порождающий<em&gt; De Novo</em&gt; Антиген-специфический человеческий Т-клеточный рецепторам трансдукции ретровирусных Centric Hemichain

Резюме

Здесь мы опишем метод нового для генерации антиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR) путем спаривания TCRα или TCR & beta существующего TCR, обладающих антигенной специфичности интересов, с дополнительным hemichain репертуара клеточных рецепторов периферических Т. В De Novo , сгенерированные ТКО сохраняют антиген-специфичность с различной аффинностью.

Аннотация

Т-клеточные рецепторы (TCR), которые используются в клинике, чтобы направить специфичность Т-клеток целевых опухолей в качестве перспективного механизма иммунотерапии. Таким образом, клонирование ТКР специфические для различных ассоциированных с опухолью антигенов было целью многих исследований. Для того, чтобы вызвать эффективный Т-клеточный ответ, ТКС должен распознавать антиген-мишень с оптимальной сродства. Тем не менее, клонирование таких ТКО было проблемой, и многие доступны ТКО обладают субоптимальную сродством к родственным антигеном. В этом протоколе мы опишем метод клонирования De Novo высоким сродством антиген-специфические ТКО с использованием существующих ТКО за счет использования hemichain Centricity. Известно, что для некоторых ТКР, каждый TCRα или TCR & beta; hemichain не способствуют в равной степени к распознаванию антигена, и доминирующий hemichain упоминается как Центрическая hemichain. Мы показали, что путем спаривания Центрическая hemichain с ответными цепями, отличающимися от исходного контр-цепи, мы можем поддерживать антиген Specificity, в то время как модулировать свои силы взаимодействия для родственного антигена. Таким образом, терапевтический потенциал данного TCR может быть улучшена за счет оптимизации спаривание между центрированных и счетчик hemichains.

Введение

Т-клеточные рецепторы (TCR) являются гетеродимерные адаптивные иммунные рецепторы, выраженные Т-лимфоциты, состоящие из цепи TCRα и TCR & beta;. Они генерируются с помощью соматической перегруппировки V (D) J сегментов гена, который производит чрезвычайно разнообразный репертуар, способных распознавать практически неограниченные конфигурации по HLA / пептидных комплексов. Клинически, Т - клетки , сконструированные для экспрессии клонотипическим ТКР , специфичные к опухолевым антигенам, продемонстрировали эффективность в различных раковых заболеваний ^1. Тем не менее, многие ТКР клонированные для этой цели не обладают достаточной аффинностью к интересующему антигену, что ограничивает их терапевтическое применение.

Здесь мы опишем метод, чтобы преодолеть это ограничение для существующих ТКО за счет использования цепи Ориентированность. Сообщалось , что один TCR hemichain мог бы играть более доминирующую роль в признании антигена - мишени ^2, здесь называют Centricity. Хрустальные структурные анализы показали, что один Centrichemichain из TCR может объяснить большинства след на MHC / пептид ^3,4. Используя эту концепцию, ранее мы показали , что SIG35α TCRα может спариваться с разнообразным репертуаром TCR & beta ; цепей и поддерживать реактивность против MART1 _27-35 пептида , представленного HLA-A2 ^5. Аналогичные результаты были получены с TAK1 TCR, где Центрическая TCR & beta ; hemichain сопряженным с различными цепями TCRα и обслуживаемой реакционной способностью по отношению к WT1 _235-243 пептида , представленного HLA-A24 ^6. Оба MART1 и WT1, являются ассоциированные с опухолью антигены. Сеть Ориентированность был также применен для изучения распознавания антигена CD1d-ограниченных инвариантных натуральных киллеров (iNKT) ТКР, соединяя инвариантную Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα цепь ТКР iNKT человека с различными Vβ11 цепей TCR & beta ; ^7.

Во всех случаях мы смогли сформировать заново репертуар ТКР по трансducing Центрическая TCR hemichain к Т-клеток периферической крови, где введена hemichain спаренных с эндогенным TCRα или TCR & beta; контр-цепей. По существу, ориентированный hemichain служит в качестве приманки, которые могут быть использованы для идентификации соответствующих встречные цепи, которые при сопряжении вместе образуют ТКО, которые поддерживают антигенную специфичность интерес, но различных по сродству. Из этих новых репертуаров, мы были в состоянии изолировать клонотипичной ТКО с улучшенной прочностью взаимодействия против антигена-мишени по сравнению с уже существующими ТКО. Поэтому мы считаем, этот метод ускорит трубопровод определения оптимальных ТКО для клинического применения.

протокол

1. Подготовка Ретровирусное Construct Кодировка TCR Hemichain Интереса

1. Линеаризацию Рмх вектор, чтобы позволить вставку гена TCR в последующих стадиях. Гидролизуют плазмидной ДНК с помощью ферментов рестрикции EcoRI и NotI при температуре 37 ° С в течение 3 часов (таблица 1) ^8.
2. Провести электрофорез расщепленной плазмиды на 1,2% агарозном геле. Акцизной полосу примерно 4500 пар оснований (БТС), и элюат в 30 мкл стерильной воды с использованием коммерчески доступных наборов для экстракции геля ^9.
3. Дизайн 5 'и 3' праймеры для гена TCR интереса , который также закодировать 15-20 базисных пунктов перекрывающихся переваривания сайт EcoRI и NotI из рМХ вектора соответственно ^8.
4. Amplify гена TCR с праймеров. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1000 бод, как описано на стадии 1.2.
5. Клонирование гена TCR в переваренной вектор, комбинируя каждый линейный фрагмент с коммерчески доступной плазмидысборка мастер-реагента смесь и инкубирования при 50 ° С в течение 1 ч.
   Примечание: Обратитесь к протоколу производителя для относительных объемов каждого компонента. Этот метод сборки основан на методике , впервые описанной Gibson и др. ^10.
6. (Необязательно) ген Tag TCR к Марку трансдуцированных клеток с усеченной формой человеческого нерва рецептора фактора роста (ΔNGFR, аминокислоты 1-277) ¹¹ , разделенных Фурин сайта расщепления, серин-глицин линкера, и 2А Последовательность из ^12,13. Дизайн праймеров последовательности, кодирующие перекрывающие концы фрагмента и монтируем плазмиды, как описано в пунктах 1.3-1.5.
   Примечание: Эти последовательности можно найти в ссылках ^11-13.
7. Transform химически компетентную E. палочка с собранной плазмиды следующим протоколом производителя ^14. Семенной трансформированных бактерий на чашках с агаром (20 мг / мл лизогении бульона (LB), 15 мг / мл агара и 1 мкг / мл ампициллина) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 18 часов.
8. Культура одна бактерия колонии в 50 мл LB-среды (20 мг / мл LB и 1 мкг / мл ампициллина) в течение 16 ч в качалке инкубаторе при температуре 37 ° С и 200 выстрелов в минуту.
9. Очищают плазмид с использованием коммерчески доступных наборов midiprep в соответствии с протоколом производителя. Развести плазмиды в концентрации около 1 мкг / мкл.
   Примечание: Протокол очистки плазмидной основан на методе щелочной экстракции ^15.

2. Создание прочной упаковке клеточной линии

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба 293GPG и PG13 клетки являются приверженцем. Культура клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) и 50 мкг / мл гентамицина. Культура 293GPG клетки с 1 мкг / мл тетрациклина, до трансфекции. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO ₂ между всеми шагами.

1. Трансфекцию 293GPG упаковочные клетки , культивированные в ¹⁶ T75 колбе с вектором hemichain-кодирования , полученного на стадии 1.9, USIнг коммерчески доступного реагента для трансфекции в соответствии с протоколом производителя ^{1 7.} Примечание: трансфекцию 293GPG клетки на 50-60% сплошности.
2. Отберите среда для 293GPG клеток и добавляют 10 мл свежей DMEM среда 1 день после трансфекции.
3. Урожай скоротечно получают вирус от трансфицированных клеток 293GPG 2 дня после того, как шаг 2.2 путем переноса культуральной среды в шприц и проходящий через фильтр 0,45 мкм.
   Примечание: Вирус можно использовать сразу или хранить при -80 ° С для последующего использования.
4. Культура 1 х 10 ⁵ PG13 клеток в T25 колбу. Граф клеток с использованием гемоцитометра. После того, как один день, аспирация культуральной среды и добавляют 1,5 мл 293GPG-производного вируса с шага 2,3 и 1,5 мл DMEM среды, вместе с 8 мкг / мл полибрена.
5. Изменение среды, как описано в пункте 2.4 один раз в день в течение 4-х дней, чтобы установить стабильное PG13 линию упаковывающих клеток, продуцирующих ретровирус, кодирующие TCR hemichain интерес.
6. Отберите средних и заменитьсо свежей средой DMEM для линий PG13 клеток 24 ч после последней инфекции для дальнейшей культуры.
   Примечание: Замораживание или субкультура клеток путем разъединением с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА.
7. Для того, чтобы производить вирус из клеточных линий , трансдуцированных PG13, культуру 2 х 10 ⁶ клеток в T75 колбу с 10 мл среды DMEM и вирус урожая , как это описано в шаге 2.3 через три дня после посева клеток.
   Примечание: Вирус лучше всего использовать сразу, но можно хранить при температуре -80 ° С в течение до двух месяцев.

3. Активация и трансдукция человеческих Т-клеток

Примечание: Человеческие образцы получены и использованы в соответствии с институциональными комитет по этике утвержденных протоколов. Культура первичные клетки человека в Roswell Park Memorial института (RPMI) среде с добавлением 10% сыворотки крови человека вместо FCS и 50 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO ₂ между всеми шагами.

1. Isolate человека мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от плотностиГрадиент разделения в соответствии с протоколом изготовителя ^18.
2. Активация Т-клеток, чтобы индуцировать пролиферацию, необходимое для ретровирусной инфекции. Культура 2 х 10 ⁷ свежей или оттаивают РВМС на лунку в 6-луночные планшеты, в 5 мл RPMI среде с 100 МЕ / мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека (рИЛ-2) и 50 нг / мл анти-CD3 моноклональными антителами (клон ОКТ3).
3. Три дня после стимуляции, собирают Т-клеток с помощью пипетки и центрифуги при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и семян 0,5-1 × 10 ⁶ Т - клеток на лунку в 24-луночный планшет , ресуспендировали в 1 мл вируса PG13 от стадии 2.7, и 1 мл RPMI среде , дополненной 200 МЕ / мл рИЛ-2. Центрифуга пластины при 1000 х г и 32 ° С в течение 1 часа.
4. Через 24 часа собирают Т-клетки, с помощью пипетки и центрифуге при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл вируса PG13 от стадии 2.7, и 1 мл RPMI среде, дополненной 200 МЕ / мл рИЛ-2. Повторите этот шаг для в общей сложности 6 Infectионов.
   Примечание: Количество инфекций должна быть оптимизирована в зависимости от титра вируса, полученного путем упаковки клеточной линии. При необходимости, проход Т-клетки путем удаления 20-30% клеток, каждый день, чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост.
5. 24 ч после последней инфекции, Т-клетки собирают пипеткой и центрифуге при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в RPMI среде с 100 МЕ / мл рИЛ-2 для дальнейшей культуры.
6. Через 2-3 дня после шага 3.5, пятно Т-клеток с HLA мультимеру при 4 ° С в течение 30 мин, а затем анти-CD3 человека и сорецептора моноклональные антитела (МАт) при 4 ° С в течение 15 мин. Анализ с помощью проточной цитометрии. Используйте ненужную мультимер и / или untransduced клетки в качестве отрицательного контроля (Рисунок 1 - 3) ^19.
7. Если введенный ориентированных hemichain является TCRα цепь, анализировать использование Vβ из De Novo мультимеров положительных клеток с использованием коммерчески доступного Vβ специфичную панели антител с помощью проточной цитометрии ^20.

4. Клонирование De Novo TCR Counter-hemichains

1. Сортировка De Novo мультимеров положительное населения на этапе 3.6 с помощью проточной при содействии сортировки клеток.
2. Изолировать РНК из отсортированных Т - клеток с использованием кислоты гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ методом экстракции ^{21,2 2.}
   Примечание: РНК можно хранить при температуре -80 ° С, но их следует использовать для генерации кДНК как можно скорее.
3. Обобщить библиотеки кДНК из экстрагированной РНК с использованием коммерчески доступных наборов обратной транскриптазы-PCR в соответствии с протоколом производителя ^23,24.
4. Если клонирование TCR & beta; встречные цепи, дизайн ген Vβ и TCR & beta; константная область специфических праймеров, как определено на этапе 3.7, и клонировать полнометражных гены TCR & beta; как описано в пунктах 1.3-1.9. См шаг 4.5, если встречное цепь TCRα, в противном случае переходите к шагу 5.1.
5. Коммерчески доступные Vα-специфические антитела ограничены, таким образом, использование гена Vα не можетопределяется с помощью проточной цитометрии. Клон TCRα контр-цепи с помощью 5'-быстрой амплификации концов кДНК (RACE) ^25, с использованием коммерчески доступного 5 'RACE комплекты ^6.
   1. Обобщить 5 'RACE совместимую кДНК из РНК, выделенной на этапе 4.2 в соответствии с протоколом производителя.
   2. Выполнить 1 - ^й раунд ПЦР , как описано в таблице 2.
   3. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1100 бод, как описано в пункте 1.2.
   4. Выполнение 2 - ^го тура ПЦР , как описано в таблице 3, с использованием 1 - ^й тур ПЦР - продукт в качестве матрицы.
      Примечание: Последовательности праймеров , показанные под таблице 3 были разработаны для клонирования в EcoRI и NotI расщепляли PMX вектор.
   5. Проводят электрофорез продукта ПЦР и элюции полосу примерно 1000 бод, как описано в пункте 1.2.
   6. гены клонов TCRα в EcoRI и NotI расщепляли вектор PMX и пуриFY плазмид, как описано в пунктах 1.5-1.9.

5. воссоздании новый антиген-специфические TCR Клоны

Примечание: Культура Jurkat 76 клеток и последующие клеточные линии в RPMI среде с добавлением 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO ₂ между всеми шагами.

1. Трансдукции Jurkat 76 ячеек ²⁶ (или эквивалент TCR ^{- / -} Т - клеточной линии человека) с центрической TCR hemichain с использованием вируса 293GPG , полученного на стадии 2.3. Для Jurkat 76 семян 5 х 10 ⁴ клеток на лунку в 24-луночный планшет с 1 мл вируса и 1 мл RPMI среды. Центрифуга пластины при 1000 х г и 32 ° С в течение 1 часа.
2. 24 ч после заражения, собирают hemichain трансдуцированная Jurkat 76 клеток с помощью пипетки и центрифуги при 350 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют в свежей среде RPMI для дальнейшей культуры.
3. Очищают трансдуцированных клетки, если hemichain молекулярно помечены 2-3 дня после того, как шаг 5.2, с помощью окрашиванияING с флуорофором , конъюгированные анти-NGFR мАт с последующим потоком при содействии или магнитно-помощь сортировки клеток ( по желанию) ^27.
4. Следующие шаги 2.1 до 2.3, производят вирус 293GPG, кодирующий ТКР встречное цепь, клонированного из шагов 4.4 или 4.5.
5. Для того, чтобы полностью восстановить ТКР, трансдукции Т-клеточной линии, стабильно экспрессирующие TCR центрическую hemichain генерируется на этапах 5.1-5.3 с использованием вируса с шага 5.4. Выполните трансдукции, как описано в пунктах 5.1-5.2.
6. Очищают CD3 ⁺ трансфектантов с помощью анти-CD3 магнитной помощь сортировкой клеток в соответствии с протоколом производителя, через 2-3 дня после шага 5.5 ^27.
7. Для проверки антигенную специфичность, испачкать трансфектантов, выражающие клонотипическим ТКО, состоящие из Центрическая TCR hemichain сопряженным с различными противоионами цепями, с анти-CD3 и / или моноклональными сорецептора и HLA мультимеру, 3-5 дней после очистки CD3. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии (рис 4 - 5) ^19.

Результаты

Без предварительного знания которых hemichain является цепью ориентированных, цепь TCRα и TCR & beta ; должен быть отдельно клонировали и трансдуцированная в периферической крови Т - клеток, что и было сделано в случае HLA-А24 / WT1 реактивная TAK1 TCR (рисунок 1). Трансдукция TA...

Обсуждение

Первое требование для успешного применения этого метода является достижение достаточной эффективности трансдукции первичных Т-клеток с hemichain интереса. По нашему опыту, сочетание использования PG13 в линии упаковки клеток и PMX в качестве ретровирусных вектора приводит к стабильной и эф?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL
293GPG cells	Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar	Wisent Bioproducts	800-010-CG
Agarose	Wisent Bioproducts	800-015-CG
Ampicillin sodium salt	Wisent Bioproducts	400-110-IG
Chloroform	BioShop	CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995065
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit	BS353
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483020
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Filter	Corning	431220	0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb	Biolegend	345104	clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb	Biolegend	300440	clone UCHT1
Gentamicin	Life Technologies	15750078
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2611L	used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer	Proimmune	depends on antigenic peptide	HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers	NIH Tetramer Core Facility		multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
human CD3 microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit	Beckman Coulter	IM3497
Jurkat 76 cells	Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth	Wisent Bioproducts	800-060-LG
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987I
NEBuffer 3.1	New England Biolabs	B7203S	used for EcoRI and NotI digestion
NotI	New England Biolabs	R0189S
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410	used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb	Beckman Coulter	B21205	clone B9.11
PG13 cells	ATCC	CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack	New England Biolabs	B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
pMX retroviral vector	Cell Biolabs	RTV-010
polybrene	Sigma-Aldrich	H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2)	Novartis	by Rx only	equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody	Biolegend	317301	clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640	Life Technologies	11875119
SA-PE	Life Technologies	S866	used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit	Clontech	634858
Sterile water	Wisent Bioproducts	809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18080051	for cDNA synthesis
Syringe	BD	301604	10 ml, slip tip
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026