Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Resumen

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Resumen

receptores de células T (TCR) se usan clínicamente para dirigir la especificidad de las células T para apuntar tumores como una modalidad prometedora de la inmunoterapia. Por lo tanto, la clonación de los TCR específicos para diferentes antígenos asociados a tumores ha sido el objetivo de muchos estudios. Para provocar una respuesta efectiva de células T, el TCR debe reconocer el antígeno diana con una afinidad óptima. Sin embargo, la clonación de tales TCR ha sido un reto y muchos disponibles TCR poseen afinidad sub-óptimo para el antígeno afín. En este protocolo, se describe un método de clonación de novo de alta afinidad TCR específicas de antígeno utilizando los TCR existentes mediante la explotación de la centralidad hemichain. Se sabe que para algunos TCR, cada TCRα o hemichain TCR no contribuyen por igual al reconocimiento de antígeno, y la hemichain dominante se refiere como la hemichain céntrica. Hemos demostrado que por el emparejamiento de la hemichain centrada con contra-cadenas diferentes de la cadena de conteo original, somos capaces de mantener el antígeno specificity, mientras que la modulación de su fuerza de interacción para el antígeno afín. Por lo tanto, el potencial terapéutico de un TCR dado se puede mejorar optimizando el emparejamiento entre los hemichains céntricas y de contador.

Introducción

receptores de células T (TCR) son receptores inmunes adaptativas heterodiméricas expresadas por los linfocitos T, compuestas de una cadena TCRα y TCR. Se generan mediante reordenación somática de V (D) J segmentos de genes, que produce un repertorio muy diverso capaz de reconocer configuraciones virtualmente ilimitado de complejos HLA / péptido. Clínicamente, las células T ingeniería genética para expresar clonotypic específica TCR para los antígenos asociados a tumores han demostrado eficacia en una variedad de cánceres ^1. Sin embargo, muchos TCR clonados para este propósito carecen de suficiente afinidad por el antígeno de interés, que limitan su aplicación terapéutica.

A continuación, se describe un método para superar esta limitación de los TCR existentes mediante la explotación de la cadena de centralidad. Se ha informado de que uno hemichain TCR podría desempeñar un papel más dominante en el reconocimiento del antígeno diana ^2, denominado aquí la centralidad. análisis estructurales de cristal han demostrado que uno centrado enhemichain de un TCR podría ser responsable de la mayoría de la huella en el MHC / péptido complejo ^3,4. El uso de este concepto, hemos demostrado previamente que el SIG35α TCRα puede vincular con un repertorio diverso de las cadenas de TCR y mantener la reactividad contra el péptido MART1 _27-35 presentado por HLA-A2 ^5. Se obtuvieron resultados similares con el TCR TAK1, donde la céntrica hemichain TCR emparejado con diversas cadenas TCRα y mantiene reactividad para el péptido WT1 _235-243 presentado por HLA-A24 ^6. Tanto MART1 y WT1 son antígenos asociados a tumores. Cadena centralidad se aplicó también para estudiar el reconocimiento del antígeno del TCR restringidos por CD1d asesinas naturales invariantes (iNKT), por el emparejamiento de la cadena Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα invariante del TCR iNKT humanos con diferentes cadenas TCR Vβ11 ^7.

En todos los casos, hemos sido capaces de generar un repertorio de novo de los TCR por transducing la céntrica hemichain TCR de las células T de sangre periférica, donde el hemichain introducido junto con el TCRα endógena o TCR contra-cadenas. En esencia, el hemichain centrado sirve como un cebo que se puede utilizar para identificar los contra-cadenas adecuados, que cuando se combina en conjunto forman los TCR que mantienen la especificidad de antígeno de interés, sin embargo, que varían en afinidad. A partir de estos nuevos repertorios, hemos sido capaces de aislar los TCR clonotypic con una mejor interacción fuerza contra el antígeno diana en comparación con los TCR preexistentes. Por lo tanto, creemos que este método se acelerará la tubería de la identificación de los TCR óptimas para la aplicación clínica.

Protocolo

1. Preparación retroviral construcción que codifica TCR Hemichain de interés

1. Linealizar pMX vector para permitir la inserción de un gen TCR en los pasos posteriores. Digerir el DNA plásmido con enzimas de restricción EcoRI y NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabla 1) ^8.
2. Llevar a cabo la electroforesis del plásmido digerido en gel de agarosa al 1,2%. Impuestos Especiales de la banda de aproximadamente 4.500 pares de bases (pb), y eluyen en 30 l de agua estéril usando kits de extracción de gel disponibles comercialmente ^9.
3. Diseño 5 'y 3' cebadores para el gen de TCR de interés que también codifican 15-20 bps solapan el sitio digestión con EcoRI y NotI de vector pMX, respectivamente ^8.
4. Amplificar gen TCR con los cebadores. Llevar a cabo la electroforesis del producto de PCR y la banda de elución de aproximadamente 1.000 bps como se describe en el paso 1.2.
5. Clonar gen TCR en el vector digerido mediante la combinación de cada fragmento lineal con el plásmido disponible en el mercadoconjunto maestra reactivo mezcla y la incubación a 50 ° C durante 1 hr.
   Nota: Consulte con el protocolo del fabricante para los volúmenes relativos de cada componente. Este método de montaje se basa en la técnica descrita originalmente por Gibson et al. ^10.
6. (Opcional) gen TCR de etiquetas para marcar las células transducidas con la forma truncada del receptor del factor de crecimiento nervioso humano (ΔNGFR, aminoácidos 1-277) ¹¹ separadas por sitio de escisión de furina, enlazador serina-glicina y 2A secuencias ^12,13. Diseño de cebadores de codificación de secuencias solapadas los extremos del fragmento y el plásmido montar como se describe en los pasos 1.3-1.5.
   NOTA: Estas secuencias se pueden encontrar en las referencias ^11-13.
7. Transformar E. químicamente competente coli con el plásmido ensamblado siguiendo el protocolo del fabricante ^14. bacterias semilla transformada en placas de agar (20 mg / ml de caldo de lysogeny (LB), 15 mg / ml de agar, y 1 mg / ml de ampicilina) y se incuba a 37 ° C durante 18 hr.
8. Cultura una sola colonia bacteria en 50 ml de medio LB (20 mg / ml de LB y 1 mg / ml de ampicilina) durante 16 horas en una incubadora de agitación a 37 ° C y 200 revoluciones por min.
9. Purificar plásmidos usando kits disponibles en el mercado Midiprep siguiendo el protocolo del fabricante. Diluir plásmido de concentración de alrededor de 1 mg / l.
   NOTA: El protocolo de purificación de plásmido se basa en el método de extracción alcalina ^15.

2. Generación de línea celular estable Embalaje

NOTA: Tanto las células 293GPG y PG13 son adherentes. células de cultivo en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 50 mg / ml de gentamicina. 293GPG células de cultivo con 1 mg / ml de tetraciclina antes de la transfección. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO ₂ entre todos los pasos.

1. Transfectar células de empaquetamiento ¹⁶ 293GPG cultivadas en un matraz T75 con el vector hemichain-codificación obtenida en el paso 1.9, USIng reactivo de transfección disponibles comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante ^{1 7.} Nota: las transfectar 293GPG en el 50-60% de confluencia.
2. Aspirar el medio de 293GPG células y añadir 10 ml de DMEM medio 1 día después de la transfección.
3. Cosecha produce transitoriamente virus de las células transfectadas 293GPG 2 días después del paso 2.2 mediante la transferencia de medio de cultivo a la jeringa y que pasa a través de 0,45 micras filtro.
   NOTA: Virus puede ser utilizado inmediatamente o almacenado a -80 ° C para uso futuro.
4. Cultivo de 1 x 10 ⁵ PG13 células en T25 matraz. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Después de un día, el medio de cultivo de aspirado y añadir 1,5 ml de virus derivados de 293GPG de la etapa 2.3 y 1.5 ml de medio DMEM, junto con 8 g / ml de polibreno.
5. Cambiar el medio como se ha descrito en el paso 2.4 una vez por día durante 4 días, para establecer retrovirus que producen línea celular de empaquetamiento PG13 estable que codifican el hemichain TCR de interés.
6. Aspirar medio y reemplazarcon medio DMEM fresco para líneas de células PG13 24 horas después de la última infección para el posterior cultivo.
   NOTA: congelar o sub-cultivo de células de separar con una solución de tripsina-EDTA 0,05%.
7. Para producir virus a partir de líneas celulares transducidas PG13, la cultura 2 x 10 ⁶ células en T75 matraz con 10 ml de medio DMEM, y el virus de la cosecha como se describe en el paso 2.3 tres días después de la siembra de las células.
   NOTA: Virus, es preferible utilizar de inmediato, pero se puede almacenar a -80 ° C durante un máximo de dos meses.

3. La activación y Transducción de células T humanas

NOTA: Las muestras humanas se obtienen y utilizan de acuerdo con los protocolos aprobados Comité de Ética Institucional. las células humanas de cultivo primario en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementado con suero humano al 10% en lugar de FCS y 50 mg / ml de gentamicina. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO ₂ entre todos los pasos.

1. Aislar las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) por densidadla separación por gradiente siguiendo el protocolo del fabricante ^18.
2. Activar las células T para inducir la proliferación necesaria para la infección retroviral. Cultura 2 x 10 ⁷ PBMC fresco o descongelado por pocillo en placa de 6 pocillos, en 5 ml de medio RPMI con 100 UI / ml de interleucina-2 recombinante humana (rhIL-2) y 50 ng / ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3 clon).
3. Tres días después de la estimulación, recogen las células T con la pipeta y se centrifuga a 350 g durante 4 min. Desechar el sobrenadante y las semillas de 0,5-1 x 10 ⁶ células T por pocillo en placa de 24 pocillos se resuspendieron en 1 ml de virus PG13 de la etapa 2.7, y 1 ml de medio RPMI suplementado con 200 UI / ml de rhIL-2. placa Centrifugar a 1000 xg y 32 ° C durante 1 hr.
4. Después de 24 horas, recoger las células T con la pipeta y se centrifuga a 350 g durante 4 min. Desechar células sobrenadante y resuspender en 1 ml de virus PG13 de la etapa 2.7, y 1 ml de medio RPMI suplementado con 200 UI / ml de rhIL-2. Repita este paso para un total de 6 Infectiones.
   NOTA: El número de infecciones se debe optimizar dependiendo de título de virus producido por un embalaje línea celular. Si es necesario, las células T pasaje mediante la eliminación de 20 a 30% de las células cada día para evitar el crecimiento excesivo.
5. 24 horas después de la última infección, recoger las células T con la pipeta y se centrifuga a 350 g durante 4 min. Desechar las células sobrenadante y resuspender en medio RPMI con 100 UI / ml de rhIL-2 para el posterior cultivo.
6. 2-3 días después de la etapa 3.5, las células T con mancha multímero HLA a 4 ° C durante 30 min, a continuación, CD3 anti-humana y anticuerpos monoclonales de co-receptores (mAbs) a 4 ° C durante 15 min. Analizar mediante citometría de flujo. Utilice multímero irrelevantes y / o las células no transducidas como controles negativos (Figura 1 - 3) ^19.
7. Si el hemichain centrada introducido es una cadena TCRα, analizar el uso de Vβ de las células de novo multímero positivos mediante el panel de anticuerpos Vβ-específica disponible en el mercado por citometría de flujo ^20.

4. Clonación De Novo TCR Counter-hemichains

1. Ordenar la población de novo multímero positivo en el paso 3.6 por clasificación de células asistida por flujo.
2. Aislar el ARN de las células T ordenados utilizando el ácido guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo método de extracción de ^{21,2 2.}
   NOTA: RNA se puede almacenar a -80 ° C, pero se debe utilizar para generar ADNc tan pronto como sea posible.
3. Sintetizar biblioteca de ADNc a partir de ARN extraído por medio de kits de la transcriptasa reversa-PCR disponibles en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante ^23,24.
4. Si la clonación TCR contra-cadenas, diseñar gen Vβ y TCR cebadores específicos de la región constante, tal como se determina en el paso 3.7, y el clon de longitud completa TCR genes tal como se describe en los pasos 1.3-1.9. Ver el paso 4.5 si el contador de cadena es TCRα, de lo contrario continúe con el paso 5.1.
5. Comercialmente anticuerpos Vα-específicos disponibles son limitados, por lo tanto el uso de genes no pueden Vαser determinada por citometría de flujo. Clon TCRα contra-cadenas a través de 5'-rápida amplificación de cDNA extremos (RACE) ^25, utilizando comercialmente disponibles kits de 5 'RACE ^6.
   1. Sintetizar 5 'RACE cDNA compatibles partir de ARN extraído en el paso 4.2 siguiendo el protocolo del fabricante.
   2. Realizar ^1ª ronda de PCR como se describe en la Tabla 2.
   3. Llevar a cabo electroforesis del producto de PCR y se eluye banda de aproximadamente 1100 bps, tal como se describe en el paso 1.2.
   4. Realizar ^2ª ronda de PCR como se describe en la Tabla 3, utilizando ^1ª ronda producto de PCR como molde.
      NOTA: Las secuencias de cebador se muestran en la Tabla 3 bajo han sido diseñados para la clonación en EcoRI y NotI digerido vector pMX.
   5. Llevar a cabo electroforesis del producto de PCR y se eluye banda de aproximadamente 1000 bps, tal como se describe en el paso 1.2.
   6. genes clon TCRα en EcoRI y NotI del vector digerido y purificado PMXplásmidos fy como se describe en los pasos 1.5-1.9.

Los clones de TCR 5. La reconstitución nuevo antígeno-específicos

NOTA: Culture Jurkat 76 células y líneas celulares posteriores en medio RPMI suplementado con 10% de FCS y 50 mg / ml de gentamicina. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO ₂ entre todos los pasos.

1. Transducir células Jurkat 76 ²⁶ (o equivalente TCR ^{- / -} línea de células T humanas) con centrado en hemichain TCR usando virus 293GPG producido en el paso 2.3. Para Jurkat 76, semilla de 5 x 10 ⁴ células por pocillo en placa de 24 pocillos con 1 ml de virus y 1 ml de medio RPMI. placa Centrifugar a 1000 xg y 32 ° C durante 1 hr.
2. 24 horas después de la infección, recoger hemichain transducidas Jurkat 76 células por pipeteo y se centrifuga a 350 g durante 4 min. Desechar el sobrenadante y resuspender en medio RPMI fresco para el posterior cultivo.
3. Purificar las células transducidas si el hemichain es molecularmente etiquetada 2-3 días después del paso 5.2, mediante tincióning con fluoróforo conjugado anti-NGFR mAb seguido de flujo asistida o célula-magnético asistida clasificación (opcional) ^27.
4. Siguiendo los pasos de 2.1 a 2.3, producir virus 293GPG que codifica un contador de cadena TCR clonado a partir de los pasos 4.4 o 4.5.
5. Para reconstituir totalmente el TCR, la transducción de la línea de células T que expresan establemente la céntrica hemichain TCR generada en los pasos 5.1-5.3 utilizando virus desde el paso 5.4. Realizar la transducción tal como se describe en los pasos 5.1-5.2.
6. Purificar CD3 ⁺ transfectantes utilizando anti-CD3 separación celular magnética asistida siguiendo el protocolo del fabricante, 2-3 días después del paso 5.5 ^27.
7. Para validar la especificidad de antígeno, manchar los transfectantes que expresan TCR clonotípico compuestos de la hemichain TCR centrada emparejado con varios contra-cadenas, con mAbs co-receptores de anti-CD3 y / o, y multímero HLA, 3-5 días después de la purificación CD3. Analizar las células por citometría de flujo (Figura 4-5) ^19.

Resultados

Sin el conocimiento previo de los cuales es hemichain cadena centrada, la cadena TCRα y TCR debe ser clonado y transduce a las células T de sangre periférica, que fue hecho en el caso de HLA-A24 / WT1 reactiva TAK1 TCR (Figura 1) por separado. Transducción de TAK1β dio una frecuencia notablemente más alto de las células T específicas de antígeno. Por el contrario, transducción de una hemichain no centrado no cedería células T positivas multímero de novo,...

Discusión

El primer requisito para la aplicación exitosa de este método está logrando suficiente eficacia de transducción de las células T primarias con el hemichain de interés. En nuestra experiencia, la combinación del uso de PG13 como línea celular de empaquetamiento y pMX como resultados de vectores retrovirales en la expresión estable y eficaz del gen introducido en las células T primarias humanas. células de empaquetamiento PG13 pueden ser de una sola célula clonada para seleccionar las células de empaquetado d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026