Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

Riepilogo

Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.

Abstract

recettori delle cellule T (TCR) sono utilizzati clinicamente per dirigere la specificità delle cellule T a colpire i tumori come modalità promettente di immunoterapia. Pertanto, TCR clonazione specifici per diversi antigeni associati al tumore è stato l'obiettivo di molti studi. Per suscitare una risposta delle cellule T efficace, il TCR deve riconoscere l'antigene bersaglio con affinità ottimale. Tuttavia, la clonazione come TCR è stata una sfida e molti disponibili TCR possedere affinità sub-ottimale per l'antigene cognate. In questo protocollo, si descrive un metodo di clonazione de novo ad alta affinità TCR antigene-specifiche che utilizzano TCR esistenti sfruttando hemichain centralità. È noto che per alcuni TCR, ogni TCRα o TCRβ hemichain non contribuiscono ugualmente al riconoscimento dell'antigene, e il hemichain dominante è indicato come il hemichain centric. Abbiamo dimostrato che accoppiando il hemichain centrica con contro-catene differenti dal contatore-catena originale, siamo in grado di mantenere l'antigene specificity, mentre modulando la sua forza di interazione per l'antigene cognate. Pertanto, il potenziale terapeutico di un dato TCR può essere migliorata ottimizzando l'accoppiamento tra le centric e contro hemichains.

Introduzione

recettori delle cellule T (TCR) sono eterodimeriche recettori immunitarie adattative espressi dai linfociti T, composto da una catena TCRα e TCRβ. Essi sono generati mediante riarrangiamento somatica di V (D) J segmenti genici, che produce un repertorio altamente diversificata capace di riconoscere configurazioni praticamente illimitata di complessi HLA / peptide. Clinicamente, cellule T ingegnerizzate per esprimere clonotypic specifico TCR per antigeni tumore-associati hanno dimostrato l'efficacia in una varietà di tumori ^1. Tuttavia, molti TCR clonati per questo scopo non hanno sufficiente affinità per l'antigene di interesse, che limitano la loro applicazione terapeutica.

Qui, descriviamo un metodo per superare questo limite per TCR esistenti sfruttando catena di centralità. E 'stato riportato che un TCR hemichain potrebbe svolgere un ruolo più dominante in riconoscimento del target dell'antigene ^2, qui chiamato centralità. analisi strutturali cristallo hanno dimostrato che uno centrichemichain di un TCR potrebbe spiegare la maggioranza della impronta sulla MHC / peptide complesso ^3,4. Usando questo concetto, abbiamo precedentemente dimostrato che l'SIG35α TCRα può accoppiare con un repertorio vario di catene TCRβ e mantenere la reattività contro il peptide MART1 _27-35 presentato da HLA-A2 ^5. Risultati simili sono stati ottenuti con l'TAK1 TCR, dove il centric TCRβ hemichain accoppiato con varie catene TCRα e mantenuto reattività per il peptide WT1 _235-243 presentati da HLA-A24 ^6. Sia MART1 e WT1 sono antigeni associati al tumore. Catena-Centricity è stato applicato anche per studiare il riconoscimento dell'antigene di TCR invarianti CD1d-ristrette natural killer (iNKT), accoppiando la catena invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα di TCR iNKT umani con diverse catene Vβ11 TCRβ ^7.

In tutti i casi, siamo stati in grado di generare un repertorio de novo di TCR da transdurre il centrica TCR hemichain alle cellule T del sangue periferico, dove il hemichain introdotto accoppiato con il TCRα endogena o TCRβ contro-catene. In sostanza, il hemichain centric serve come esca che può essere utilizzato per identificare le opportune contromisure catene, che quando accoppiati insieme formano TCR che mantengono la specificità antigene di interesse, ma variano in affinità. Da questi nuovi repertori, siamo stati in grado di isolare TCR clonotypic con resistenza migliorata interazione contro l'antigene bersaglio rispetto al TCR preesistenti. Pertanto, riteniamo che questo metodo accelererà la pipeline di identificare TCR ottimali per l'applicazione clinica.

Protocollo

1. Preparazione retrovirale Construct Codifica TCR Hemichain di interesse

1. Linearizzare PMX vettoriale per consentire l'inserimento di un gene TCR nei passaggi successivi. Digerire il DNA plasmide con EcoRI e NotI enzimi di restrizione a 37 ° C per 3 ore (Tabella 1) ^8.
2. Effettuare elettroforesi del plasmide digerito su 1,2% gel di agarosio. Banda accise di circa 4.500 paia di basi (bps), ed eluire in 30 ml di acqua sterile utilizzando disponibili in commercio kit di estrazione gel ^9.
3. Progettazione 5 'e 3' primer per il gene TCR di interesse che codificano anche 15-20 bps sovrapposti sito di digestione EcoRI e NotI di PMX vettore, rispettivamente ^8.
4. Amplificare TCR gene con primer. Effettuare elettroforesi del prodotto della PCR e la banda eluire di circa 1.000 bps come descritto al punto 1.2.
5. Clonare TCR gene in vettore digerito combinando ogni frammento lineare con plasmide disponibile in commerciocomplesso principale reagente mix e incubando a 50 ° C per 1 ora.
   NOTA: Fare riferimento al protocollo del produttore per i volumi relativi di ogni componente. Questo metodo di montaggio è basato sulla tecnica originariamente descritta da Gibson et al. ^10.
6. (Opzionale) gene Tag TCR per marcare cellule trasdotte con la forma troncata del nervo umano recettore del fattore di crescita (ΔNGFR, amminoacidi 1-277) ¹¹ separati da sito di scissione Furin, linker serina-glicina, e 2A SEQUENZE ^12,13. primer design sequenze di codifica che si sovrappongono le estremità frammento e assemblare plasmide come descritto ai punti 1.3-1.5.
   NOTA: Queste sequenze possono essere trovati nei riferimenti ^11-13.
7. Trasforma chimicamente competente E. coli con il plasmide assemblato seguendo il protocollo ¹⁴ del produttore. Seed trasformato batteri su piastre di agar (20 mg / ml di brodo lisogenia (LB), 15 mg / ml di agar, e 1 mg / ml di ampicillina) e incubare a 37 ° C per 18 ore.
8. Culture un singolo batterio colonia in 50 ml di terreno LB (20 mg / ml LB e 1 mg / ml di ampicillina) per 16 ore in un incubatore agitazione a 37 ° C e 200 giri al min.
9. Purificare plasmidi utilizzando kit disponibili in commercio midiprep seguenti protocollo del produttore. Diluire plasmide alla concentrazione di circa 1 mg / mL.
   NOTA: Il protocollo di purificazione plasmide è basato sul metodo di estrazione alcalina ^15.

2. Generazione stabile Packaging Cell Line

NOTA: le cellule Sia 293GPG e PG13 sono aderenti. cellule di coltura in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS) e 50 mg / ml gentamicina. cellule 293GPG coltura con 1 mg / ml di tetraciclina prima trasfezione. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO ₂ tra tutti i passaggi.

1. Cellule packaging trasfezione 293GPG ¹⁶ coltivate in pallone T75 con il vettore hemichain-codifica ottenuto nel passaggio 1.9, USIng disponibile in commercio reagente di trasfezione seguente protocollo del produttore ^{1 7.} NOTA: le cellule trasfezione 293GPG a 50-60% di confluenza.
2. Aspirare media per 293GPG cellule e aggiungere 10 ml di fresca DMEM media 1 messaggio giorno trasfezione.
3. Harvest transitoriamente prodotta virus dalle cellule transfettate 293GPG 2 giorni dopo il punto 2.2 con il trasferimento di terreno di coltura di siringa e passando per 0,45 micron filtro.
   NOTA: Virus può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso futuro.
4. Culture 1 x 10 ⁵ PG13 cellule nel pallone T25. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Dopo un giorno, terreno di coltura aspirare e aggiungere 1,5 ml di virus 293GPG derivata dal punto 2.3 e 1.5 ml di terreno DMEM, insieme a 8 ug / ml di polibrene.
5. Modificare il medium come descritto al punto 2.4, una volta al giorno per 4 giorni, per stabilire stabile linea PG13 cellule che producono imballaggi retrovirus codificano la hemichain TCR di interesse.
6. Aspirare media e sostituirecon terreno DMEM fresco per linee cellulari PG13 24 ore dopo l'ultima infezione per ulteriori cultura.
   NOTA: congelare o sub-cultura cellule staccando con una soluzione di tripsina-EDTA 0,05%.
7. Per produrre virus da linee cellulari PG13 trasdotte, cultura 2 x 10 ⁶ cellule in T75 pallone con 10 ml di mezzo DMEM, e il virus del raccolto come descritto al punto 2.3 tre giorni dopo la semina delle cellule.
   NOTA: Virus è meglio utilizzato immediatamente, ma può essere conservato a -80 ° C per un massimo di due mesi.

3. Attivazione e trasduzione delle cellule T umane

NOTA: i campioni umani sono ottenuti ed utilizzati in conformità con i protocolli approvati Comitato Etico istituzionali. primarie cultura cellule umane in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media integrati con siero umano 10% invece di FCS e 50 mg / ml gentamicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO ₂ tra tutti i passaggi.

1. Isolare umani periferici cellule mononucleate del sangue (PBMC) di densitàseparazione gradiente seguente protocollo ¹⁸ del produttore.
2. Attivare le cellule T per indurre la proliferazione necessaria per l'infezione retrovirale. Culture 2 x 10 ⁷ PBMC fresco o congelato per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti, in 5 ml di terreno RPMI con 100 UI / ml di ricombinante umano interleuchina-2 (rhIL-2) e 50 ng / ml di anti-CD3 anticorpo monoclonale (OKT3 clone).
3. Tre giorni dopo la stimolazione, raccogliere le cellule T pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Eliminare il surnatante e sementi 0,5-1 x 10 ⁶ T cellule per pozzetto in 24-pozzetti risospese in 1 ml di virus PG13 dal passaggio 2,7 e 1 ml di mezzo RPMI supplementato con 200 UI / ml di rhIL-2. Piastra centrifugare a 1000 xg e 32 ° C per 1 ora.
4. Dopo 24 ore, raccogliere le cellule T pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Scartare cellule surnatante e risospendere in 1 ml di virus PG13 dal passaggio 2,7 e 1 ml di mezzo RPMI supplementato con 200 UI / ml di rhIL-2. Ripetere questo passaggio per un totale di 6 infettareioni.
   NOTA: Il numero di infezioni deve essere ottimizzata a seconda titolo del virus prodotto da imballaggio linea cellulare. Se necessario, le cellule T passaggio rimuovendo il 20-30% delle cellule ogni giorno per prevenire la crescita eccessiva.
5. 24 ore dopo l'ultima infezione, raccogliere le cellule T pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in terreno RPMI con 100 UI / ml di rhIL-2 per ulteriori cultura.
6. 2-3 giorni dopo il punto 3.5, cellule macchia T con HLA multimero a 4 ° C per 30 minuti, poi CD3 anti-umana e co-recettore anticorpi monoclonali (mAb) a 4 ° C per 15 min. Analizzare mediante citometria di flusso. Utilizzare multimero irrilevanti e / o cellule non trasdotte come controlli negativi (Figura 1 - 3) ^19.
7. Se il hemichain centrica introdotto è una catena TCRα, analizzare l'utilizzo Vβ delle cellule positive de novo multimero utilizzando disponibili in commercio pannello di anticorpi Vβ-specifica mediante citometria di flusso ^20.

4. Clonazione De Novo TCR Counter-hemichains

1. Ordina la de novo multimero popolazione positivo nel passo 3.6 per l'ordinamento cella di flusso-assistita.
2. Isolare RNA da cellule T ordinati utilizzando l'acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione ^{21,2 2.}
   NOTA: RNA può essere conservato a -80 ° C, ma deve essere utilizzato per generare cDNA appena possibile.
3. Sintetizzare libreria di cDNA da RNA estratto utilizzando disponibili in commercio kit inversa trascrittasi-PCR seguente protocollo ^23,24 del produttore.
4. Se la clonazione TCRβ contro-catene, progettare Vβ gene e TCRβ primer specifici costante regione, come determinato al punto 3.7, e clonare full-length TCRβ geni come descritto nei passaggi 1.3-1.9. Vedere il punto 4.5 se il contatore-catena è TCRα, altrimenti passare al punto 5.1.
5. Disponibili in commercio anticorpi Vα-specifici sono limitati, quindi Vα utilizzo gene non puòessere determinata mediante citometria di flusso. Clone TCRα contro-catene tramite 5'-rapida amplificazione del cDNA estremità (RACE) ^25, utilizzando disponibili in commercio 5 'kit Gara ^6.
   1. Sintetizzare 5 'cDNA compatibile corsa da RNA estratto al punto 4.2 seguente protocollo del produttore.
   2. Eseguire 1 ^° turno PCR come descritto nella Tabella 2.
   3. Effettuare elettroforesi del prodotto di PCR ed eluire banda di circa 1.100 bps, come descritto al punto 1.2.
   4. Eseguire 2 ^° turno PCR, come descritto nella tabella 3, con 1 ^° prodotto della PCR tondo come modello.
      NOTA: sequenze primer indicati in Tabella 3 sono stati progettati per la clonazione in EcoRI e NotI digerito PMX vettore.
   5. Effettuare elettroforesi del prodotto di PCR ed eluire banda di circa 1000 bps, come descritto al punto 1.2.
   6. Clone TCRα geni nelle EcoRI e NotI digeriti PMX vettoriale e puriplasmidi fy come descritto ai punti 1.5-1.9.

5. ricostitutivo nuovo antigene-specifiche cloni TCR

NOTA: Culture Jurkat 76 celle e successive linee cellulari in terreno RPMI supplementato con 10% FCS e 50 ug / ml di gentamicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO ₂ tra tutti i passaggi.

1. Trasdurre Jurkat 76 celle ²⁶ (o equivalente TCR ^{- / -} linea di cellule T umano) con centric hemichain TCR utilizzando virus 293GPG prodotta nella fase 2.3. Per Jurkat 76, semi di 5 x 10 ⁴ cellule per pozzetto a 24-pozzetti con 1 ml di virus e 1 ml di terreno RPMI. Piastra centrifugare a 1000 xg e 32 ° C per 1 ora.
2. 24 ore dopo l'infezione, raccogliere hemichain trasdotte Jurkat 76 cellule pipettando e centrifugare a 350 xg per 4 minuti. Gettare il surnatante e risospendere in terreno RPMI fresco per ulteriori cultura.
3. Purificare cellule trasdotte se il hemichain è molecolarmente tagged 2-3 giorni dopo la fase 5.2, dalla macchiare con fluoroforo coniugato anti-NGFR mAb seguita dal flusso assistita o una cella magnetica assistita ordinamento (opzionale) ^27.
4. A seguito di passaggi da 2.1 a 2.3, la produzione di virus 293GPG codifica di un TCR anti-catena clonato da piazza di 4,4 o 4,5.
5. Per ricostituire completamente il TCR, la trasduzione linea di cellule T che esprimono stabilmente la hemichain TCR centrica generata in passi 5.1-5.3 utilizzando virus dal punto 5.4. Eseguire trasduzione come descritto ai punti 5.1-5.2.
6. Purificare CD3 ⁺ transfettanti con anti-CD3 separazione delle cellule magnetica assistita seguente protocollo del produttore, 2-3 giorni dopo passo 5.5 ^27.
7. Per convalidare specificità antigenica, macchiare le transfettanti esprimono TCR clonotypic composti del centric hemichain TCR in coppia con diverse contro-catene, con anti-CD3 e / o anticorpi monoclonali co-recettore, e HLA multimero, 3-5 giorni dopo la purificazione CD3. Analizzare le cellule mediante citometria di flusso (Figura 4 - 5) ^19.

Risultati

Senza la conoscenza preventiva di cui hemichain è a catena-centrica, la catena TCRα e TCRβ dovrebbe essere clonato e trasduzione di cellule T del sangue periferico, che è stato fatto nel caso di HLA-A24 / WT1 reattiva TAK1 TCR (Figura 1) separatamente. La trasduzione di TAK1β prodotto una frequenza notevolmente più elevata di cellule T antigene-specifiche. Al contrario, la trasduzione di un hemichain non-centric non voleva cedere de novo cellule multimero ...

Discussione

Il primo requisito per l'applicazione di successo di questo metodo sta ottenendo sufficiente efficienza di trasduzione delle cellule T primarie con il hemichain di interesse. Nella nostra esperienza, la combinazione di utilizzare PG13 come linea cellulare di packaging e PMX come risultati vettore retrovirale in espressione stabile ed efficiente del gene introdotto nelle cellule T primarie umane. cellule packaging PG13 possono essere unicellulare clonato per selezionare le celle per imballaggio alto titolo per miglio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026