JoVE Logo
发表
联系我们

登录

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

摘要

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.

High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

引言

学习是基于记忆痕迹及其维护的形成。它已被广泛接受，一个潜在的机制可以表示神经元之间的现有突触联系的新的和/或重排的活性依赖性形成。在分子水平上，各种蛋白质修饰，亚细胞relocalizations和突触蛋白的周转变化已经描述1-4（Lamprecht的，2004＃8）。然而，大多数的研究迄今针对选定的蛋白质，而不是对全球但复杂的突触蛋白质组合物。本方法允许一个学习实验后小鼠脑区突触蛋白质组变化公正的审查。合适的是使突触架构的学习诱导重组时间点相关的分子的快照。所描述的工作流程，需要不同的专家在动物行为，蛋白质生物化学，质谱和bioi一个特定的团队合作nformatics。

所选择的学习范例， 即频率调制的音调鉴别（FMTD），是在啮齿类动物5充分表征听觉辨别任务。学习和长期记忆的形成这个梭箱GO / NO-GO-任务涉及取决于增加皮质多巴胺信号和蛋白质合成机制。因此，最近对沙土鼠和小鼠的蛋白质组学研究揭示多巴胺和皮质突触部件的学习诱导塑料重排，而且在更基础的大脑区域FMTD学习和记忆6-8期间，理应相互作用。这表明，记忆的形成涉及不同脑区之间复杂的相互作用，因此，可能在蛋白质水平这些区域内差异调节。因此，选择的皮层和皮层下小鼠的大脑区域的解剖被包括在工作流程。

此外，可靠characterizati在偶数的突触蛋白组合物弱变化需要前和突触后隔室的富集而非匀浆或粗膜部分9的分析。蛋白质组学分析之前因此，突触体的制备利用建立的协议，以增加检测电平与动态范围为特定突触蛋白10,11进行说明。

使用无标签的高分辨率质谱定量目的的基本前提是高度的蛋白质样品的相似性。由于突触蛋白质组成，而细微的变化，预计学习，无标签的方法将是适当的比较，从相应的培训和天真的小鼠获得的蛋白样品后出现。可替代地，使用稳定同位素（ 例如 TMT，iTRAQ的，ICPL和SILAC）以及基于MS2-标签自由QUA蛋白/肽的特定条件下的标签的策略ntification（SWATH）是有用的，但它们比选择无标记方法更昂贵或需要特别的质谱硬件。

因为蛋白质组掩护往往产生复杂的数据集，建议适当的数据解释生物信息的处理。其他荟萃分析可以支持更好地了解潜在的范式相关的变更，涉及的关键细胞过程和信号通路的识别潜在的分子机制。适当的方法也被描述如下。

研究方案

包括动物学科的所有程序，根据德国联邦法，各自的欧盟法规和NIH准则的规定进行，并已批准Landesverwaltungsamt萨克森/安哈特（42502-2-1102 IFN）的伦理委员会。

1.听觉学习

  1. 在穿梭箱（FMTD模式）注听觉辨别学习 :始终戴手套，而处理的小鼠。
    1. 众议院C57BL6 / J小鼠与自由获取食物颗粒和自来水中的透明聚碳酸酯笼中三或四组。保持12小时光照:黑暗周期中的动物设施。如果从另一个实验室或来自公司收到动物允许驯化中的至少一周，并在解决。
    2. 执行每日一梭箱培训。
      1. 以从家笼鼠标在动物设施，并将其放置在隔音室内昏暗的梭箱。
      2. 使用听觉辨别学习的全电脑控制学习进度。用沉默3分钟的习惯期开始，然后开始训练。
        1. 上声使用序列（4 - 8千赫，CS +）的过程中去，试验转到刺激:动物有过音呈现6秒内关（正确反应，击）。 300μA， 通过穿梭箱的格地板交付-由50个温和的足部电击惩罚小姐。
        2. 该动物有音呈现的6秒期间保持在穿梭箱的当前隔室:在无转到-试验 - （4-千赫，CS-8）作为无转到刺激使用降调的序列。 300μA，通过穿梭箱的格地板交付 - 由50个温和的足部电击惩罚虚惊一场。
      3. 使用20个5秒的时间间隔intertrial。
      4. 以伪随机顺序执行每节30的Go-试验和30号-GO-试验，这样一方面本身裂变由60试验，持续约25分钟。
    3. 把经训练动物放回其饲养笼中的动物设施。
  2. 脑解剖
    1. 安乐死在期望的时间点对动物使用颈椎脱位（ 例如第一次会议结束后24小时）的训练会话的期望数目之后。斩首动物。
    2. 迅速解剖通过以下步骤大脑:剪切第一皮肤，然后用沿Sutura矢状直剪刀颅骨。完全删除使用强镊子覆盖脑组织骨的部位。取出大脑用spattle。
    3. 解剖，将脑到培养皿中充满了冰。解剖听觉皮层，额叶皮层，纹状体和使用解剖刀和针头在立体显微镜下海马。
      1. 使用对大脑的视觉标本地化听觉皮层urface如血管和表面的形状（前囟-2.06至-3.4，尺寸rostrocaudal 2毫米，背腹1.3毫米）和双边解剖与皮质的厚度的矩形组织块。
      2. 解剖额叶皮层的前囟门和3.56之间1.54脑切片使用视交叉opticum作为一个里程碑，但不包括浙嗅组织。
      3. 解剖纹状体的前囟门1.54和0.5之间的脑切片，小心地取出皮层组织。
      4. 通过小脑固定用针大脑和开卷开始枕叶皮层解剖海马。
    4. 震荡冷冻在-80℃下解剖脑样品在液氮中保存。

2.突触的制备或可替代地一个突触后密度（PSD）富集的级分

注:在所有的程序，保持样品和缓冲液在0 - 4℃。缓冲剂包含新鲜为了防止蛋白质的蛋白水解降解稀释的蛋白酶抑制剂鸡尾酒。如果蛋白质的磷酸化进行了研究，磷酸酶抑制剂鸡尾酒必须添加。表明所有的G-值给出克（平均值）在整个协议。

  1. 粗膜部分的制备（图3A）
    1. 转印解剖脑组织成含有1ml冰冷均质化容器冷缓冲液A（5mM的HEPES，320毫蔗糖，pH值7.4），在900rpm下与12笔均质组织。
    2. 离心样品在1000×g离心10分钟。保持上清。
    3. 再匀化在1000×g离心10分钟再在相同体积的匀浆缓冲液中如前同样的条件和离心机样品粒料。结合相应的上清液。丢弃粒料P1，主要含有细胞核和细胞碎片。
    4. 旋合并的上清液为12,000×g的20分钟。丢弃supernatants或使用进行进一步分离11。
    5. 悬浮粒料在相同体积的匀浆缓冲液如使用具有在900转和自旋6冲程均化以12,000 xg离心20分钟之前。丢弃上清液。粒料P2代表粗膜部分。
  2. 从粗脑膜部分突触的纯化（图3A）
    注:粗脑膜部分可被分离成髓磷脂，利用蔗糖密度步骤梯度超速离心光的膜，突触体和线粒体。对于这种5毫米的Tris /盐酸pH值须含有蔗糖在任的0.32M，1.0M或1.2M的浓度8.1缓冲区。
    1. 在执行离心分离，以产生在P2级分，在超速离心管制备蔗糖步骤梯度。开始用2.5ml的1.0M蔗​​糖缓冲液和子层使用的玻璃巴斯德吸管1.5毫升1.2M的蔗糖缓冲液中。
    2. 再均匀P2馏分在梯度的顶部0.5毫升手动与6招0.32M蔗糖缓冲和负载。
    3. 在使用吊桶式转子超速离心机旋转在85000 xg离心2小时。
    4. 丢弃顶端0.32M蔗糖层包括在接口的1.0M蔗​​糖缓冲液（髓鞘，光的膜）的材料。在1.0 / 1.2蔗糖缓冲界面收集突触。在试管的底部沉淀包含线粒体。
    5. 添加0.32M蔗糖缓冲的突触体部分在1:1的比例，以150,000×g离心1小时，小心地和旋转混合。突触体是在沉淀中，现在可以重新悬浮在用于进一步处理所需的缓冲器。
  3. 一个PSD富集级分的制备（图3B）
    1. 从在100μl提取缓冲液的单个动物均质每个特定脑区域（5毫摩尔Tris /盐酸的pH 8.1，0.5％的Triton X-100）中带有PTFE（聚四氟乙烯）杵200微升超速离心管在2,000rpm与12杆。
    2. 加100μL提取缓冲液，混合和孵育在4℃1小时。降速在100,000 XG 1小时，用200微升吸管珍藏上清S1。
    3. 用PTFE杵在2000转每分钟与12杆再次重新均质颗粒P1在用100微升提取缓冲同一管。
    4. 将100μl提取缓冲液，并用吸管和旋转10万XG 1小时拌匀。
    5. 结合与S1上清液S2至可溶性蛋白质部分。这个级分含有胞质蛋白，0.5％的Triton X-100的可溶性膜蛋白和细胞外基质的分子。
    6. 重悬50微升5毫米的Tris /盐酸pH值8.1，其余颗粒。该馏分包含的PSD，耐洗涤剂的膜，不溶性细胞骨架元件，线粒体和细胞碎片，包括细胞核。它是在形成突触后结构的核心的PSD而且突触前的重要部分富集cytomatrix在有源区。对PSD的富集因子为约4和PSD组分的富集先前已经证明。 12

3.样品制备质谱

  1. 裂解和样品正常化
    注:关于蛋白质浓度样品正常化是一个非常关键的一步，最终实现可靠的定量数据，即使弱突触蛋白表达变化。
    1. 溶解突触体或在20的动物的每个脑区的PSD富集制剂 - 50微升（取决于材料的总量:用于与5听觉皮层 - 15 mg组织使用20微升）8M尿素的，并在冰上孵育1小时在超声波浴中。
      1. 在凝胶消化，直接在SDS样品缓冲液溶解突触。仔细计算装载量，以避免凝胶的过载。认为，在这种情况下，高丰度支架protei纳秒将凝胶电泳期间丢失和在凝胶消化。
    2. 配有可拆卸的洗涤剂的1％稀确保2M尿素的终浓度。避免任何温度高于30℃，以防止蛋白质氨甲酰。
    3. 按照标准程序13,14与等分试样进行SDS-PAGE（ 如 10微升）的样品。
    4. 染色使用根据制造商的协议考马斯蓝的凝胶。该过程结合了甲醇和乙酸的定影和染色步骤。
    5. 测定各样品用于与在传输模式校准的凝胶扫描仪的整个车道的光密度，并计算相对蛋白质含量。
    6. 根据这些计算归一化的样品。
    7. 分割每个样品分成两个不同的部分。使用的凝胶内消化三分之一，三分之二的在溶液中消化。
  2. 胶内消化
    1. 凝胶分离
      1. 执行利用浓度调整的样本的第二SDS-PAGE。染色和量化凝胶进行第二次检查正常化质量。
      2. 切出的样品的每个车道不同区域（8 /泳道）的凝胶中，但不包括在分子量范围以上170 kDa的。转移凝胶块放入单独的试管。
      3. 用锋利的解剖刀切小片的区域（约1×1毫米），以促进在凝胶内消化功效。
    2. 摘要15
      1. 洗凝胶片几次（取决于染色强度）为10分钟，50 - 150微升由50％乙腈（ACN）和50mM碳酸氢铵（NH 4 HCO 3）的缓冲液中。
      2. 除去上清液。覆盖凝胶片用ACN和在20℃孵育直至凝胶片成为白色和收缩。
      3. 取出ACN和补充水分的凝胶块5分用50μl的0.1M 的 NH 4 HCO 3的添加乙腈的相同体积，并且在37°C孵育另外15分钟。
      4. 取下并丢弃液体彻底。干燥，在真空离心机凝胶片。
      5. 再水合凝胶片在50μl的NH 4 HCO 3含有10mM二硫苏糖醇（DTT）和加热样品45分钟的56℃，以减少半胱氨酸残基。
      6. 除去上清液并在黑暗中加入50微升的NH 4 HCO 3含有55毫碘乙酰胺（IAA）进行30分钟至carbamidomethylate降低半胱氨酸。
      7. 卸下并丢弃凝胶片以上所有的液体，并用50微升的NH 4 HCO 3和ACN洗两次（1:1）10分钟，以除去任何残留的IAA。干燥的样品在真空离心机。
      8. 对于蛋白质的消化有限含有添加的胰蛋白酶12.5纳克/微升25毫米NH 4 HCO 3。所需的量取决于凝胶的p大小和数量ieces。孵育几分钟，检查缓冲液被吸收。添加更多的缓冲如果有必要，凝胶片应完全覆盖。孵育在37℃过夜（分钟12小时）。
    3. 肽提取
      1. 覆盖凝胶片与10 - 20微升的25mM NH 4 HCO 3，并添加乙腈相同体积。孵育使用超声波浴在冰上10分钟。随后捞出搜集含有大部分产生的肽的上清液。
      2. 加入100μl提取缓冲液含有30％ACN / 0.1％三氟乙酸（TFA）至凝胶片。重复孵化超声波浴中，仔细收集上清。
      3. 由ACN浓度提高至50％，重复上次提取步骤。超声波浴10分钟后降速并收集上清。
      4. 结合的提取步骤中的所有三个相应的上清液，并在真空离心机干燥。注意作为凝胶分离每个通道/样本的8个区域中此步骤被组合成一个样品再次的结果。
  3. 在溶液消化
    1. 消化
      1. 使用所计算的金额（ 例如 100微升150微升裂解物，取决于材料从一个特定脑区域所需的样品的重悬的量和体积）归一化的样品，以获得足够的原料为至少三个技术复制到执行无标记 - 质谱法。
      2. 加入2毫摩尔DTT在25毫米NH 4 HCO 3，然后振荡样品。减少的试样45分钟，在20℃。
      3. 添加10毫米至IAA的carbamidomethylate半胱氨酸残基。混合并在20℃在黑暗中孵育30分钟。
      4. 最后，添加1μl的胰蛋白酶原液（1微克/微升的胰蛋白酶在25mM的乙酸）中，在20°C孵育12小时。
    2. 固相萃取（SPE）-Purification
      1. 除去酸裂解洗涤剂，调节样品1％TFA的终浓度并在20℃孵育1小时。
      2. 样品离心16,000 XG 10分钟和珍藏上清。
      3. 放置SPE柱在一个机架和平衡用2毫升甲醇的矩阵。与水2毫升0.1N％的TFA（缓冲液B）洗涤两次。
      4. 加2ml的缓冲液B并加载样本。另一个洗三次。
      5. 通过加入200微升70％ACN / 0.1％TFA洗脱的肽。重复此步骤。
      6. 池都洗脱液和干下来，在真空离心机。
  4. 磷酸肽富集通过TiO 2的色谱16
    1. 溶解通过在50在凝胶或溶液消化在150微升的80％ACN / 2.5％TFA（缓冲液C）和平衡〜2毫克的二氧化钛珠粒产生的肽C.缓冲微升
    2. 在20℃添加珠子与样品孵育在一个旋转装置1小时。随后，旋珠落（16,000 XG，1分钟），并收集上清。
    3. 轻轻混合，5分钟后停转洗珠用100μl缓冲液C的3倍。收集上清。重复此步骤三次用100μl80％的ACN / 0.1％TFA，接着洗涤三次用100μl0.1％TFA（无ACN）的分别。
    4. 结合所有十个上清液，在真空离心机干燥，并处理它们作为根据步骤3.5进一步纯化磷酸肽贫化馏分。
    5. 从珠20微升400毫摩尔的NH 4 OH / 30％ACN的洗脱结合磷酸化的肽。重复此步骤三次停转珠后，收集所有上清液。
    6. 结合的凝胶内消化洗脱液和在溶液中的样品的消化的和处理它们作为磷酸-对eptide富集级分。干他们在真空离心机4的终体积 - 8微升。
  5. 浓缩并通过微SPE磷酸肽贫馏分脱盐
    1. 溶解干燥的肽在20微升的0.1％TFA。
    2. 通过绘制20微升到ACN尖平衡的固定的C 18 -矩阵。通过在水中拉伸-0.1％TFA到尖洗基质。重复该过程三次。
    3. 加载缓慢酸化样品放入头（重复此步骤三次）。
    4. 用20微升洗-C 18 -矩阵三次0.1％TFA的水，并丢弃洗涤液。
    5. 通过重复（3次）拉伸20微升70％的ACN / 0.1％TFA洗脱从枪头肽，并收集在一个单独的管这种洗提溶液。
    6. 结合的样品的洗脱液，并在真空离心机干燥。

4.蛋白质组分析

<上配备有一个超高效液相色谱的混合双压线性离子阱/轨道阱质谱仪上进行蛋白质组分析:对>注。 HPLC的是用20微升注射环构成的冷却自动进样器，二进制样泵（微升流量范围），一个二进制纳米流分离泵，柱加热器具有两个微开关阀和脱气。样品在7μl/ min的流速接着在以250升/ min的柱（ 例如 ，75微米×25厘米）的分离首先经受捕获柱（ 例如 100微米×2厘米）。分离柱出口直接联接到质谱仪的电离源定位在纳米喷雾界面的涂布微微发射极尖端。

  1. 纳米液相色谱和串联质谱
    1. 溶解在12μl的2％ACN / 0.1％TFA的肽样品至少30分钟。降速，15秒，11转微升上清自动进样瓶（圆锥形，减少diameter）的。
    2. 设立示例应用程序，色谱分离和串联质谱的自动机制在如下控制软件（ 例如，的Xcalibur）。
      1. 请使用以下的温度自动进样器:5℃;柱烘箱:45℃。
      2. 使用以下注射体积:10微升;流速:7μl/ min的（2％乙腈，0.1％TFA）;时间:8分钟;阀门设置:捕获柱 - 浪费;质谱采集:关闭。
      3. 请使用以下的分离:流量:250升/分钟阀门设置:捕获柱分离柱;质谱收购:对。
        0分钟 - 100分钟:2％ACN，0.1％甲酸 - 40％ACN，0.1％甲酸
        100分钟 - 105分钟:40％ACN，0.1％甲酸 - 95％ACN，0.1％甲酸
        105分钟 - 109分钟:95％ACN，0.1％甲酸
        109分钟 - 120分钟:2％ACN，0.1％甲酸
      4. 请使用以下的质谱设置:全MS:FTMS;分辨率60,000， m / z范围400 - 2000;女士/MS:线性Iontrap;最小信号阈值500;隔离宽2大;动态排除时间设定30秒;单电荷离子被排除在选择;标准化碰撞能量被设置为35％，且活化时间为10毫秒。
        注:完整的MS扫描之后是使用最丰富检测肽离子的碰撞诱导解离（CID）运行由多达15个的LTQ的MS / MS。
    3. 运行所有样品的三个技术重复。
  2. 蛋白质鉴定和标签免费定量
    1. 对利用商业软件套件（ 如 PEAKS工作室）的蛋白质鉴定和无标签的量化过程质谱原始数据。相比之下大多数其他蛋白质组软件包这个特定软件使用从头 -sequencing算法之前蛋白质数据库比对。然而，这一步很容易被其他流行的软件程序包取代。
    2. 使用ESS表2中列出，差分设置。
  3. 磷酸化蛋白质组学
    注:高效，可靠的磷酸肽收购需要蛋白质组的工作流程设置的一些基本的变化。
    1. 磷酸肽富集后，从来没有干样完全。始终保持溶解样品。
      注:磷酸化苏氨酸或丝氨酸的磷酸酯键是非常脆弱的。在离子阱这导致磷酸盐的中性损失内碰撞诱导分裂。这防止了肽，而这又需要鉴定的任何进一步的碎片。允许宽带活化在质谱设置允许磷酸肽的碎裂即使在磷酸基团的中性损失。它执行一个节省时间的"伪MS 3"。在MS / MS数据磷酸部位确定需要一个特定的验证和评价，并且可以通过磷光体3来进行。0。

5.生物信息学 - Meta分析

注意:在执行功能注释和网络分析前，蛋白质名单必须进行预处理。首先分别合并调节蛋白和磷酸肽的列表对于每个大脑区域。然后删除所有重复的UniProt-ID的每个部分，以防止误解。

  1. 与GeneCodis 17奇异富集分析
    1. 打开GeneCodis的基于Web的工具（http://genecodis.cnb.csic.es）
    2. 选择"小家鼠"作为有机体和"GO生物过程"的注释。
    3. 粘贴一定分数的UniProt-ID的列表。提交并等待进行分析。点击"GO生物过程奇异富集分析"，并查看结果。
    4. 重复步骤5.1.3其他三个级分。
    5. 要查看结果列表之间的重复和交叉点使用脚本语言如Perl或Python来筛选所需的数据。一个奇异的富集分析类似工具DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）和Cytoscape中（http://www.cytoscape.org/）与插件BINGO（http://apps.cytoscape.org/应用程序/宾果）和ClueGO（http://apps.cytoscape.org/apps/cluego）。
  2. 生成与Gephi力基于图形出GeneCodis数据（https://gephi.org/）
    注意:图表的数据具有由用户提供，或者在（.gexf，.graphml，.DOT，.gv，.gml），或通过手动输入的曲线图的格式。
    1. 产生图节点
      1. 手:打开Gephi并单击"数据实验室"。创建节点。点击"节点"在左边切换到"节点"表。点击"添加节点"。输入项名称。点击"确定"/按Enter键。
      2. 备选:保存GeneCodis结果PC。打开一个电子表格程序中的.txt。删除所有行EXCEPT从"Item_Details"（项名称）。更改标题"Item_Details"到"标签"。电子表格另存为名为".csv"。现在Gephi，点击"导入电子表格"。选择Gephi的文件浏览器电子表格。点击下一步"。点击"完成"。
    2. 通过边连接的节点。
      1. 点击左边的"边缘"，切换到"边缘"表。对于每一个节点（期限）:看在其他条款基因名称。如果一个或多个基因被共享 - >创建边缘。
      2. 点击"添加边"。选择"无向"。选择源进出下拉列表的目标节点。点击"确定"/按Enter键。如果一个以上的基因是共同的，在"重量"（表）进入丰度。
    3. 基于力图形布局。
      1. 开放式图形数据文件，手动输入设置图形类型为"无向"或使用的数据，点击"概述"如果不是已经selecteð。
      2. 视丰互连调整的节点。点击统计，在"网络概述"跑不是"平均程度"（未加权的边缘），或"平均加权度"（加权边缘）。在"外观"，点击"节点"，然后在大小按钮，接下来选择"属性"，并设置属性参数设置为"平均加权度"或"平均程度"。单击应用。
      3. 最后:选择"强制地图集"中的"布局"，并运行;如果节点碰撞变"排斥力量"。
    4. 导出为图片。
      1. 截图功能:点击"概述"，改变图形布局，边缘厚度，标签尺寸并在"图形"窗口底部的菜单进行缩放。点击相机左键，并保存图像。
      2. "预览"的导出功能:单击"预览"。更改预设为"默认直"。更改设置由于按所选择的喜好，然后点击"SVG / PDF / PNG"出口。

结果

图1总结了听觉辨别学习后，小鼠的大脑区域的定量蛋白质组突触分析的完整工作流程。它开始在梭箱动物训练。在图2所示的例子中，小鼠开始表现出在第4 次训练显著FM音源歧视，指示有效的学习。动物在脑区域解剖选定的时间点处死。突触的需要富集可以通过突触的制备来实现或者通过一个PSD富集级分的制备，无论在细节在图3中描述的PSD-富集方法已为低组织量的发展， 例如，1 -从大鼠脑12，18 2海马。它需要的小管，聚四氟乙烯杵拟合这些管，并为杵供电实验室钻车程。

由于突触的特定蛋白质组合物，强烈建议在两个不同的但互补的方式执行的样品制备。的PSD的支架往往是高的化学计量存在的非常高的分子量的蛋白质。在溶液摘要是有效地提取他们，但可能会导致所产生的肽混合物的过采样的最佳方法。中凝胶消化并联同一样品进行可以排除这些高分子量蛋白质和有利于具有中等和低分子量的蛋白质的分析。对于一个全面的分析建议这两种类型的蛋白酶消化的。

的不同量的调查了脑区的组织中的所需要的施加材料的更好的比较的调整。内的四个研究脑区听觉皮层通常是限制事实要么。所有其他脑区的材料应仔细制备突触体或PSD富集级分后进行调整，以听觉皮层的量（见3.1.1）。从小鼠新鲜制备的脑区的典型权重如下:听觉皮质（AC）:〜50毫克;海马（HIP）:〜90毫克;纹状体（STR）:〜120毫克和额叶皮质（FC）:〜100毫克。

在2.3节中所描述的PSD-富集法允许的约1500种不同的蛋白质和每个脑区的约250个不同的磷酸化的肽上的单个动物（ 表1）的水平的鉴定。蛋白质组分析的第一次训练后24小时，发现该鉴定的蛋白质的7.3％和磷酸化肽的5.8％，表现出显著（P <0.05）相比天真对照（ 表1）中其突触表达量的变化。对于下一个边条显眼的趋势突触支架的化可以在FMTD学习的早期阶段指向突触结构的明显重排。绝大多数调节蛋白在大脑特定区域的方式被改变，而只有22％的被发现在两个或更多个脑区，以进行调节。六选择的实施例示于图4。

通过IPA复杂结果的Meta分析提供了证据以下规范途径的具体参与/操控:"网格蛋白介导的内吞信号"，"轴突指导信号"，"钙信号"，"RhoA的信号"，"Notch信号"，"上皮粘着结的重塑"，"谷氨酸受体信号"，"GABA受体信号"，"多巴胺受体信号"和"突触长时程增强"。

单富集分析揭示了在额叶皮质有关蛋白质运输，细胞粘附，磷酸化，内吞作用，囊泡介导的转运，前脑发展和axonogenesis（ 图5）显著任职人数过多的生物过程。在听觉皮层的生物过程，包括离子传输，翻译，表达运输，蛋白转运和学习是引人注目。海马的蛋白质级分的分析显著检测与离子迁移，细胞周期，翻译，磷酸化和神经系统发育富集过程。在纹状体，人数过多生物学过程，包括mRNA的转运，囊泡介导的运输，axonogenesis，蛋白水解，蛋白质运输和内吞作用被发现了。

figure-results-1794
图1: 系统WorkfloW上的方法论途径。这个数字示意图总结脑区特异性的突触蛋白质组成的高分辨率定量分析的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2158
图2: 在FM音辨别任务小鼠性能的例子。动物显示命中的速度越来越快（蓝色曲线），并在培训课程的过程中误报的下降率（黑线）。显著歧视，第四届会议发生。误差棒被提供作为扫描电镜。 请点击这里查看LARGER版本这个数字。

figure-results-2555
图 3: 突触和PSD的富集级分的制备。 答:突触准备。 A:PSD富集级分的准备。这两个数字说明准备从脑组织突触体或替代PSD富集分数的详细工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2987
图4: 选择 的 定量蛋白质组学结果。选择蛋白的相对突触丰度的小鼠TRA之间比较独立非执行董事对FMTD任务（AV，N = 6）和天真的对照组（NV中，n = 6），24小时后的第一堂训练课。的丰度值计算成的蛋白质的三个最激烈的肽的峰面积的值。与显著丰度的变化（AV / NV，t检验）的蛋白质标记的曲线内:* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.005。误差棒被提供作为SD。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3525
图 5: 由GeneCodis / Gephi额叶生物学途径的可视化。不仅关系到"生物过程"三个最低蛋白质数量的基因本体论（GO）数据库（http://geneontology.org）的显著条款此处显示。节点表示的GO术语，节点的大小，有一定的节点的连接的线宽度和数量描绘的蛋白质，其中共享此与其他节点GO术语的数目。由于Gephi的"强制地图集"的方法，相关节点正在紧密集群。 请点击此处查看该图的放大版本。

大脑区域 AC FC HIP 000"FACE ="宋体"大小="3"> STR Σ
鉴定的蛋白质 1435 1758 1572 1507 6272
调节的蛋白质（P <0.05） 59 130 162 108 FACE ="宋体"大小="3"> 459
↑AV / NV 8 4 76 35 123
↓AV / NV 51 126 86 73 336
确定phosphomoti FS 197 361 273 278 1109
监管phosphomotifs（P <0.05） 8 22 21 14 65
↑AV / NV 4 00000"FACE ="宋体"大小="3"> 17 五 9 35
↓AV / NV 4 五 16 五 三十

表1:蛋白质组学结果的总结。下表总结中训练的小鼠的代表蛋白质组学实验（AV，N = 6）相比，他们的天真控制第一堂训练课后24小时（NV中，n = 6）。该459调节蛋白的总和，包括重叠的规定。 283不同的规定，确定脑具体。详细地说，57蛋白在两个脑区调节，在三个脑区域中检测到18蛋白法规和仅2蛋白在所有四个研究脑区调控。

误差容限
前体的质量（傅立叶变换质谱法） 10ppm的
碎片离子质量（线性离子阱） 0.6大
每个肽最大遗漏分裂 3
固定修改
在凝胶消化的样品半胱氨酸Carbamidomethylation
对于在溶液中消化的样品 Methylthiolatio半胱氨酸的n个
变量修改 蛋氨酸氧化
天冬酰胺和/或谷氨酰胺Deamidations
数据库 UNIPROT / Sprot
分类老鼠
统计鉴定验收设置
从头当地平均信心（ALC） > 50％
肽假发现率（FDR，基于EST，诱骗融合） <1％
蛋白意义（-10logP，基于改性T-检验） > 20
独特的多肽/蛋白质 ≥1
量化设置:
用于定量如果肽:
肽意义（-10logP） > 30
肽鉴定样品≥50％
肽信号质量 > 1
肽平均面积 > 1E5
多肽保留时间公差 <5分钟
正常化由总离子电流（TIC）

表2:蛋白质鉴定的设置（步骤4.2.2）。

讨论

这项研究提出了学习和小鼠不同脑区记忆的巩固过程中的突触蛋白表达变化的准确的定量分析进行优化的方法流程。该装置提供了学习的机会，在一个动物的水平蛋白的表达，尽管每个样品至少有三个技术重复进行质谱分析所需的应用程序的。

该方法考虑到前和postsynapse选自高分子量支架蛋白的特定的蛋白质组合物也是重要的介体蛋白承载介质或更低的分子量。突触制剂的在溶液消化导致有效地产生，因此，支架衍生肽的过表达。这，反过来，可能抑制较小或低丰度蛋白的分析。从SDS-PAGE馏分的建议制备每个样品与平行的在凝胶内消化过程合并的等分试样促进中，低丰度蛋白质的分析和表示高度推荐的互补方法。后从样品衍生的所有级分的分离质谱应用（ 例如 ，在溶液消化，凝胶内消化，结合磷富集馏分）可以结合在相应的MS / MS数据集，并进一步用于蛋白质鉴定和量化由PEAKS计算软件或替代流行的软件包。

可替代地，在溶液中消化的样品的产生的样品的凝胶内消化衍生馏分（样品泳道分开处理的凝胶区域）和级分的个人应用（通过离子交换色谱，例如 ），以质谱可以增加分析深度。然而，这种延长的工作流显着地增加对于LS-MS / MS数据采集所需的时间。对于generatio学习和记忆形成的蛋白质组分析的指定时间期间的突触蛋白的重排的详细分子序列的n个是必需的。这个时候当然会，直到动物的性能达到学习曲线的渐近水平约后后甚至第一堂训练课中立即启动，涵盖了近网状的时间框架。 8 - 10天的培训（ 见图2细节）。

突触蛋白的磷酸化的变化分析需要FMTD学习过程中特别注重所选择的时间框架。在启动已知由蛋白质磷酸化dephosphorylations触发突触蛋白重组，一方面信号通路有望在动物训练的早期阶段。另一方面，也有其调节S内的连接和装配已知多种磷酸突触蛋白的长期持久的修改ynaptic结构19,20。这些翻译后修饰甚至在记忆巩固稍后的时间点的预期。

该蛋白质组的工作流程产生的复杂的数据集需要处理生物信息学，以确定参与的分子途径和关键分子。荟萃分析显示显著任职人数过多的途径，从而起到在学习和记忆过程中发挥作用。

披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M Empore Solid Phase Extraction- Filter3M Bioanalytical Technologies4245SD7 mm/3 ml
Acclaim PepMap 100Dionex/Thermo Scientific164564100 µm x 2 cm, C18
Acclaim PepMap 100Dionex/Thermo Scientific16456975 µm x 25 cm, C18
Acetic acidCarl Roth GmbH3738.1
Acetonitrile (ACN)Carl Roth GmbHAE70.2
Acrylamide (30%)AppliChemA0951
Ammonium hydrogen carbonate  Fluka9830
Ammonium hydroxide Fluka 44273
Ammonium persulfate  (APS)AppliChemA2941
Biofuge picoHeraeus GmbH75003280
Blue R-250 SERVA Electrophoresis GmbH17525
Bromophenol BluePharmacia Biotech17132901
C57BL/6J miceCharles River 
CantharidinCarl Roth GmbH3322.1
Centrifuge tubes for MLS-50Beckman Coulter344057
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotorBeckman Coulter343776
Dithiothreitol (DTT)AppliChemA1101
Eppendorf 5417R centrifugeVWR22636138
Eppendorf A-8-11 rotorVWR5407000317
Formic acidFluka14265
GeneCodishttp://genecodis.cnb.csic.es/
Gephihttps://gephi.org/
GlycerolAppliChemA1123
GlycineAppliChemA1067
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail Pierce /Thermo Scientific78420
HEPES Buffer solution PAA Laboratories GmbHS11-001
Homogenization vessel 2 mlSartorius AG854 2252
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Ingenuity Pathway AnalysisQiagen
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI1149
Laboratory drilling drive  K-ControlTLC 4957                    Kaltenbach & Vogt GmbH182997
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2Thermo Scientific
LTQ Orbitrap Velos ProThermo Scientific
Macs-mix tube rotatorMiltenyi Biotech130-090-753
Magic Scan 4.71UMAX
MethanolCarl Roth GmbHAE71.2
MLS-50 rotorBeckman Coulter367280
Optima MAX UltracentrifugeBeckman Coulter364300
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Scientific26616
PEAKS 7.5Bioinformatic Solutions 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma-AldrichP0044
PhosphoRS 3.1IMP/IMBA/GMI
PhosSTOPRoche4906845001
Plunger/pestle made of PTFESartorius AG854 2651
PotterS homogenizerSartorius AG853 3024
Protease Inhibitor complete miniRoche4693159001
Quantity One 4.5.1BioRad
RapiGestWaters186002122
Shuttle boxCoulbourne Instruments
Sodium dodecylsulfate (SDS)AppliChemA1112
Sodium molybdateCarl Roth GmbH274.2
Sodium tartrate dihydrateSigma-Aldrich228729
SONOREX RK 156 Ultrasonic BathBANDELIN electronic GmbH & Co. KG305
Soundproof chamberIndustrial Acoustics Company
SucroseCarl Roth GmbH4621.2
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Thermomixer basicCallMedia111000
Titansphere TiO 5µmGL Sciences Inc. Japan502075000
TLA 100.1 rotorBeckman Coulter343840
Trifluoro acetic acid  (TFA)Sigma-AldrichT6508
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)AppliChemA1086
Triton X-100Sigma-AldrichT8532
Trypsin GoldPromegaV5280
Ultimate 3000 Ultra HPLC Dionex/Thermo Scientific
Ultracentrifuge tubeBeckman Coulter343776
Unijet II Refrigerated AspiratorUniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
UreaAppliChemA1049
Water (high quality purifed)Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C  Pyrogens: < 0.02 EU/ml                TOC: < 10 ppb
Xcalibur 3.0.63Thermo Scientific
ZipTipC18 Pipette TipsMILLIPOREZTC18S960

参考文献

  1. Lamprecht, R., LeDoux, J. Structural plasticity and memory. Nat Rev Neurosci. 5 (1), 45-54 (2004).
  2. Bingol, B., Schuman, E. M. Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system. Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).
  3. Richter, J. D., Klann, E. Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation. Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).
  4. Rosenberg, T., et al. The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation. Front Mol Neurosci. 7, 86(2014).
  5. Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).
  6. Kähne, T., et al. Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning. Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).
  7. Reichenbach, N., et al. Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain. Proteome Sci. 13, 13(2015).
  8. Kähne, T., et al. Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain. J Neurochem. , (2016).
  9. Li, K., et al. Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins. J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).
  10. Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).
  11. Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).
  12. Smalla, K. H., et al. The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).
  13. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  15. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
  16. Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment. J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).
  17. Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists. Genome Biol. 8 (1), 3(2007).
  18. Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing. Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).
  19. Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).
  20. Li, L., et al. The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze. Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。