生物素化细胞表面蛋白的纯化<emRigicephalus microplus</em&gt;上皮细胞

摘要

一种基于梯度改性密度离心方法被利用来上皮细胞从扇头蜱microplus肠组织隔离。生物素化表面结合蛋白，并通过链霉抗生物素蛋白磁珠纯化，用于下游应用。

摘要

Rhipicephalus microplus - 牛蜱 - 是对家畜作为几种病原体的载体的经济影响方面最重要的外寄生物。致力于牛蜱控制以减少其有害影响，重点是发现位于蜱肠上皮细胞表面的疫苗候选物质，例如BM86。目前的研究重点是利用cDNA和基因组文库筛选其他候选疫苗。蜱肠细胞的分离是调查蜱肠细胞膜上表面蛋白质组成的重要优势。本文构建了一种用于分离上皮细胞的新颖可行的方法，从半加入的微量元素的蜱肠内含量。该方案利用TCEP和EDTA从上皮支持组织和不连续密度离心分离器中释放上皮细胞以将上皮细胞与其他细胞类型分开。细胞表面蛋白质生物素化并从蜱肠上皮细胞中分离，使用链霉抗生物素蛋白连接的磁珠，允许在FACS或LC-MS / MS分析中的下游应用。

引言

扇头蜱microplus，牛蜱，是在对养牛业热带和亚热带地区，因为它矢量牛蜱传热（巴贝虫病），微粒孢子虫病和马焦虫病^{1，2，3，4}经济影响方面最显著外寄生物。努力致力于牛蜱控制，减少有害影响，然而常规方法如使用化学杀螨剂具有隐含的缺点，例如在牛奶和肉中存在化学残留物，以及化学抗性蜱的流行率增加^5，6，7。因此，研究了替代蜱控制方法的开发，例如使用天然抗性牛，生物防治（生物杀虫剂）和疫苗分级表^{4，5，6，7，8，9。}

在追求能够被用作候选疫苗的蛋白质时，目前的研究集中在滴滴肠上。中肠壁由沉积在薄基底层上的单层上皮细胞构成，基底层的外侧形成肌肉网络。光和电子显微镜观察表明，中肠由三种类型的细胞组成:储备（未分化），分泌和消化。细胞类型的数量根据生理期有很大差异。分泌和消化细胞都从储备细胞^18，19，20发起。

cDNA文库的构建检查蜱肠道的组合物导致了抗原性蛋白质，如Bm86进行的鉴定，作为可能的候选疫苗^2，3，4。糖蛋白Bm86位于蜱肠细胞的表面，并在接种疫苗的牛中诱导针对牛蜱（ R. microplus ）的保护性免疫应答。被免疫的宿主产生的抗Bm86IgG被蜱摄入，在蜱肠细胞的表面上识别该抗原，随后扰乱了肠道组织的功能和完整性。基于Bm86抗原的疫苗通过减少雌性哺乳动物的数量，重量和繁殖能力，显示了R. microplus和Rhipicephalus annulatus的有效控制，从而导致后续蜱代⁴发生减少的幼虫侵袭。然而，基于Bm86的疫苗对于所有的蜱细胞阶段都没有效果表现出对R. microplus的一些地理株不能令人满意的功效，因此在肉牛和奶牛行业都很差采用这些疫苗^2,4。

从蜱肠分离上皮细胞的能力是一个重要的创新，这将使研究的进展能够确定不同环境条件下的蛋白质膜组成，包括形态学和生理学。本文所述的方法利用螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）和还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP）从其上皮支持组织¹⁰释放上皮。通过振荡机械破坏组织，然后在Percoll中进行不连续梯度离心，回收上皮细胞。本文介绍了一种可行和新颖的用于分离蜱肠道外切的技术血细胞。随后在下游应用如FACS和/或LC-MS / MS分析中分析从这些上皮细胞表面分离的生物素化的细胞表面蛋白质。

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研究方案

1.从R. microplus肠上皮的解剖

1. 在实验当天从牛收集半加成蜱。从主机取出后24小时内解剖。
2. 在92 mm x 16 mm培养皿的底部附上一条胶带。在胶带上加一滴超级胶水。将蜱，腹侧放在超级胶上，让其干燥2分钟。
3. 将100 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）倒入培养皿中，或直到蜱被完全浸没。
4. 使用大小11的手术刀，从眼睛的顶部切割到底部的festoons，在刻度的两边。
5. 使用无菌镊子，彻底清除盾板和alloscutum，并暴露出内部器官。
6. 去除细白色线状器官（气管）和其他膜，以防止污染。
7. 使用镊子去除肠道，通过捏住上部区域并从中拉出尸体。去除任何剩余的肠道组织，确保没有其他组织被解剖。
8. 在没有氯化钙和硫酸镁和蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的情况下将肠子储存在冰冷的汉克平衡盐溶液（HBSS）中。将干冰中的胆固醇冻结并储存在-20°C。
   注意:为了帮助肠道解剖和蜱内脏的详情，请参阅D·索尼希恩^，19"蜱的生物学"第3.1章。

上皮细胞分离

1. 将解剖的肠倒入50mL管内的70μm细胞过滤器上。
2. 用PIC用50 mL冰冷的HBSS冲洗肠道组织，直到溶液清澈透明，胆汁呈现白色/透明的外观。
3. 用PIC重新悬挂30 mL冰冷HBSS中的胆固醇，轻轻混匀，并在4℃下以500 xg离心10分钟，以使肠内沉淀。取出上清液，重复洗涤3次。
4. 通过250μm的细胞过滤器过滤悬浮液，涡流流过并通过70μm的细胞过滤器过滤，收集剩余的流通。
5. 将悬浮液在4℃下以500xg离心20分钟以沉淀单个细胞。

3.使用密度离心梯度分离单个上皮细胞

1. 通过AP15预滤纸过滤，制备密度离心梯度（ 例如 Percoll）。在mqH ₂ 0（v / v）中制备40％和20％Percoll并在4℃下冷却1小时，然后分层梯度。
2. 使用蠕动泵以最低速度设定，将3mL 40％密度离心梯度分离成16mL超速离心管，使其在冰上沉降15分钟。泵的速度应导致每分钟流量<1 mL。
3. 将管倾斜成45°角，使用蠕动泵将40％层上的20％密度离心梯度层压。泵的速度应导致每分钟流量<1 mL。允许层在冰上沉降15分钟。
4. 在20-40％密度离心梯度下，使用蠕动泵以<1 mL / min流速将3 mL含有蜱肠细胞的DMEM培养基。
5. 对离心机进行编程，以实现最大加速和最小减速度以600 xg离心10分钟。收集DMEM之间的间期:20％密度离心梯度和20％:40％密度离心梯度以分离上皮细胞。在4°C储存收集的间期进行后续分析。

4.细胞分离评估

1. 血球
   1. 用酒精清洁血球计数器滑块。
   2. 通过轻轻地上下移动细胞来重悬细胞。移取100μL细胞悬液，置于1.5 mL微量离心管中。
   3. 加入400μL0.4％台盼蓝。轻轻的轻轻混合管子。
   4. 移取100μL台盼蓝处理的细胞悬浮液，以缓慢填充血细胞计数器的两个腔室。
   5. 将血细胞计数器置于光学显微镜下，用10X物镜聚焦于血细胞计数器的网格线上。
   6. 使用手持计数器，计数一组16个正方形内的活体未染色细胞。在同一个广场内，计数蓝色死亡细胞。继续计数，直到计数了四组16个正方形。
   7. 使用以下公式计算每毫升的总细胞数:
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   8. 使用以下公式计算细胞存活率:
      
2. 细胞分离可视化
   1. 在1.5 mL微量离心管中稀释9μLHBSS中的1μL分离细胞。轻轻地将微量离心管轻轻混匀。
   2. 将5μLHBSS中的分离细胞移至玻片的中间。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）涂三滴安装介质。
   3. 在室温下孵育载玻片5分钟。小心地将盖子放在准备物上，避免气泡。
   4. 在荧光显微镜下观察360nm激发下用DAPI染色的细胞并在460nm发射。

细胞表面蛋白生物素化

1. 生物素生物素使用生物素（A型）缀合物100μL单细胞上皮细胞试剂盒，按照制造商的说明书，以1:1的表面蛋白与缀合物的摩尔比
2. 对于细胞裂解，向生物素化细胞中加入100μLPBS，1％Triton X-100,10％甘油，100μM氧化型谷胱甘肽和PIC。在冰上孵育1小时，每10分钟轻轻混匀。
3. 将生物素化细胞在4℃下以20,000×g离心20分钟以沉淀不溶物质。收集含有细胞质和生物素化膜蛋白的上清液。
4. 使用Bradford测定法确定蛋白质浓度。

6.生物素化表面蛋白的分离

1. 将50μL的链霉亲和素磁珠加入1.5 mL微量离心管中。
2. 将管放置在磁性支架中，将珠子收集在管的侧面。取出并弃去上清液。
3. 向管中加入1000μLTBS，0.1％Tween-20。轻轻混合，用磁力柱收集珠子天。取出并弃去上清液。
4. 将40μg生物素化的细胞表面蛋白结合，用洗涤的磁珠稀释至1×PBS中的300μL。在室温下搅拌孵育2小时。
5. 用磁力支架收集珠子，取出并弃去上清液。
6. 加入300μLTBS，0.1％Tween-20到管中，轻轻搅拌，重新悬浮珠。收集珠子，取出并弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。
7. 加入100μL0.1M甘氨酸pH2.0给磁珠，并在室温下孵育5分钟。收集珠子并除去含有洗脱的生物素化表面蛋白质的上清液。
8. 在4-20％Tris-MOPS SDS-PAGE凝胶上观察分离的表面蛋白质。

7.生物素化表面蛋白的评估

1. 点斑
   1. 切成7厘米×3厘米的硝酸纤维素膜条。
   2. 应用10μg总滴答t含量（从1.8以上）和10微克生物素化表面蛋白到膜。在室温下干燥15分钟。
   3. 转移到容器中并浸没在100mL的封闭缓冲液中。在室温下孵育一小时。丢弃阻塞缓冲区。
   4. 在100μLPBS，0.05％Tween-20中将硝酸纤维素膜洗涤5分钟，同时搅拌。丢弃洗涤缓冲液并重复洗涤三次。
   5. 在100μLPBS，0.05％Tween-20中的1/5000链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶（HRP）中孵育2小时，并在室温下搅拌，并丢弃任何剩余的溶液。
   6. 在100μLPBS，0.05％Tween-20中搅拌洗涤硝酸纤维素膜5分钟。丢弃洗涤缓冲液并重复洗涤三次。
   7. 为了检测，将1片4-氯-1-萘酚溶于10mL冰冷的甲醇中。加入4 mL甲醇原液至20 mL TBS。加入10μL新鲜的30％过氧化氢和immedia适用于硝酸纤维素膜。
   8. 在室温下搅拌孵育直到底物产生不溶性蓝色终产物。这可能需要2-15分钟。
   9. 丢弃检测溶液，并在100μLmqH ₂ O中洗涤三次。
2. ELISA测定
   1. 用400μL100mM碳酸盐涂层缓冲液和ELISA板的第一排（A＃）涂层2泳道（平底孔）稀释每个样品200ng，
   2. 将100μL100mM碳酸盐涂层缓冲液加入到行（BH）中的所有其它相应的孔中。
   3. 通过从A排中的每个孔中移取100μL，并将其转移到B列，准备每个样品的连续稀释液。通过移液轻轻混合，避免产生气泡。每行重复稀释，弃去最后100μL，从排H中的每个孔。
   4. 用石蜡膜覆盖板，并在4℃下孵育过夜。
   5. 洗平台e，200μLPBS，0.05％Tween-20 /孔三次。
   6. 向涂覆的孔中加入200μL封闭缓冲液，用Parafilm覆盖，并在4℃下孵育过夜。
   7. 在封闭缓冲液中稀释1 / 15,000链霉亲和素-HRP，并向板的每个孔中加入100μL。用石蜡膜覆盖，并在4℃下孵育过夜。
   8. 在200μLPBS，0.05％Tween-20 /孔中洗涤板5次。
   9. 要检测，每孔加入100μLTMB试剂。经过充分的显色，通常在10-15分钟之间，加入100μL的1M磷酸停止反应。
   10. 读取λ= 450nm处各孔的吸光度。

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结果

根据图1所示的原理图，从R. microplus的肠组织中分离上皮细胞。 使用该方案制备的蜱肠上皮细胞的代表性荧光显微镜图像显示在图2A中 和2B。 由于细胞分离是在半富集的R. microplus上进行的，细胞在整个样品中表现为单数，球形，光滑的表面...

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讨论

牛蜱侵染构成了养牛业在世界的热带和亚热带地区的一个主要问题，与控制时使用杀螨剂^1，4依赖的最常用的方法。 Bm86进行先前蜱肠上皮表面作为对抗R. microplus侵染¹⁰保护性抗原，以有限的成功作为疫苗策略内识别由于Bm86进行地理序列变异和定期升压⁴的要求。

以前的出版物聚焦在上皮隔?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ice cold for protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol for molecular biology >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100