתואר בשלבים 1.3-1.5.
   הערה: אלה רצפים ניתן למצוא אזכור ^11-13.
7. Transform כימי המוסמכות E. coli עם פלסמיד התאסף באי הפרוטוקול של יצרן ^14. זרע טרנספורמציה חיידקים על צלחות אגר (20 מ"ג / מרק lysogeny מ"ל (LB), 15 מ"ג / מ"ל ​​אגר, ו 1 מיקרוגרם / אמפיצילין מ"ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
8. תרבות מושבה חיידק יחיד 50 מ"ל של מדיום LB (20 מ"ג / מ"ל ​​LB ו 1 מיקרוגרם / אמפיצילין מ"ל) במשך 16 שעות בתוך חממה רועד ב 37 ° C ו -200 סיבובים לדקה.
9. לטהר פלסמידים באמצעות ערכות midiprep זמינות המסחרי הבאות הפרוטוקול של היצרן. לדלל פלסמיד ריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl.
   הערה: פרוטוקול הטיהור פלסמיד מבוסס על שיטת חילוץ אלקליין ^15.

2. יצירת שורת תאי אריזה יציבה

הערה: שניהם 293GPG ו PG13 תאים חסידים. תאי תרבות הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום עובר עגל 10% (FCS) ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. תרבות תאי 293GPG עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין לפני transfection. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ בין כל השלבים.

1. Transfect 293GPG אריזה תאים ¹⁶ בתרבית בבקבוק T75 עם וקטור hemichain קידוד שהושגו בשלב 1.9, using מגיב transfection זמין בעקבות פרוטוקול ^{1 7} של היצרן מסחרי. הערה: תאים Transfect 293GPG ב 50-60% confluency.
2. לשאוב בינוני עבור 293GPG תאים ולהוסיף 10 מ"ל של transfection פוסט יום בינוני 1 טרי DMEM.
3. קציר מיוצר וירוס זמני מתאי 293GPG טרנספקציה 2 ימים לאחר שלב 2.2 באמצעות העברת בינוני תרבות מזרק עובר דרך 0.45 מיקרומטר הסינון.
   הערה: וירוס ניתן להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי.
4. תרבות 1 x 10 ⁵ PG13 תאי בקבוק T25. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. אחרי יום אחד, בינוני תרבות לשאוב ולהוסיף 1.5 מ"ל של וירוס 293GPG הנגזרות משלב 2.3 ו -1.5 מ"ל DMEM בינוני, יחד עם 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​של polybrene.
5. שינוי המדיום כמתואר בשלב 2.4 פעם ביום במשך 4 ימים, להקים רטרו-וירוס לייצר קו תא אריזת PG13 יציב קידוד hemichain עניין TCR.
6. לשאוב בינוני ולהחליףעם מדיום DMEM טרי עבור שורות תאי PG13 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה לתרבות נוספת.
   הערה: להקפיא או תת-תרבות תאים על ידי ניתוק עם 0.05% טריפסין-EDTA פתרון.
7. כדי לייצר וירוס שורות תאים transduced PG13, תרבות 2 x 10 ⁶ תאים T75 בקבוקון עם 10 מ"ל DMEM בינוני, ווירוסים הקציר כמתואר בשלב 2.3 שלושה ימים לאחר זריעת התאים.
   הערה: וירוס עדיף להשתמש מיד אבל יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים.

3. הפעלה ו התמרה של תאים האנושיים T

הערה: דגימות אדם מתקבלות ומשומשות בהתאם הפרוטוקולים שאושרו בועדת אתיקה של מוסד רפואי. תאים אנושיים העיקרי תרבות במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני בתוספת 10% נסיוב אדם במקום FCS ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ בין כל השלבים.

1. לבודד תאי הדם היקפי mononuclear אדם (PBMC) על ידי צפיפותהפרדת שיפוע הבא הפרוטוקול של יצרן ^18.
2. הפעל תאי T לגרום התפשטות הנדרשת זיהום retroviral. תרבות 2 x 10 ⁷ PBMC טרי או מופשר היטב לכל צלחת 6-היטב, ב 5 מ"ל של מדיום RPMI עם 100 IU / ml-2 interleukin אנושי רקומביננטי (rhIL-2) ו -50 ng / ml של נוגדנים חד שבטיים אנטי CD3 (שיבוט OKT3).
3. שלושה ימים שלאחר גירוי, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. בטל supernatant וזרעי 0.5-1 x 10 ⁶ T תאים לכל היטב צלחת 24 גם resuspended ב 1 מ"ל של וירוס PG13 משלב 2.7, ו 1 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 200 IU / ml של rhIL-2. צלחת צנטריפוגה XG ב 1000 ו -32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
4. לאחר 24 שעות, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. מחק תאים supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של וירוס PG13 משלב 2.7, ו 1 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 200 IU / ml של rhIL-2. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 6 להדביקיונים.
   הערה: מספר הזיהומים צריך להיות מותאם בהתאם כייל של וירוס המיוצר על ידי אריזות קו סלולארי. במידת הצורך, מעבר בתאי T על ידי הסרת 20-30% של תאים בכל יום כדי למנוע צמיחת יתר.
5. 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. מחק תאים supernatant ו resuspend במדיום RPMI עם 100 IU / ml של rhIL-2 לתרבות נוספת.
6. 2-3 ימים לאחר שלב 3.5, תאי T הכתם עם multimer HLA על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז אנטי אנושי CD3 ו נוגדנים חד שבטיים לקולטן שיתוף (מבז) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לנתח ידי cytometry הזרימה. השתמש multimer הרלוונטי ו / או תאי untransduced שולט שלילי (איור 1 - 3) ^19.
7. אם hemichain ממוקדת הציג הינה רשת TCRα, ולנתח את השימוש Vβ של תאים חיוביים דה נובו multimer באמצעות זמינים מסחרית לוח נוגדן Vβ ספציפי על ידי זרימת cytometry ^20.

4. שיבוט דה נובו TCR מתפרצות hemichains

1. מיין האוכלוסייה החיובית דה נובו multimer בשלב 3.6 ידי מיון תא בסיוע זרימה.
2. לבודד RNA מן תאים ממוינים T בשיטת החילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium חומצה ^{21,2 2.}
   הערה: RNA יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, אך צריך לשמש כדי ליצור cDNA בהקדם האפשרי.
3. לסנתז ספריית cDNA מ- RNA חילוץ באמצעות ערכות transcriptase-PCR הפוך זמינים מסחרית הבאים פרוטוקול של היצרן ^23,24.
4. אם שיבוט נגד רשתות TCRβ, לעצב גן Vβ ו פריימרים ספציפיים באזור קבוע TCRβ, כפי שנקבע בשלב 3.7, ולשכפל באורך מלא TCRβ גנים כמתואר בשלבים 1.3-1.9. ראה שלב 4.5 אם נגד שרשרת היא TCRα, אחרת המשך לשלב 5.1.
5. זמין מסחרי נוגדני Vα הספציפיים מוגבלים, כך ששימוש גן Vα לא יכולשייקבע על ידי cytometry הזרימה. Clone TCRα נגד רשתות באמצעות הגברת 5'-מהירה של קצות cDNA (RACE) ^25, באמצעות זמינים מסחריים 5 'RACE ערכות ^6.
   1. לסנתז 5 'cDNA RACE התואם מ- RNA שחולץ בשלב 4.2 באי הפרוטוקול של היצרן.
   2. בצע ^-1 עגול PCR כמתואר בטבלה 2.
   3. לבצע אלקטרופורזה של מוצר PCR ו elute להקה של כ -1,100 bps, כמתואר בשלב 1.2.
   4. בצע 2 ^nd עגול PCR כמתואר בטבלה 3, באמצעות 1 מוצר PCR עגול ^רח כתבנית.
      הערה: רצפים פריימר לראות תחת טבלה 3 תוכננו עבור שיבוט לתוך EcoRI ו NotI מתעכל וקטור PMX.
   5. לבצע אלקטרופורזה של מוצר PCR ו elute להקה של כ -1,000 bps, כמתואר בשלב 1.2.
   6. גני Clone TCRα לתוך EcoRI ו NotI מתעכלים וקטור PMX ו פורהפלסמידים פ.י. כמתואר בשלבים 1.5-1.9.

5. רומן reconstituting אנטיגן ספציפי המשובטים TCR

הערה: תרבות Jurkat 76 תאים שורות תאים עוקבות במדיום RPMI בתוספת 10% FCS ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ בין כל השלבים.

1. Transduce Jurkat 76 תאים ²⁶ (או שווה ערך TCR ^{- / -} שורת תאי T אנושית) עם hemichain TCR הממוקד באמצעות וירוס 293GPG מיוצר בשלב 2.3. לקבלת Jurkat 76, זרע 5 x 10 ⁴ תאים לכל היטב צלחת 24 גם עם 1 מ"ל של וירוסים 1 מ"ל של מדיום RPMI. צלחת צנטריפוגה XG ב 1000 ו -32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
2. 24 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף Jurkat transduced hemichain 76 תאים על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. בטל supernatant ו resuspend במדיום RPMI טריים לתרבות נוספת.
3. לטהר תאי transduced אם hemichain מולקולרית ניתן מתויג 2-3 ימים לאחר שלב 5.2, על ידי כתםing עם fluorophore מצומדות אנטי NGFR מב ואחריו בסיוע זרימה או תא מגנטי בסיוע מיון (אופציונלי) ^27.
4. בעקבות צעדים 2.1 כדי 2.3, לייצר וירוס 293GPG קידוד נגדי שרשרת TCR משובטת צעדים 4.4 או 4.5.
5. להקים מחדש את TCR מלא, transduce שורת תאי T ביציבות המבטא את שנוצרה TCR hemichain הממוקדת בצעדים 5.1-5.3 באמצעות וירוס משלב 5.4. בצע התמרה כמתואר בשלבים 5.1-5.2.
6. לטהר CD3 ⁺ transfectants באמצעות מיון התא מגנטי בסיוע אנטי CD3 הבאים פרוטוקול של היצרן, 2-3 ימים לאחר שלב 5.5 ^27.
7. כדי לאמת סגוליות אנטיגן, להכתים את transfectants להביע TCRs clonotypic מורכב hemichain TCR ממוקדת זיווג עם-שרשראות הדלפק שונים, עם אנטי CD3 ו / או מבז קולטן שיתוף, ו- HLA multimer, 3-5 ימים שלאחר טיהור CD3. לנתח תאים על ידי cytometry זרימה (איור 4 - 5) ^19.

תוצאות

ללא ידע מוקדם של אשר hemichain הוא שרשרת ממוקדת, שרשרת TCRα ו TCRβ צריך להיות משובטים בנפרד transduced לתאי T בדם ההיקפי, אשר נעשה במקרה של HLA-A24 / WT1 תגובתי TAK1 TCR (איור 1). תמרה של TAK1β ניב תדירות ניכר גבוהה של תאי T אנטיגן ספציפי. לעומת זאת, תמרה של hemichain הלא ממו?...

Discussion

הדרישה הראשונה עבור יישום מוצלח של שיטה זו היא השיגה יעילות תמרה מספקת של תאי T העיקריים עם hemichain עניין. מניסיוננו, השילוב של שימוש PG13 כמו שורת תאי אריזת PMX כתוצאות וקטור retroviral בביטוי יציב ויעיל של הגן הציג בתאי T עיקריים אדם. תאי אריזות PG13 יכולים להיות משובט מתא בודד כד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026